(高清版)GBT 13093-2023 飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定2023-08-06發(fā)布國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替GB/T13093—2006《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》,與GB/T13093—2006相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：a)更改了適用范圍(見(jiàn)第1章，2006年版的第1章);b)更改了原理(見(jiàn)第4章，2006年版的第4章);c)更改了培養(yǎng)基(見(jiàn)5.7,2006年版的第6章);d)刪除了試樣的制備(見(jiàn)2006年版的第7章)e)增加了樣品(見(jiàn)第7章);f)刪除了測(cè)定程序(見(jiàn)2006年版的第8章);g)增加了空白試驗(yàn)(見(jiàn)8.1.2.3);h)更改了培養(yǎng)條件(見(jiàn)8.2,2006年版的9.1.5);i)更改了菌落計(jì)數(shù)(見(jiàn)8.3,2006年版的9.2);j)更改了試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理(見(jiàn)第9章，2006年版的9.3)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——1986年首次發(fā)布為GB/T13093—1986,1991年第一次修訂，2006年第二次修訂；——本次為第三次修訂。1飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定1范圍本文件描述了檢測(cè)飼料中細(xì)菌總數(shù)的平板計(jì)數(shù)法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料和動(dòng)植物源性飼料原料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。細(xì)菌總數(shù)bacterialcount飼料試樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下(如用特定的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等)培養(yǎng)后，所得每克或每毫升試樣中菌落的數(shù)量。注：菌落的數(shù)量以菌落形成單位(colonyformingunit,CFU)表示。4原理將飼料待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)處理和稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞；統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出飼料中的菌數(shù)。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純的試劑。5.2氫氧化鈉溶液(1mol/L):稱(chēng)取20g氫氧化鈉，溶于水，冷卻至室溫后，用水定容至500mL。5.3鹽酸溶液(1mol/L):量取42mL的濃鹽酸，用水稀釋至500mL,搖勻。5.4磷酸鹽緩沖儲(chǔ)備液：稱(chēng)取34.0g磷酸二氫鉀溶解于500mL水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2后，用水稀釋至1000mL,混勻，2℃~8℃存放。5.5無(wú)菌磷酸鹽緩沖液：取磷酸鹽緩沖儲(chǔ)備液(5.4)1.25mL,用水稀釋至1000mL,分裝適宜容器或每管9mL,121℃高壓滅菌15min。25.6無(wú)菌生理鹽水：稱(chēng)取氯化鈉8.5g,用水溶解并定容至1000mL,分裝適宜容器或每管9mL,121℃高壓滅菌15min。5.7平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：按照附錄A制備。5.8無(wú)菌液體石蠟：取液體石蠟，121℃高壓滅菌20min。5.9無(wú)菌吐溫80:取吐溫80,121℃高壓滅菌20min。6儀器設(shè)備6.1恒溫培養(yǎng)箱：控溫精度±1℃。6.2拍打式均質(zhì)器。6.3恒溫裝置：控溫精度±2℃。6.4高壓滅菌器。6.5天平：感量0.1g和0.01g。6.6pH計(jì)或精密pH試紙。6.7無(wú)菌均質(zhì)杯或無(wú)菌均質(zhì)袋。6.8無(wú)菌移液管或微量移液器及吸頭：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。6.9無(wú)菌試管。6.10無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。7樣品按照GB/T20195進(jìn)行樣品制備，磨碎，過(guò)0.45mm孔徑篩。樣品應(yīng)盡快檢驗(yàn)。8試驗(yàn)步驟8.1試樣溶液的制備和稀釋8.1.1試樣溶液的制備8.1.1.1普通試樣：以無(wú)菌操作稱(chēng)取25g(mL)試樣，放于含有225mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液或無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍打式均質(zhì)器拍打1min～2min,制成1:10的試樣勻液。8.1.1.2油脂類(lèi)試樣：以無(wú)菌操作稱(chēng)取25g(mL)試樣，先加12.5mL無(wú)菌液體石蠟混勻，再加25mL無(wú)菌的吐溫80,在40℃~44℃水浴中振蕩混合10min,加入無(wú)菌的生理鹽水187.5mL(在40℃~44℃水浴中預(yù)溫),在40℃~44℃水浴中乳化，制成1:10的試樣勻液。8.1.2試樣溶液的稀釋無(wú)菌移液管或微量移液器吸取1:10試樣勻液1mL,沿管壁慢慢注入含有9mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液或無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌試管中(注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液),振搖試管，或放微型混合器上，混合30s,制成1:100的試樣勻液。8.1.2.2按8.1.2.1操作方法，作10倍遞增稀釋?zhuān)绱嗣窟f增稀釋一次應(yīng)更換一次無(wú)菌移液管或微量移液器吸頭。8.1.2.3根據(jù)對(duì)試樣污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的試樣勻液，每個(gè)稀釋度吸取1mL試樣勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，吸取1mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液或無(wú)菌生3GB/T13093—2023理鹽水置于無(wú)菌平皿內(nèi)做空白對(duì)照。8.2培養(yǎng)稀釋液移入平皿后，及時(shí)將15mL～20mL涼至46℃~50℃的培養(yǎng)基(可放置于48℃±2℃恒溫裝置)傾注平皿，小心轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使試樣與培養(yǎng)基充分混勻。從稀釋試樣到傾注培養(yǎng)基之間，時(shí)間不超過(guò)30min。如果估計(jì)試樣可能在培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)時(shí)，待培養(yǎng)基完全凝固后，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層涼至48℃±2℃平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(約4mL)。待瓊脂凝固后，水平倒置平板于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。8.3細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)8.3.1細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀(guān)察，必要時(shí)可借助于放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器檢查，以防遺漏。細(xì)菌計(jì)數(shù)以菌落形成單位(CFU)表示。8.3.2選擇菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間，無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄成多不可計(jì)。8.3.3兩個(gè)平板其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)選擇無(wú)較大片狀菌落生長(zhǎng)的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均勻，則應(yīng)選擇菌落分布均勻的半個(gè)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果乘以2代表這個(gè)平板的菌落數(shù)。8.3.4若平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(zhǎng)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。8.3.5若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理9.1細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算9.1.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克或每毫升試樣中細(xì)菌總數(shù)結(jié)果，見(jiàn)附錄B中示例1。9.1.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式(1)計(jì)算：式中：N——樣品中細(xì)菌總數(shù)；C——平板(含適宜范圍的平板)菌落數(shù)；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。計(jì)算結(jié)果作為每克或每毫升試樣中細(xì)菌總數(shù)結(jié)果，見(jiàn)附錄B中示例2。9.1.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU,則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算，見(jiàn)附錄B中示例3。9.1.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算，見(jiàn)附錄B中示例4。9.1.5若所有稀釋度平板均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算，見(jiàn)附錄B中示例5。9.1.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算，見(jiàn)附錄B中示例6。49.2結(jié)果表述9.2.2細(xì)菌總數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按照“四舍五入”原則修約后，采用2位有效數(shù)字。5(規(guī)范性)平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基制備A.1培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分見(jiàn)表A.1。表A.1培養(yǎng)基成分成分質(zhì)量或體積胰蛋白胨/g酵母浸膏(浸粉)/g葡萄糖/g瓊脂/g三級(jí)水/mLA.2制法將上述成分煮沸溶解，用1mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。分裝至三角瓶或試管中，121