(高清版)GBT 22260-2023 飼料中蛋白質(zhì)同化激素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

飼料中蛋白質(zhì)同化激素的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法2023-08-06發(fā)布國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替GB/T22260—2008《飼料中甲基睪丸酮的測(cè)定高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》,與GB/T22260—2008相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：a)增加了檢出限(見(jiàn)第1章);b)更改了原理(見(jiàn)第4章，2008年版的第3章);c)更改了試樣的提取和凈化(見(jiàn)8.1、8.2,2008年版的7.1、7.2);d)更改了液相色譜和質(zhì)譜參考條件(見(jiàn)8.3.1和8.3.2,2008年版的7.3.1和7.3.2);e)更改了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性和定量要求(見(jiàn)8.3.4和8.3.5,2008年版的7.3.3);f)更改了試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理(見(jiàn)第9章，2008年版的8.1);g)更改了精密度(見(jiàn)第10章，2008年版的第9章)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位：上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所。本文件主要起草人：黃士新、王博、谷旭、曹瑩、張婧、嚴(yán)鳳、商軍、吳劍平、賈銘、王杰、李軍國(guó)、本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2008年首次發(fā)布為GB/T22260—2008;——本次為第一次修訂。1飼料中蛋白質(zhì)同化激素的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1范圍本文件描述了飼料中蛋白質(zhì)同化激素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑中睪酮、甲測(cè)定。本文件甲基睪丸酮、司坦唑醇、醋酸美倫孕酮的檢出限為0.005mg/kg,睪酮、勃地龍、美雄酮、雄烯量限為0.05mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理試樣中的蛋白質(zhì)同化激素用乙腈提取，經(jīng)吸附劑凈化后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑或材料5.450%乙腈溶液：取50mL乙腈(5.2),加水稀釋至100mL,混勻。5.50.01%甲酸溶液：取100μL甲酸(5.3),加水稀釋至1000mL,混勻。龍、丙酸諾龍、司坦唑醇、醋酸美倫孕酮、黃體酮各0.01g(精確至0.00001g),分別置于10mL棕色容2量瓶中，用乙腈(5.2)溶解并定容，混勻。于一18℃以下保存，有效期為6個(gè)月。蛋白質(zhì)同化激素標(biāo)準(zhǔn)品等具體信息見(jiàn)附錄A。5.7混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液I(10μg/mL):分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.6)各100μL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈(5.2)稀釋、定容，混勻。于一18℃以下保存，有效期為3個(gè)月。5.8混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液Ⅱ(1μg/mL):準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液I(5.7)1mL于10mL棕色容量瓶5.9同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液(1mg/mL):稱取睪酮-D?、甲基睪丸酮-D?、勃地龍-D?、美雄酮-D?、雄烯二酮-至0.00001g),分別置于10mL棕色容量瓶中，用乙腈(5.2)溶解并定容，混勻。于一18℃以下保存，有效期為6個(gè)月。同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品等具體信息見(jiàn)附錄A。5.10同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液I(10μg/mL):分別準(zhǔn)確移取同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液(5.9)各100μL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈(5.2)稀釋、定容，混勻。于一18℃以下保存，有效期為3個(gè)月。5.11同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液Ⅱ(1μg/mL):準(zhǔn)確移取同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液I(5.10)1mL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈(5.2)稀釋、定容，混勻。臨用現(xiàn)配。5.12混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液Ⅱ(5.8)于棕色容量瓶中，加入適量同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液Ⅱ(5.11),用50%乙腈溶液(5.4)稀釋、定容，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、20.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10ng/mL。臨用現(xiàn)配。5.14吸附劑：乙二胺-N-丙基硅烷(PSA),粒徑40μm,或性能相當(dāng)者。6儀器設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。6.2天平：精度0.00001g和0.001g。6.3渦旋振蕩器：轉(zhuǎn)速不低于1500r/min。6.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于9000r/min。6.5渦旋混合器。6.6氮吹儀。按GB/T20195制備樣品，至少200g,粉碎使其全部通過(guò)0.425mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入8試驗(yàn)步驟8.1提取平行做兩份試驗(yàn)。稱取試樣1g(精確至0.001g)于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入100μL同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液Ⅱ(5.11)、20mL乙腈(5.2),渦旋混勻1min,1500r/min渦旋振蕩提取20min,9000r/min離心5min,上清液備用。3移取3mL上清液(8.1)于50mL離心管中，加入100mgPSA粉，渦旋1min,9000r/min離心5min,準(zhǔn)確移取2mL上清液于50℃下用氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1mL50%乙腈溶液(5.4),渦旋混勻，過(guò)液相色譜參考條件如下：b)流動(dòng)相：A相為乙腈(5.2),B相為0.01%甲酸溶液(5.5),梯度洗脫程序見(jiàn)表1;d)柱溫：35℃;時(shí)間minA%B%00質(zhì)譜參考條件如下：h)霧化器溫度：500℃。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量見(jiàn)表2。4表2蛋白質(zhì)同化激素及其內(nèi)標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量參考值被測(cè)物名稱監(jiān)測(cè)離子對(duì)錐孔電壓V碰撞能量睪酮289.0>96.9*289.0>108.5甲基睪丸酮302.9>96.9302.9>109.0*勃地龍286.9>120.9*286.9>134.9美雄酮300.9>92.9300.9>120.9雄烯二酮286.9>96.9286.9>108.9脫氫異雄酮288.9>212.9288.9>253.0諾龍275.0>108.9?275.0>239.0丙酸諾龍330.9>56.9330.9>257.0*司坦唑醇329.0>80.9329.0>94.9醋酸美倫孕酮397.1>294.5397.1>337.1*黃體酮314.9>96.9*314.9>108.9睪酮-D?292.2>97.0甲基睪丸酮-D?306.2>97.0*勃地龍-D?290.2>121.1*美雄酮-D?304.5>286.2*雄烯二酮-D?294.2>113.02脫氫異雄酮-D.291.5>273.2諾龍-D?278.2>109.0丙酸諾龍-D?334.5>257.2?司坦唑醇-D?332.0>80.9醋酸美倫孕酮-D?400.2>337.1*黃體酮-D。324.3>100.0‘定量離子。5GB/T22260—20238.3.3標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定在儀器的最佳條件下，分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(5.12)和試樣溶液(8.2)上機(jī)測(cè)定?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)附錄B。8.3.4定性在相同試驗(yàn)條件下，試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(濃度相當(dāng))中蛋白質(zhì)同化激素色譜峰的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在士2.5%之內(nèi)。根據(jù)表2選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)，比較試樣譜圖中蛋白質(zhì)同化激素監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)離子豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)離子豐度，若偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在此蛋白質(zhì)同化激素。表3定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差%相對(duì)離子豐度>20～50>10～20最大允許偏差士20士25士30士508.3.5定量以蛋白質(zhì)同化激素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)同化激素與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液(8.2)中蛋白質(zhì)同化激素的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應(yīng)重新試驗(yàn)。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中待測(cè)物的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相差不超過(guò)30%。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中待測(cè)物的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w;計(jì)，數(shù)值以毫克每千克(mg/kg)表示。多點(diǎn)校準(zhǔn)按公式(1)計(jì)算，單點(diǎn)校準(zhǔn)按公式(2)計(jì)算：式中：p——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣液中蛋白質(zhì)同化激素的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);V?——提取溶液的體積，單位為毫升(mL);V?——試樣的最終定容體積，單位為毫升(mL);V?——用于氮吹的上清液體積，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。式中：A——試樣溶液中蛋白質(zhì)同化激素的峰面積；p?！獦?biāo)準(zhǔn)溶液中蛋白質(zhì)同化激素的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);A's——標(biāo)準(zhǔn)溶液中蛋白質(zhì)同化激素同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積；pi?！嚇尤芤褐械鞍踪|(zhì)同化激素同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);V?——提取溶液的體積，單位為毫升(mL);6V?——試樣的最終定容體積，單位為毫升(mL);A、——標(biāo)準(zhǔn)溶液中蛋白質(zhì)同化激素的峰面積；A;s——試樣溶液中蛋白質(zhì)同化激素同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積；p’s——標(biāo)準(zhǔn)溶液中蛋白質(zhì)同化激素同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);V?——用于氮吹的上清液體積，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。測(cè)定結(jié)果以平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。10精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對(duì)差值不大于該算術(shù)平均值的15%。7(資料性)11種蛋白質(zhì)同化激素及其同位素內(nèi)標(biāo)中英文名稱、化學(xué)分子式、CAS號(hào)和純度見(jiàn)表A.1?；衔镏形拿Q化合物英文名稱化學(xué)分子式CAS號(hào)純度睪酮TestosteroneC??H??O?58-22-0甲基睪丸酮Methyl-testosteroneC??H??O?58-18-4勃地龍BoldenoneC??H??O?846-48-0美雄酮MetandienoneC??H??O?72-63-9雄烯二酮AndrostenedioneC?H??O?63-05-8脫氫異雄酮DehydroepiandrosteroneC?gH??O?53-43-0諾龍NandroloneC?gH??O?434-22-0丙酸諾龍Nandrolone17-propionateC??H??O?7207-92-3司坦唑醇StanozololC??H??N?O10418-03-8醋酸美倫孕酮MelengestrolacetateC??H??O2919-66-6黃體酮progesteroneC??H??O?57-83-0睪酮-D?Testosterone-D?C?gH??D?O?77546-39-5甲基睪丸酮-D?Methyltestosterone-DC??H??D?O?96425-03-5勃地龍-D?Boldenone-D?C??H??D?O?1224710-35-3美雄酮-D?Methandienone-D?C??H??D?O?869287-60-5雄烯二酮-D,Androstenedione-D?C??H??D?O?67034-85-9脫氫異雄酮-D?Dehydroepiandrosterone-DC?H??D?O?67034-83-7諾龍-D?Nandrolone-D?C?gH??D?O?120813-22-1丙酸諾龍-D?Nandrolone17-propionate-D?C??H??D?O?7207-92-3司坦唑醇-D?Stanozolol-D?C??H??D?N?O88247-87-4醋酸美倫孕酮-D?Melengestrolacetate-D?162462-73-9