可見分光光度計的使用過程 光度計是如何工作的

第第頁可見分光光度計的使用過程光度計是如何工作的一、開機開機前將樣品室內的干燥劑取出，確認電源是否連接。打開儀器電源開關，等待儀器自檢通過，自檢過程中禁止打開樣品室。二、使用儀器自檢結束后（7個自檢項

一、開機開機前將樣品室內的干燥劑取出，確認電源是否連接。打開儀器電源開關，等待儀器自檢通過，自檢過程中禁止打開樣品室。二、使用儀器自檢結束后（7個自檢項目均顯現OK字樣），按[MAINMENU]鍵（主菜單），屏幕顯示如下5個功能項：1、Phtometry（定量運算）；2、WavelengthScan（波長掃描模式）；3、TimeScan（時間曲線掃描）；4、System（系統(tǒng)校正）；5、Datadisplay（光度直接測量模式）。按相應選項前的數字鍵，即可進入該選項的下一級子菜單。1、Phtometry（定量運算）1）按[MAINMENU]鍵，再按數字[1]鍵進入Phtometry子菜單下，選中對應的數字來選擇所需的測定方式：①%T/ABS（透過率/吸光度測定模式）；②Ratio（比例測定模式）；③Concentration（濃度測定模式或標準曲線模式）；2）按數字[1]鍵進入%T/ABS（透過率/吸光度測定）子菜單，選中對應的數字鍵來設定測定條件：①NUMWL（設定測試波長的數目，較多可設定6個不同波長）；②WLSetting（設定測試波長實在數值）③DataMode（選擇測定吸光度或透光率），設定完畢后點擊[Enter]鍵確定，全部項目設定完畢后按數字[0]鍵確定，等待儀器調整至準備狀態(tài)，此時屏幕上顯現AUTOZERO，將盛有空白溶液的比色皿放入樣品室中，按[Start/Stop]鍵進行零點的自動調整，自動調零完成后，將樣品置于光路中，再按[Start/Stop]鍵進行測量，儀器的顯示屏自動給出對應波長的數值。3）按數字[3]鍵進入③Concentration（濃度測定模式或標準曲線模式），選中對應的數字來設定條件（波長數目，波長數值，標準溶液數目及濃度），設定完畢后點擊[Enter]鍵確定，全部項目設定完畢后按數字[0]鍵確定，等待儀器調整至準備狀態(tài)，此時屏幕上顯現AUTOZERO，將盛有空白溶液的比色皿放入樣品室中，按[Start/Stop]鍵進行零點的自動調整，自動調零完成后，將標準溶液置于光路中，依照濃度從低到高次序依次按[Start/Stop]鍵進行測量，測量完畢后儀器將自動給出標準曲線，標準曲線下方有三項供選擇：①Process（更改標準曲線的坐標和察看濃度回歸曲線的數據）；②Measure（直接進入樣品的測量）；③Print（打印濃度回歸曲線譜圖和數據），選中對應的數字就可執(zhí)行相應的功能。4）假如希望返回上一級菜單，按[CLEARRETURN]鍵返回，返回主菜單直接按[MAINMENU]鍵。2、WavelengthScan（波長掃描模式）1）參數修改：按[MAINMENU]鍵，再按數字[2]鍵進入②WavelengthScan（波長掃描模式）子菜單下，選中對應的數字來選擇所需修改的內容，修改掃描的起始波長，測量模式，圖譜坐標的上下限，掃描速度等等。修改完畢按數字[0]鍵確定。2）波長掃描：分別將兩個比色皿裝上空白溶液和樣品溶液，放入比色槽中，按[Start/Stop]鍵進行譜圖掃描（如想停止掃描再次按按[Start/Stop]鍵），待儀器自動進行基線校正，提示拉入樣品自動測試，測試完畢后有掃描圖譜顯現，下方有相應的數據處理選項①Process②Baseline③Print；3）數據處理：按數字[1]鍵進入①Process（數據處理），可以讀峰谷值，修改坐標，顯示全部數據，求一階倒數等等功能。3、TimeScan（時間曲線掃描）同上（二）操作。4、System（系統(tǒng)校正）一般不做。5、Datadisplay（光度直接測量模式）同上（二）操作。三、關機將比色皿中的溶液倒盡，然后用蒸餾水或有機溶劑沖洗比色皿至干凈；關電源將干燥劑放入樣品室內，蓋上防塵罩，做好使用登記，得到管理人員認可方可離開。

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分光光度計的工作原理

事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在確定范圍內變化，即儀器有確定的精準度和精準明確度。如EppendorfBiophotometer的精準度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移，因此建議使用pH值確定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避開存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度削減顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值可以在0.1—1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至顯現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移猛烈；必需使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇一致；不能接受窗口磨損的比色杯；樣品的體積必需達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個特別緊要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，由于蛋白的吸取峰是280nm。純潔的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。假如比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純潔的核酸A260/A230的比值大于2.0、A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0、

蛋白質的直接定量（UV法）

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程特別簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在一些雜質，一般要除去320nm的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸仿佛，要求A280的吸光值至少大于0.1A，較佳的線性范圍在1.0—1.5之間。試驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發(fā)覺讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上，只要察看A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結果特別穩(wěn)定。漂移的原因是由于Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以確定的系數，只要吸光值有少許更改，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩(wěn)定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純潔、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度