高效菌篩選方法及策略

關(guān)于高效菌篩選方法及策略第三章高效有機(jī)物降解菌的構(gòu)建

技術(shù)及策略

第一節(jié)高效有機(jī)物降解菌的構(gòu)建技術(shù)一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)二、誘變技術(shù)三、細(xì)胞融合技術(shù)四、基因重組技術(shù)五、基因工程第2頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月

第三章高效有機(jī)物降解菌的構(gòu)建技

術(shù)和策略

第二節(jié)高效有機(jī)物降解菌的構(gòu)建策略一、優(yōu)化污染物的降解途徑1.重組互補(bǔ)代謝途徑2.改變污染物代謝產(chǎn)物流向3.同源基因體外隨機(jī)拼接4.拓寬氧化酶的專一性二、提高污染物生物可利用性1.重組表面活性劑編碼基因2.重組污染物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因三、增強(qiáng)細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)性1.增強(qiáng)細(xì)菌的抗毒能力2.增強(qiáng)細(xì)菌的放射線耐受性第3頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第一節(jié)高效有機(jī)物降解菌的構(gòu)建技術(shù)一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)不經(jīng)人工誘變，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過(guò)程稱為自然選育或自然分離。微生物自然突變有兩種原因：(1)自然環(huán)境中存在的低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低濃度的誘變物質(zhì)和微生物自身代謝產(chǎn)生誘變物質(zhì)的作用引起的突變；（2）在DNA的復(fù)制過(guò)程中所發(fā)生的錯(cuò)配。

第4頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)來(lái)源：土壤、水、空氣、動(dòng)植物極其腐敗殘?bào)w、有機(jī)物污染地區(qū)、污水處理系統(tǒng)中。采樣增殖培養(yǎng)純種分離篩選性能鑒定第5頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第6頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)采樣：應(yīng)根據(jù)篩選的目的、微生物分布情況、菌種的主要特征極其生態(tài)關(guān)系等因素，確定具體時(shí)間、地點(diǎn)和目標(biāo)物。增殖：為提高分離效率，常以投其所好的原則在培養(yǎng)基中添加特殊的養(yǎng)分，使其所需菌種的數(shù)量相對(duì)增加。主要是利用不同微生物的生長(zhǎng)繁殖對(duì)環(huán)境和培養(yǎng)基的特殊要求進(jìn)行富集培養(yǎng)和要求，控制這些條件使之有利于某類和某種微生物，而對(duì)其它微生物不利，再對(duì)培養(yǎng)時(shí)間加以控制，可以達(dá)到初步的分離和富集目的。

第7頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)純化：1.菌落純2.菌株純1.菌落純：從“種”的水平來(lái)說(shuō)是純的，其方法有劃線分離法、涂布分離法和稀釋分離法。2.菌株純：較為精細(xì)的單孢子或單細(xì)胞分離法。性能鑒定：菌的生長(zhǎng)情況、酶活測(cè)定、效果測(cè)定自然選育是一種簡(jiǎn)便易行的選育方法。但自然選育的效率低（10-8—10-10）。第8頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月二、誘變育種誘變育種是人為地利用物理、化學(xué)等因素，使誘變的細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)染色體或DNA的片段發(fā)生缺失、易位、倒位、重復(fù)等畸變，或DNA的某一部位發(fā)生改變(又稱點(diǎn)突變)，從而使微生物的遺傳物質(zhì)DNA或其化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起微生物的遺傳變異。因此，誘發(fā)突變的頻率遠(yuǎn)大于自然突變。第9頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第10頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月誘變過(guò)程出發(fā)菌株的選擇：1.選擇純種作為出發(fā)菌株，借以排除異核體或異質(zhì)體的影響；2.不僅效果好，而且要考慮其它形狀，如生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)要求低等；3.對(duì)誘變劑敏感的菌株；4.選擇已經(jīng)誘變過(guò)的菌株。誘變劑的選擇（物理：紫外線、X射線等，化學(xué)：堿基類似物，5-氟尿嘧啶；烷化劑，亞硝基胍，甲基磺酸乙酯）要考慮誘變劑本身的特點(diǎn)，如紫外線作用于DNA分子的嘧啶堿基，而亞硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤堿基，兩者復(fù)合使用，突變譜寬，效果較好。第11頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月誘變過(guò)程影響誘變效果的因素：菌種的生理狀態(tài)：對(duì)分裂中的細(xì)胞更有效；細(xì)胞懸浮液要求生理狀態(tài)一致，為分散均勻的單細(xì)胞或單孢子懸浮液（一方面分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，另一方面可避免長(zhǎng)出不純菌落）。第12頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月誘變過(guò)程

誘變劑的劑量：誘變率隨誘變劑量的增加而提高，但達(dá)到一定程度后，再提高劑量，反而會(huì)使誘變率下降，使負(fù)變異株多，因此，主張用中等劑量，如75%-80%或更低劑量。充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)。復(fù)合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時(shí)使用，也可以用同一誘變劑重復(fù)使用。復(fù)合處理可擴(kuò)大突變的位點(diǎn)范圍，使獲得正突變菌株的可能性增大。第13頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月

篩選過(guò)程特點(diǎn)：發(fā)生頻率低；隨機(jī)性大過(guò)程：先初篩，后復(fù)篩，測(cè)突變菌株性能誘變育種的基本篩選程序：出發(fā)菌株→絕大多數(shù)個(gè)體死亡，少數(shù)存活（存活率）→少數(shù)突變（突變率）→少數(shù)正變（正變率）→少數(shù)降解酶活增加幅度大（增加率）且要求穩(wěn)定

第14頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月三.原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合(Protoplastfusion)指在一定選擇條件下，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時(shí)帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子。始于1976年，最早是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)早微生物中得以應(yīng)用。使細(xì)胞間基因重組的頻率大大提高了，已大于10-1（而誘變育種一般僅為10-6）。發(fā)生基因重組親本的選擇范圍更大，可以在不同種、屬、科，甚至更遠(yuǎn)緣的微生物之間進(jìn)行。第15頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月三.原生質(zhì)體融合在有些情況下，兩種或多種微生物在共同存在時(shí)才能降解某種污染物，單獨(dú)存在時(shí)不能降解該污染物，這可能是因?yàn)楸舜藶閷?duì)方提供了生長(zhǎng)所必須的條件或?yàn)閷?duì)方消除了生長(zhǎng)的障礙，使得它們?cè)诠泊娴臈l件下能夠順利降解環(huán)境污染物。在這種情況下，可以采用原生質(zhì)體融合技術(shù)融合這兩種微生物，融合子就會(huì)具備兩個(gè)親本的基因與優(yōu)點(diǎn)，能夠降解某種環(huán)境污染物，這也是目前污染治理工程菌制備的一個(gè)主要途徑。第16頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月三.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合特點(diǎn)：1雜交頻率較高2遺傳物質(zhì)體傳遞更為完整3存在著兩株以上親株同時(shí)參與融合形成融合子的可能4提高效果的潛力較大第17頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月三.原生質(zhì)體融合3.1選擇親株：必須選遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的兩個(gè)親株，而且必須帶有可以識(shí)別的遺傳標(biāo)記（多為營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗藥性標(biāo)記）。3.2原生質(zhì)體制備：去除細(xì)胞壁是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果較好。影響因素：菌體前處理、菌齡、酶濃度、酶處理溫度、PH、滲透壓穩(wěn)定劑（不僅起保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合。原生質(zhì)體對(duì)滲透壓極其敏感，低滲引起細(xì)胞破裂。多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有機(jī)物和氯化鉀和氯化鈉等無(wú)機(jī)物。穩(wěn)定劑的濃度一般均在0.3-0.8mol/L之間。第18頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月三.原生質(zhì)體融合3.3原生質(zhì)體融合：融合促進(jìn)劑：聚乙二醇（PEG，濃度為25%－40%）可有效促進(jìn)原生質(zhì)體融合。另外，紫外線照射和脈沖電場(chǎng)等物理因素處理也能促進(jìn)原生質(zhì)體融合。3.4原生質(zhì)體再生：是使原生質(zhì)體重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)?？稍偕闹徽荚|(zhì)體的一部分，細(xì)菌再生率為3%~10%；真菌為20%~80%。用再生培養(yǎng)基。提高再生率必須避免因強(qiáng)力動(dòng)作而使原生質(zhì)體破裂，另外菌液濃度不宜太高。菌齡、再生時(shí)的溫度、溶菌酶用量和溶壁時(shí)間、細(xì)胞壁去除程度等因素都會(huì)影響再生。第19頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月三.原生質(zhì)體融合3.5篩選優(yōu)良性狀融合重組子：原生質(zhì)體融合后，來(lái)自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過(guò)交換并發(fā)生重組而形成的子代成為融合重組子。這種重組子通過(guò)兩親株遺傳標(biāo)記的互補(bǔ)而得以識(shí)別。（真正的融合和暫時(shí)的融合）融合子生理生化測(cè)定。原生質(zhì)體技術(shù)還可用于誘變育種中。第20頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月四、基因重組技術(shù)

1.轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收了來(lái)自供體菌的DNA片段，通過(guò)交換，把它整合到自己的基因組中，再經(jīng)復(fù)制就使自己變成一個(gè)轉(zhuǎn)化子。在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象。能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞必須處于感受態(tài)（受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)）。感受態(tài)因子是一種胞外蛋白。可能是細(xì)胞膜上的一種組成，催化DNA吸收據(jù)推測(cè)可能是一種自溶酶第21頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月1.轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化因子本質(zhì)：DNA大?。赫技?xì)菌核染色體組的0.3%，含15個(gè)基因。轉(zhuǎn)化頻率：0.1%~1%，最高達(dá)10%。呈質(zhì)粒形式的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高，因?yàn)樗M(jìn)入受體菌后，可不必同受體染色體進(jìn)行交換、整合即可進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA。

第22頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月過(guò)程：1）雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體細(xì)胞表面的特異位點(diǎn)結(jié)合；2）在吸附位點(diǎn)上的DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成片段；3）一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進(jìn)入細(xì)胞；4）DNA片段與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，交換、整合和取代，形成雜合DNA片段；5）受體菌染色體復(fù)制，一個(gè)為轉(zhuǎn)化子，一個(gè)不是。1.轉(zhuǎn)化第23頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月2.轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的DNA小片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。第24頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月2.傳導(dǎo)通過(guò)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌任何DNA小片段的“誤包”，而實(shí)現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的傳導(dǎo)現(xiàn)象。完全缺陷噬菌體：當(dāng)噬菌體在供體菌內(nèi)增殖時(shí)，宿主的核染色體組斷裂，待噬菌體成熟與包裝之際，極少數(shù)噬菌體的衣殼與噬菌體頭部DNA芯子相仿的一小段供體菌DNA片段誤包入其中，形成了一個(gè)不含噬菌體自身DNA的假噬菌體。進(jìn)行完全普遍傳導(dǎo)和流產(chǎn)普遍傳導(dǎo)第25頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月2.傳導(dǎo)完全普遍傳導(dǎo)：完全缺陷噬菌體將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，該片段可與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，再經(jīng)過(guò)雙交換而整合到受體菌染色體組上，使后者成為一個(gè)遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。流產(chǎn)普遍傳導(dǎo)：經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得的供體菌DNA片段的受體菌，如果外源DNA在其內(nèi)不進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，也不迅速消失，而僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯和性狀表達(dá)。第26頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第27頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月3、接合供體菌（雄）通過(guò)其性菌毛與受體菌（雌）相接觸，前者傳遞不同長(zhǎng)度的單鏈DNA給后者，并在后者細(xì)胞中進(jìn)行雙鏈化或進(jìn)一步與核染色體發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象。F因子：決定性別的質(zhì)粒第28頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第29頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第30頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月五.基因工程技術(shù)基因工程是分子水平上在生物體外用人工方法進(jìn)行ＤＮＡ的重組，以改變生物的性狀創(chuàng)造生物的新品種或新物種的一門新學(xué)科。

對(duì)于環(huán)境中難以降解的有毒有害化合物，可通過(guò)基因工程的方法，設(shè)計(jì)新的代謝途徑，利用相關(guān)的基因構(gòu)建工程菌。這樣不僅提高細(xì)胞單一酶的濃度增加代謝途徑中某一限制酶的表達(dá)，還能使代謝途徑中所有基因的表達(dá)獲得同步增加，從而大大提高降解效率，促使有毒化合物分子進(jìn)一步降解為無(wú)害的末端產(chǎn)物。

第31頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月五.基因工程主要過(guò)程：獲得特定的目標(biāo)基因目標(biāo)基因片段

DNA重組載體DNA進(jìn)入受體細(xì)胞并擴(kuò)增、表達(dá)具目標(biāo)基因表達(dá)功能重組體第32頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月黏性末端黏性末端1、限制性核酸內(nèi)切酶限制酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，一種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開（切割DNA分子）來(lái)源：主要從原核細(xì)胞分離作用：

作用結(jié)果：EcoRI基因工程的“專用工具”平未端及粘性未端第33頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。第34頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。第35頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第36頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月基因的針線：DNA連接酶G

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G同種限制酶切割第37頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月基因的針線——DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來(lái)(形成磷酸二酯鍵)，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。第38頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月導(dǎo)入過(guò)程需要運(yùn)輸工具——運(yùn)載體。運(yùn)載體的作用有哪些？作用一：作為運(yùn)載工具，將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。作用二：利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對(duì)外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。第39頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月（一）載體基因克隆載體條件：（1）具有能使外源DNA片段組入的克隆位點(diǎn)。（2）能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞或游離在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨DNA復(fù)制而復(fù)制。（3）必須具有遺傳標(biāo)記，承載外源DNA的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，以便篩選克隆子。第40頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月常用的運(yùn)載體主要有兩類：

1）質(zhì)粒

2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒第41頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月質(zhì)粒1.質(zhì)粒的定義：一般來(lái)說(shuō)符合以下3條標(biāo)準(zhǔn)的染色體外的DNA或RNA分子都可以稱之為質(zhì)粒：(1)質(zhì)粒是染色體外能自主復(fù)制的遺傳因子；(2)不具備胞外期的感染性；(3)它對(duì)宿主來(lái)說(shuō)不是必需的。構(gòu)建質(zhì)粒載體一般選用分子小和松弛型復(fù)制的質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)可含10－200個(gè)拷貝，而且不受宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響，當(dāng)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成停止時(shí)，質(zhì)粒DNA的復(fù)制仍可以繼續(xù)進(jìn)行，甚至可以將拷貝數(shù)增加至數(shù)千個(gè)。細(xì)菌對(duì)環(huán)境中的特異性限制因子的應(yīng)答能力一般是由質(zhì)?？刂频模虼?，質(zhì)粒在為宿主細(xì)胞提供遺傳多樣性及其利用大范圍生態(tài)位的適應(yīng)中起著非常重要的作用。

第42頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月大腸桿菌的質(zhì)粒：

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如抗四環(huán)素的標(biāo)記基因。質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。第43頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（SC構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋（OC構(gòu)型）線狀雙螺旋（L構(gòu)型）第44頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月五.基因工程

質(zhì)粒的大小一般為染色體的0.05%~20%或更多，長(zhǎng)度為1~20kb，有時(shí)細(xì)菌中含有大小不同的質(zhì)粒。質(zhì)?？梢砸圆煌姆绞皆诩?xì)菌的種群中傳遞，轉(zhuǎn)移的頻率大到10－2,而染色體的轉(zhuǎn)移頻率卻只有10－6~10－8。假單胞菌中，發(fā)現(xiàn)有分解功能的質(zhì)粒，帶有這些質(zhì)粒的菌表現(xiàn)為具有降解非正常碳源，如樟腦、辛烷、水楊酸等的能力。質(zhì)粒的消除試驗(yàn)則是鑒定質(zhì)粒功能的又一重要手段，通過(guò)消除質(zhì)粒來(lái)觀察寄主細(xì)胞是否喪失某些性狀。

第45頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月五.基因工程2.質(zhì)粒的基本性質(zhì)1）細(xì)菌質(zhì)粒是雙股的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子，即cccDNA。2）每一種質(zhì)粒有自己特定的核苷酸序列，所以每一種限制酶對(duì)每一種質(zhì)粒都有固定的切點(diǎn)數(shù)和切點(diǎn)位置。3）質(zhì)粒都有自主復(fù)制功能。4）不僅能自主復(fù)制，而且能平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，從而使質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳。5）具有不相容性。6）都具有一定寄主范圍。第46頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月五.基因工程2.質(zhì)粒的基本性質(zhì)7）對(duì)寄主細(xì)胞是非必須的。8）質(zhì)粒DNA能通過(guò)轉(zhuǎn)化作用引入到細(xì)菌細(xì)胞。9）某些質(zhì)粒為一些特殊的表型編碼，可稱抗性質(zhì)粒、代謝質(zhì)粒和毒素質(zhì)粒等。10）分子量大的質(zhì)粒一般具有接合功能，即借助于細(xì)胞間接觸，供體菌的質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)移至受體菌中。11）有些質(zhì)粒可以以游離于寄主染色體和與染色體整合兩種狀態(tài)存在。12）質(zhì)?？捎米骰蜉d體。第47頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月質(zhì)粒pBR322pBR3224363結(jié)構(gòu)：（1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr）3種限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)。（2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr）內(nèi)部有7種，啟動(dòng)區(qū)內(nèi)有2種限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)。（3）DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）第48頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：（1）具有較小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。（3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后,每個(gè)細(xì)胞中可累積1000～3000個(gè)拷貝。（4）對(duì)多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個(gè)能切割的位點(diǎn)。

pBR3224363第49頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月五.基因工程3.質(zhì)粒的生態(tài)遺傳學(xué)意義質(zhì)粒有著重要的生態(tài)遺傳學(xué)意義，它們作為“微染色體”能從一個(gè)細(xì)胞中方便地分離出來(lái)，并方便地轉(zhuǎn)入到另一個(gè)細(xì)胞中去，這一特征為現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展提供了重要的工具和手段。在DNA克隆方法學(xué)的發(fā)展進(jìn)程中，質(zhì)粒起著至關(guān)重要的作用，以質(zhì)粒作為運(yùn)載體在細(xì)菌中擴(kuò)增和表達(dá)許多外源基因的方法和技術(shù)，在工、農(nóng)、醫(yī)各個(gè)領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用，并極大地拓展了人們對(duì)質(zhì)粒微生物學(xué)認(rèn)識(shí)的視野。第50頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月五.基因工程4、載體和目的基因重組4.1以質(zhì)粒為載體的ＤＮＡ重組質(zhì)粒是最常用的載體。優(yōu)點(diǎn)：分子量小，可自主或半自主復(fù)制，有多個(gè)選擇性標(biāo)記，多個(gè)酶切位點(diǎn)，拷貝數(shù)多，性能穩(wěn)定?？陕〉淖畲驞NA片段一般在10kb左右。4.2以噬菌體為載體的ＤＮＡ重組先把降解性基因克隆進(jìn)λ噬菌體內(nèi)，將重組ＤＮＡ經(jīng)體外包裝成成熟噬菌體顆粒，從而能夠按照正常的噬菌體感染過(guò)程導(dǎo)入寄主細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)在于克隆效率較高，降解性基因整合進(jìn)寄主染色體后比較穩(wěn)定。缺點(diǎn)是包裝限制問(wèn)題，對(duì)于ＤＮＡ片段大于23ｋｂ降解性基因則不能成功地被克隆。

第51頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月四個(gè)基本步驟：（三）基因操作的基本步驟1）提取目的基因2）目的基因與運(yùn)載體結(jié)合3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）目的基因的檢測(cè)和表達(dá)第52頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、降解有機(jī)物的降解基因等。目的基因：包括轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)區(qū)、基因編碼區(qū)和終止區(qū)的全功能基因。步驟一：目的基因的提取第53頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法

在獲取真核細(xì)胞中的目的基因時(shí),一般用人工合成基因的方法.第54頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月哪些新技術(shù)能大大簡(jiǎn)化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動(dòng)測(cè)序儀：2）PCR技術(shù)：對(duì)提取出來(lái)的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增。第55頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月步驟二：目的基因與運(yùn)載體重組

1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。第56頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月基因操作的基本步驟目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法1、將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。2、使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。3、目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非常快，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第57頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第58頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞導(dǎo)入擴(kuò)增第59頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月導(dǎo)入過(guò)程：運(yùn)載體為質(zhì)粒，受體細(xì)胞為細(xì)菌受體細(xì)胞：細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制氯化鈣大量的目的基因第60頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月步驟四克隆子的篩選和鑒定目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，真正獲得目的基因并能有效表達(dá)的克隆子只是一小部分。1利用克隆載體攜帶的選擇標(biāo)記基因篩選克隆子。A利用抗菌素抗性基因進(jìn)行篩選Ampr（抗氨芐青霉素）Cmpr（抗氯霉素）kanr（抗卡那霉素）Tetr（抗四環(huán)素）Strr（抗鏈霉素）。當(dāng)含任何一種抗菌素抗性基因的載體處理不具這種抗性基因的受體細(xì)胞，并在含相應(yīng)抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，只有獲得載體的受體細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)，這樣便可篩選出含克隆載體的克隆子。第61頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月外源DNApBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端黏性末端連接酶重組子(ampstetr)空載體(amprtetr)

野生型的E.coli(ampstets)

導(dǎo)入涂布在含Tc的平板上重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr)空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)影印在含Ap的平板上空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)因插入外源DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng)對(duì)比兩個(gè)平板上的菌落，凡在Tc平板上生長(zhǎng)而在Ap平板上不能生長(zhǎng)的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽(yáng)性克隆，分離出重組質(zhì)粒。第62頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月克隆子篩選與鑒定B利用乳糖操縱子lacZ’

基因篩選克隆子具有完整乳糖操縱子的菌體能翻譯β-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和乙?；D(zhuǎn)移酶（A），當(dāng)培養(yǎng)基中含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）時(shí)，可產(chǎn)生藍(lán)色沉淀物，使菌落成藍(lán)色。當(dāng)目的基因插入后lacZ’

基因不能表達(dá)，因此，帶有目的基因的重組子菌落呈白色，而沒(méi)有轉(zhuǎn)入目的基因的菌落呈蘭色。第63頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月克隆子篩選與鑒定2克隆子的進(jìn)一步鑒定用上述方法篩選的克隆子，難免得到一些假克隆子，為進(jìn)一步鑒定克隆子的真假，可采用限制性內(nèi)切酶分析、分子雜交、PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序、目的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物檢測(cè)等方法。第64頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第二節(jié)基因工程菌構(gòu)建策略

自1973年Jackson等人首次提出基因可以人工重組，并能在細(xì)菌中復(fù)制以來(lái)，基因工程作為一個(gè)新興的研究領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展，取得了喜人的成績(jī)。因各種環(huán)境條件和生物因子的限制，細(xì)菌的進(jìn)化是相當(dāng)緩慢的而且沒(méi)有一定的方向，因此通過(guò)基因工程促進(jìn)細(xì)菌的遺傳進(jìn)化以滿足生物修復(fù)工程的需要。第65頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月1.優(yōu)化污染物的降解途徑

（1）重組互補(bǔ)代謝途徑：

系列酶（不同菌共代謝）有機(jī)污染物小分子化合物缺點(diǎn)：降解速率慢，因?yàn)槲廴疚锎x產(chǎn)物在不同降解菌間的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是耗能過(guò)程，對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)這是一種不經(jīng)濟(jì)的營(yíng)養(yǎng)方式。另外，某些污染物的中間代謝產(chǎn)物可能具有毒性或?qū)Υx活性有抑制作用，如不能被迅速代謝利用，積累后將對(duì)整個(gè)代謝過(guò)程產(chǎn)生抑制作用。因此對(duì)這些細(xì)菌的降解基因進(jìn)行重組，將分屬于不同細(xì)菌個(gè)體中的污染物代謝途徑組合起來(lái)來(lái)構(gòu)建具有特殊降解功能的超級(jí)降解菌，可以有效的提高微生物降解能力，從而提高生物修復(fù)效率。

第66頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月抑制劑

脫氯

ohb

脫鹵素基因聯(lián)苯雙加氧酶（bphA）氯代苯甲酸(CBA)多氯聯(lián)苯（PCBs）O2

異戊二烯酸重組體Bph:ohbCO2+H2O

進(jìn)一步降解第67頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月硝基芳香化合物，如炸藥，即2，4，6-三硝基甲苯（簡(jiǎn)稱TNT）

引入甲苯完整降解質(zhì)粒pWWO-Km

假單胞菌甲苯TNT氨基甲苯硝基甲苯

構(gòu)建微生物可以利用TNT為唯一碳源和氮源生長(zhǎng)

第68頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月1.優(yōu)化污染物的降解途徑

（2）改變污染物代謝產(chǎn)物流向污染物降解過(guò)程中由于抑制性中間代謝產(chǎn)物的生成或中間產(chǎn)物進(jìn)入截止式代謝產(chǎn)物途徑而抑制了污染物降解酶活性，使得污染物降解效率不高或降解不徹底。因此可以考慮將細(xì)菌對(duì)污染物的中間代謝產(chǎn)物流向進(jìn)行某些改進(jìn)，使抑制性中間產(chǎn)物不產(chǎn)生或盡量轉(zhuǎn)化，從而提高污染物降解速率。

第69頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月第70頁(yè),共78頁(yè)，星期六，2024年，5月1.優(yōu)化污染物的降解途徑（3）拓寬酶的專一性許多有毒有害有機(jī)物，如芳香烴、多氯聯(lián)苯、氯化烴等，其代謝反應(yīng)由多組分氧化酶催化進(jìn)行。這些關(guān)鍵酶的底物專一性阻礙了有機(jī)物代謝，如多氯聯(lián)苯異構(gòu)體等，如何拓寬這些酶的底物范圍，是研究的方向。多氯聯(lián)苯—聯(lián)苯降解菌：不能氧化甲苯甲苯—苯降解菌：不能利用聯(lián)苯為碳源生長(zhǎng)兩者雙氧合酶編碼基因的遺傳結(jié)構(gòu)、大小和同源性相似，將兩種酶不同組分的編碼基因“混合”