(高清版)GBT 42114-2022 木薯葉片中黃酮醇的測(cè)定 高效液相色譜法

木薯葉片中黃酮醇的測(cè)定高效液相色譜法2022-12-30發(fā)布2023-07-01實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、浙江大學(xué)、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所。李開綿。1木薯葉片中黃酮醇的測(cè)定高效液相色譜法1范圍本文件描述了木薯(ManihotesculentaCrantz,Cassava)葉中4種黃酮醇化合物的高效液相色譜測(cè)定方法。本文件適用于木薯鮮葉和木薯干葉中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷4種黃酮醇含量的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)話用干本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理木薯葉片試樣中加入50%乙醇水溶液，經(jīng)超聲波輔助提取，高效液相色譜儀分離，紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間定性和外標(biāo)法定量。5試劑和材料除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用分析純?cè)噭?，以及符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1試劑5.1.2無(wú)水乙醇(CH?CH?OH,CAS號(hào)：64-17-5):色譜純。5.2試劑配制5.2.150%乙醇水溶液(體積分?jǐn)?shù)):取500mL無(wú)水乙醇(5.1.2),加入500mL水，混勻。5.2.20.2%磷酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)):取2.0mL磷酸(5.1.3),置于1000mL容量瓶中，用水定容至刻5.3標(biāo)準(zhǔn)品5.3.1楊梅苷(myricetin-3-O-rutinoside,Cz,HO?,CAS號(hào)：41093-68-9):純度≥98.0%。25.3.2蘆丁(quercetin3-O-rutinoside,Cz,HoOl6,CAS號(hào)：153-18-4):純度≥98.0%。5.3.3煙花苷(kaempferol-3-O-rutinoside,Cz,H?Ois,CAS號(hào)：17650-84-9):純度≥98.0%。5.3.4水仙苷(isorhamnetin-3-O-rutinoside,C2sH??Og,CAS號(hào)：604-80-8):純度≥98.0%。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制醇(5.1.1)溶解并定容至100mL,配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于一18℃密封避光保存。保存期6個(gè)月。50%乙醇水溶液(5.2.1)定容，獲得4種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為100.0μg/mL、600.0μg/mL、準(zhǔn)確移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液(5.4.2),用50%乙醇水溶液(5.2.1)逐級(jí)稀釋，配制成楊梅苷質(zhì)量濃度分別為0.25μg/mL、0.5μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL,蘆丁質(zhì)量濃度分別為0.15μg/mL、3.0μg/mL、15.0μg/mL、30.0μg/mL、150.0μg/mL.300.0μg/mL、600.0μg/mL,煙花苷質(zhì)量濃度分別為0.15μg/mL、1.5μg/mL、7.5μg/mL、15.0μg/mL、75.0μg/mL、150.0μg/mL、300.0μg/mL,水仙苷質(zhì)量濃度分別為0.15μg/mL、0.5μg/m6儀器與設(shè)備6.1高效液相色譜儀：配備紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。6.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4200r/min,配15mL轉(zhuǎn)子或適配器。6.5電熱恒溫干燥箱。6.6植物組織研磨儀。6.7旋渦混合器。7試樣制備與保存取適量木薯新鮮葉片(不帶葉柄),擦拭干凈表面塵土或水分，用液氮速凍后研磨至粉末，裝入潔凈的離心管中。試樣制備后于一18℃以下密封避光保存。保存期1年。37.2木薯干葉取適量的木薯干葉(不帶葉柄),用植物組織研磨儀研磨至粉末，過(guò)0.2mm的篩，混勻，裝入潔凈的密封袋中。試樣制備后于8℃以下密封避光保存。保存期1年。8測(cè)定步驟8.1提取準(zhǔn)確稱取木薯鮮葉或木薯干葉粉末0.2g(±0.0002g)于15mL離心管中，加入50%乙醇水溶液(5.2.1)5.0mL,旋渦振蕩混勻，超聲提取60min(50℃,500W),離心10min(4200r/min,25℃),上清液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，殘?jiān)偌尤?0%乙醇水溶液(5.2.1)5.0mL,旋渦振蕩混勻，離心5min(10000r/min,25℃),合并兩次離心的上清液，加入50%乙醇水溶液(5.2.1)定容至10mL,旋渦振蕩混勻，即待測(cè)樣品溶液。取1.0mL待測(cè)樣品溶液，通過(guò)0.22μm微孔濾膜(6.11),供高效液相色譜儀檢測(cè)。8.2測(cè)定高效液相色譜儀(6.1)的色譜參考條件如下：a)Cis柱(250mm×4.6mm,5μm)或性能相當(dāng)?shù)纳V柱；b)流動(dòng)相：甲醇和0.2%磷酸水溶液，按表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；表1梯度洗脫表時(shí)間min甲醇%0.2%磷酸水溶液%008.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取適量標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液(5.4.2),用50%乙醇稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(5.4.3),楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷質(zhì)量濃度范圍分別為：0.25mg/L～100.0mg/L、0.15mg/L～600.0mg/L、0.15mg/L~300.0mg/L和0.15mg/L～100.0mg/L。按照8.2.1規(guī)定的色譜條件測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)附錄A。48.2.3試樣溶液的測(cè)定按照8.2.1規(guī)定的色譜條件，將待測(cè)樣品溶液(8.1)注入高效液相色譜儀(6.1)中進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性。試樣溶液中4種黃酮醇的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過(guò)線性范圍應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。9結(jié)果計(jì)算與表述9.1木薯葉片中黃酮醇各組分含量試樣中木薯葉黃酮醇各組分含量，按式(1)計(jì)算。式中：X;——試樣中某一黃酮醇組分含量，單位為毫克每千克(mg/kg);p?——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中各組分的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);V——試樣提取液定容體積，單位為毫升(mL);1000——單位換算系數(shù)；m——試樣質(zhì)量，單位為克(g);f——稀釋倍數(shù)。9.2木薯葉黃酮醇總含量試樣中黃酮醇總含量為各組分之和，按式(2)計(jì)算。 式中：X——試樣中黃酮醇總含量，單位為毫克每千克(mg/kg);X;——試樣中某一黃酮醇組分含量，單位為毫克每千克(mg/kg)。注：本文件中4種黃酮醇已包括木薯葉片中黃酮醇的絕大部分含量，可視為木薯葉片中黃酮醇總含量。9.3結(jié)果表示計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后一位。10精密度10.1重復(fù)性在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)算術(shù)平均值的10%。在再現(xiàn)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)算術(shù)平均值的15%。11檢出限和定量限本方法測(cè)定黃酮醇的檢出限和定量限見(jiàn)表2。5表2黃酮醇化合物檢出限與定量限單位為