PCR引物設(shè)計(jì)及相關(guān)軟件使用

PCR引物設(shè)計(jì)及相關(guān)軟件使用重慶大學(xué)生物工程學(xué)院楊應(yīng)斌主要內(nèi)容背景PCR引物設(shè)計(jì)原那么常用PCR引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0介紹Oligo6.22介紹在線Primer3介紹PCR聚合酶鏈反響(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期開展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。PCR引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不適宜的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶〔如形成引物二聚體帶〕，不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。引物設(shè)計(jì)的原那么引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間防止形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反響(即錯(cuò)配)。影響因素如引物長(zhǎng)度〔primerlength〕，產(chǎn)物長(zhǎng)度〔productlength〕序列Tm值(meltingtemperature)引物與模板形成雙鏈的穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)〔duplexformationandhairpin〕的能值在錯(cuò)配位點(diǎn)〔falseprimingsite〕的引發(fā)效率引物及產(chǎn)物的GC含量〔composition〕，等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。一般原那么引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反響。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否那么容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。

一般原那么3.引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)防止在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反響失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。一般原那么4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反響。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最正確。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(thenearestneighbormethod)。一般原那么6.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)中選用3’端?G值較低〔絕對(duì)值不超過(guò)9〕，而5’端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反響。一般原那么7.引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高〔超過(guò)4.5kcal/mol〕易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反響不能正常進(jìn)行。

一般原那么8.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6〔引物評(píng)價(jià)〕*PremierPrimer〔自動(dòng)搜索〕*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3〔在線效勞〕*PrimerPremier5.0的使用技巧簡(jiǎn)介主要功能:1、即引物設(shè)計(jì)2、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核〔CiliateMacronuclear〕2、無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體〔InvertebrateMitochondrion〕3、支原體〔Mycoplasma〕4、植物線粒體〔PlantMitochondrion〕5、原生動(dòng)物線粒體〔ProtozoanMitochondrion〕6、一般標(biāo)準(zhǔn)〔Standard〕7、脊椎動(dòng)物線粒體〔VertebrateMitochondrion〕8、酵母線粒體〔YeastMitochondrion〕PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loadsequence根本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction引物設(shè)計(jì)界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為總分值每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But…引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowSomeotherusefulfunctionofPP5EnzymeMeltingtemperaturegraphPer25-merGC%graphPer25-merStabilityPer5-mer心肌特異性表達(dá)雙順?lè)醋虞d體的構(gòu)建PMYL2EcoRIpIRESneo－2質(zhì)?？寺U(kuò)增MYL2序列查詢及啟動(dòng)子功能分析不加酶切位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)基因組DNA制備高保真PCRCloning大量純化的MYL2promoter片段酶切獲得無(wú)promoter線性質(zhì)粒載體片段DNALigationReaction

轉(zhuǎn)入DH5aColonyScreeningPCRIdentification

MYL2promoterpIRESneopEGFP-c3質(zhì)?？寺U(kuò)增酶切獲取MYL2promoterPlasmidvector開環(huán)分子酶切獲得EGFP片段酶切及凝膠電泳鑒定及回收環(huán)狀DNA分子DNALigationReaction

環(huán)狀DNA分子轉(zhuǎn)入DH5aColonyScreeningPCRIdentification

rat原代胚胎心肌細(xì)胞培養(yǎng)及凍存MYL2promoterpIRES/neo/EGFP心肌細(xì)胞脂質(zhì)體熒光鑒定rat心肌細(xì)胞特異表達(dá)EGFP無(wú)綠色熒光蛋白表