植物組織中可溶性蛋白和MDA的測定

植物衰老生理1植物組織中可溶性蛋白和MDA的測定

一、實驗目的掌握植物組織中蛋白和丙二醛（MDA，malonyldialdehyde）提取掌握用比色法測定組織粗提液蛋白質和MDADevelopmentalsignalsEnvironmentalsignalsDisassemblyofcellularcontentsanddegradationofmacromoleculesCelldeathDecreaseinphotosynthesis,activationofsenescenceprogram二、實驗原理衰老是指細胞、器官或整個植株生理功能自然衰退，最終導致死亡的過程。衰老時的生理生化變化

蛋白質含量下降，生物膜降解，核酸含量的變化,光合速率下降,呼吸速率下降，植物內源激素的變化等。實驗原理植物葉片衰老過程中，葉綠素含量下降，葉色變黃，蛋白質含量減少（可溶性蛋白）。自由基代謝失調,并在體內積累膜脂過氧化的產物之一：MDA（一）可溶性蛋白測定的原理考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后，溶液的吸收光譜發(fā)生變化，從465nm偏轉到595nm，并表現出在595nm處的吸收值與溶液中的蛋白質含量有線性關系，其范圍從0~1000

g/ml。據此可制作蛋白質的標準曲線，牛血清蛋白為常用的標準蛋白。待測樣品經緩沖液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白質提取液與考馬斯亮藍G-250反應呈藍色。測定595nm吸收值，并根據蛋白質的標準曲線，得到樣品中可溶性蛋白的含量。（二）MDA測定原理MDA在高溫、酸性條件下與硫代巴比妥酸(TBA)反應，形成粉紅色復合物（3，5，5－三甲基噁唑2，4-二酮），該復合物在532nm處有最大吸收峰；600nm處是最小吸收峰，兩峰差值的消光系數為155(mM)-1cm-1。三、實驗步驟實驗材料：八仙繡球（一）植物組織中可溶性蛋白及MDA的提取稱葉齡差異明顯的葉片各0.50g，分別加入5ml磷酸緩沖液（50mmol，pH值為7.8），于冰浴中研磨成勻漿；各取1.5ml，在4C10000×g下離心10min，其上清液即為蛋白和MDA提取液。注意：磨樣時可一組磨老葉，一組磨新功能葉。離心前平衡（二）可溶性蛋白含量測定

取40l提取液+160l磷酸緩沖液于玻璃試管中，加入4.8ml考馬斯亮藍溶液，混勻后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色讀取OD值。對照為空白的磷酸緩沖液200l加上4.8ml考馬斯亮藍溶液。（三）MDA含量測定取上清液1.0ml于7ml離心管中,加硫代巴比妥酸（TBA）與三氯乙酸（TCA）混合液4.0ml，然后在離心管蓋上戳一小孔，92oC水浴保溫30min；空白管：1mL磷酸緩沖液+TBA與TCA混合液4.0ml，置92oC水浴30min，冷卻后，在8000×g離心5min;測定A532,A450和A600OD值。四、結果計算

（一）蛋白標準曲線的制作

蛋白質標準溶液的配制：稱取牛血清蛋白（電泳純）溶于0.15MNaCl溶液中，制成1mg/ml的母液，再用磷酸緩沖液配成各含0、40、80、120、160μg/200μl的牛血清蛋白的標準溶液。0~100

g/ml蛋白標準曲線的制作準確吸取0.2ml各含0、40、80、120、160μg牛血清蛋白的標準溶液，分別放入10ml的試管中，加入4.8ml考馬斯亮藍G-250蛋白染色試劑，混合后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色讀取OD值，制作通過原點的直線即為其標準曲線。（二）可溶性蛋白質含量的計算可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=標準曲線上查得的蛋白質量（μg

）×提取液體積/（測定加樣量*鮮重）（三）MDA含量計算公式L為比色杯厚度(cm)MDA(mM)=——————155xLA532-A600?????????Equ.1蔗糖對MBA-TBA反應有干擾，可用下式消除：MDA(μM)=6.45(A532-A600)-0.56A450

?????????Equ.2進一步求出單位鮮重植物組織中的MDA含量比較新老葉片可溶性蛋白和MDA的差異