免疫組織化學染色注意事項

免疫組織化學染色注意事項

李磊抗體的保存濃縮抗體，在有效期以內，一般只需放在普通4℃冰箱內保存，保存時間可達5-10年以上（免疫熒光試劑例外）。最好不要用塑料管分裝，因為塑料對抗體有吸附作用，用負20℃至負40℃低溫冰箱冷凍，由于凍融也會使抗體效價降低。而即用型抗體保存時間一般在一年以內。用PBS稀釋的抗體，一般可放置1個月，稀釋比越低，效價降低越快。非特異性找色的原因1、抗體稀釋度過高，導致切片深染。現(xiàn)象：無法分清細胞找色解決辦法：找出最佳的稀釋比陽性對照染色正常，受測組織染色陰性一、抗原修復不當。二、一抗與二抗檢測系統(tǒng)匹配錯誤三、實驗操作錯誤四、使用不合格的稀釋劑五、一抗選擇錯誤。六、一抗二抗檢測系統(tǒng)、顯色試劑被污染，失效或已超過有效期。七、二抗檢測系統(tǒng)與顯色試劑不匹配八、抗原含量過低九、試劑濃度過低，過高或不合適的孵育時間和溫度。陽性對照正常，受測組織染色弱一、固定液使用不當，破壞了組織的抗原二、組織經(jīng)固定和包埋后抗原被破壞。三、烤片溫度過高或時間過長。陽性對照和受測組織均為染色弱一、抗原修復方式不正確或遺漏，或者是修復時間、溫度、修復液的PH值沒有達到要求。二、過氧化物酶阻斷試劑阻斷或血清封閉時間過長，試劑濃度不合適。三、一抗，二抗檢測系統(tǒng)、顯色試劑濃度過高、過低或孵育時間過短。四、使用已超過有效期的試劑。五、孵育溫度過低。六、滴加試劑時，組織上的緩沖液（或血清）殘留過多，導致試劑滴加后被稀釋。七、復染液復染過度。八、重復使用抗原修復液。九、顯色試劑孵育時間過短或試劑配制錯誤。對照組織和受測組織，或在一些組織成分如脂肪、結締組織和上皮組織中有背景染色。一、抗原修復過度二、一抗?jié)舛冗^高，孵育時間過長，或孵育溫度過高。三、二抗檢測系統(tǒng)濃度過高，孵育時間過長或孵育溫度過高。四、顯色試劑孵育時間過長。五、PBS緩沖液重復使用多次或沖洗不足。六、使用錯誤的封閉血清。七、切片粘附劑過厚。受測組織和陰性對照玻片有背景染色，而陽性和陰性組織對照染色正常。一、組織固定不及時，造成部分抗原彌散并遺留在組織內。二、取材時，由于使用鈍的刀片，導致組織受到人為擠壓而變形，血清蛋白彌散并遺留在組織內。三、受測組織有部分壞死、損傷或壓迫成分。四、組織切片太厚。陰性試劑對照有背景染色，而陽性、陰性組織對照和受測組織染色正常。一、陰性對照血清濃度不合適。二、陰性對照血清被污染并與受測組織中的蛋白發(fā)生交叉反應。2、抗體不純或抗體特異性不強，交叉反應較多，或抗體表達較弱現(xiàn)象：陽性細胞和陰性細胞都著色，只是陽性細胞著色略強一些。像這類情況很難有好的辦法解決，可找一個背景著色較淺的試劑盒試一下，或用其它修復方法試試。組織染色灶狀背景染色一、裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，實驗過程中滴加試劑后不易沖洗干凈，導致染色過深。二、用于裱片的水浴鍋中的水質被細菌或酵母菌等污染。三、制作涂膠玻片時，濃度過高，干燥后在玻片留下白色小點，顯色時白色小點著色。色原顆粒未完全溶解。切片出現(xiàn)邊緣效應一、組織邊緣與玻片黏貼不牢，經(jīng)抗原熱修復或后續(xù)緩沖液沖洗后，造成邊緣組織松脫浮在玻片上方，每次沖洗時不易將組織下面的試劑洗干凈，導致此區(qū)域染色過深。二、滴加試劑時，試劑未充分覆蓋組織，導致組織邊緣無試劑或試劑很少，孵育時此區(qū)域容易首先變干，造成濃度較中心組織高而導致染色過深。切片出現(xiàn)“陰陽臉”著色一、滴加試劑時，試劑未完全覆蓋組織。二、試驗操作臺不平或孵育盒不平，導致切片有個傾斜度最終導致“陰陽臉”結果。三、滴加試劑到組織上時存在氣泡，卻沒有將氣泡除去。四、組織固定時間過短，造成中心部位固定不足。切片出現(xiàn)非特異的細胞核著色組織前期處理不適當，如組織在二甲苯中浸泡時間過長，固定液使用不當，組織變干，抗原修復液的PH值和修復時間不當或修復過程中修復液蒸發(fā)過多，造成最后部分組織沒有浸泡在修復液中。使用生物素二抗檢測系統(tǒng)時，組織中內源性生物素顯色這種非特異性顯色通常發(fā)生在高代謝器官組織中，當組織切片進行抗原修復后，組織中所含的內源性生物素同生物素二抗檢測系統(tǒng)中的鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶發(fā)生鏈接二造成非特異性顯色，顯色多位于胞漿中，且迷惑性極大。使用辣根過氧化物酶二抗檢測系統(tǒng)時，組織中內源性過氧化物酶顯色這種顯色通常發(fā)生在紅細胞，壞死組織，炎癥細胞中，是由于組織中所含的過氧化物沒有用相應的阻斷試劑阻斷或阻斷不完全。3、抗體本身的特異性異常表達從理論上說一種