如何迎接臨床基因診斷實驗室驗收

臨床基因診斷實驗室

技術準入的缺陷分析江蘇省臨床檢驗中心許斌1我國醫(yī)學實驗室管理國家實驗室認可委員會（CNAS）：依據-ISO15189；國家認可；自愿衛(wèi)生部執(zhí)業(yè)認證：《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》為加強醫(yī)療機構臨床實驗室管理，提高臨床檢驗水平，保證醫(yī)療質量和醫(yī)療安全，衛(wèi)生部出臺并決定自2006年6月1日起施行?！掇k法》包括總則、醫(yī)療機構臨床實驗室管理的一般規(guī)定、質量管理、安全管理、監(jiān)督管理、附則等六章五十六條。各省細則：《江蘇省醫(yī)院檢驗科建設管理規(guī)范》省、市臨床檢驗中心，強制，【體系+能力】2PCR實驗室技術準入依據和標準《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[2002]8號《臨床基因擴增檢驗實驗室現場技術驗收表》十章三十八款3美國NCCLS對NAT的法規(guī)(一)1993年─1995年12月（MM3-A,已批準）

NAT用于傳染病的規(guī)定2000年（MM1-A,已批準）

NAT用于遺傳病的規(guī)定2000年（MM5-P,審定中）

NAT用于血液病的規(guī)定2001年（MM6-P,審定中）

定量NAT用于傳染病的規(guī)定2001年（MM7-P,審定中）

原位雜交NAT用于遺傳病的規(guī)定4美國NCCLS對NAT的法規(guī)(二)2002年正在編寫中的

MM9NAT用于遺傳病的規(guī)定

MM10遺傳病的基因型鑒定

MM11

NAT用于細菌分裂

MM12點陣式NAT在臨檢中的應用方法

MM13

NAT的樣品制備

MM14

NAT的質控MM15NAT在“人類基因組”應用中的規(guī)定5●物理的:分區(qū)及單向流動、專用移液器、一次性試管架、紫外燈、PCR工作罩、濾芯吸嘴?！窕瘜W的：dUTP/UNGPCR產物防污染系統、DNA清潔液?！穹椒▽W的：即時Taqman法，Lab-on-a-chip芯片法，RTPCR一步法?！裰贫群筒僮饕?guī)范（維護保養(yǎng)、執(zhí)行）缺陷一、防污染意識和措施67固定移液器8易耗品9PCR方法學/防污染兩步法RNAcDNAPCR

一步法RNAPCR

CT(I-Cycler/7000/COBAS-Taqman)Taqman

動力學

(CaliperAG-9900自動加樣)LabonaChip封閉廢液孔RTTaqTth(RT+Taq)10擴增中以脫氧尿苷(dUTP)取代脫氧胸苷(dTTP)，擴增產物可被尿苷酶(UNG)消解，在經加熱處理，即在脫氧尿苷處斷裂，不再能作為模板被擴增。后續(xù)擴增進行之前在PCR反應體系中加入UNG處理，在預變性加熱后，可能的產物污染即被消除。PCR防污染UNG和dUTP防止“假陽性”的圖解這種“假陽性”是由于污染了前次PCR產物所致TAAAATTTTAAAAUUUPCRAAATUTAAAUUUAAAAAA*UNG加熱PCRUNG/dUTP系統11實驗室分區(qū)原則單一流向、明確的識別標記各區(qū)儀器設備物品配備的充分性和科學性防污染試劑準備室標本準備室擴增檢測室產物檢測室BIOTHREAT12分區(qū)13141516缺陷二、檔案管理儀器檔案（a）制造商名稱、型號、序號或其它唯一性標識；（b）儀器使用說明書或其復印件；（c）校準/檢測的日期和結果以及下次校準和/或檢測的日期；（d）迄今所進行的維護和今后維護計劃的細節(jié)；（e）損壞、故障、改裝或修理的歷史。人員檔案實驗室應保存其技術人員有關資格證書（如上崗證）、培訓、技能和經歷等技術檔案。17缺陷三、記錄內容形式保存18缺陷四、質量控制SOP文件的現行有效性儀器的標志及維護保養(yǎng)試劑及耗品的質檢19PCR檢測流程標本采集核酸提取基因擴增產物檢測采集的方法核酸的穩(wěn)定性保存分離方法*效率保存效率檢測方法*測定的線性*20DNA、RNA的濃度和純度測定及保存

此法準確、快速，且不損壞樣品?？蓽y出濃度低于2.5ug/ml的核酸。測定時將樣品作適度的稀釋。用紫外分光光度儀檢測，記錄280nm和260nm處的吸光度。280nm為蛋白吸收峰，260nm為核酸吸收峰。其中260nm處讀數用來計算樣品的核酸濃度。1、紫外分光光度法2110D/A260nm=50ug/ml雙鏈DNA10D/A260nm=33ug/ml單鏈DNA10D/A260nm=40ug/mlRNADNA總產量（ug）=

OD(A260nm)×50ug×稀釋倍數×樣品總體積DNA濃度（ug/ml）=

OD值(A260nm)×50×稀釋倍數提取RNA總產量（ug）=

OD值(A260nm)×40ug×稀釋倍數×樣品總體積RNA濃度（ug/ml）=

OD值(A260nm)×40×稀釋倍數222、瓊脂糖凝膠微型電泳法未知濃度的微量DNA片段可與已知濃度的DNA同時電泳，根據其結合的溴乙錠熒光強度其含量。電泳時各DNA的體積要準，否則會有誤差。233、純度檢查

天然DNA的吸光度比值為A260nm：A230nm：A280nm=1.0:0.450:0.515純DNA液的A260:A280:應為1.8-1.9。如比值低于1.6時，這提示有蛋白質和酚的污染，應進一步純化。244、RNA完整性檢查

常用變性的瓊脂糖電泳法檢查，常用的變性劑為甲醛、乙二醛和羥甲基汞。完整的RNA經變性電泳后能分離出核糖體RNA中的28S和18S，且EB的顯色強度應為2:1左右。如28S帶降低而18S帶增加則表示RNA標本有所降解。255、DNA、RNA的保存4℃是DNA保存的最佳和最簡單的條件之一。-70℃可能是長期保存的良好溫度。但解凍時DNA可產生缺口，因此不宜反復凍融。DNA在TE緩沖液中（10mmol/LTris-Hcl，1mmol/LEDTA，PH8.0），4℃儲存6個月以上，其中EDTA還可抑制微生物生長。RNA容易降解，操作和儲存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高壓滅菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過的蒸餾水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制劑（RNasin），終濃度為2U/10μl，置-20℃保存?zhèn)溆谩?6血清標志物用于

疾病診斷、流行病調查

基因檢測用于

療效監(jiān)控、預后判斷27HIV抗體篩查試驗流程圖

28肝炎診斷檢測路線29英國HBV血清學診斷的SOP(V.SOP6)30實驗室檢測抗-HCV程序抗-HCVEIA陰性報告RR陽性S/CO比值<3.8抗-HCVRIBAHCVRNANAT陰性其他結果評價(如NAT、ALT)陰性陽性可疑陽性RR陽性S/CO>3.8或報告報告報告報告報告3132我們如何選擇合適的替代終點以合理考評療效?

HBsAg消失 -完全應答

HBVDNA清除或抑制 -病毒學應答

‘e’血清轉化（HBeAg消失+抗HBe產生） -病毒學應答

ALT恢復正常 -生化應答

肝臟組織學表現 -組織學應答

還是聯合應答？3334HBVDNA清除或抑制？優(yōu)點:

HBVDNA抑制表示HBV復制的抑制水平，與HBeAg消失和/或ALT恢復正常相關。缺點:不可能完全清除,不能反映持續(xù)應答抑制程度:105(AASLDguideline)還是104(AGAPanelrecommendation*)?檢測沒有國際單位:無法采用標準化單位報告結果（copies/mL、pg/mL、meq/mL、logdrop）敏感性不同阻礙了對治療效果的比較*PhairJNATURALHISTORY,DIAGNOSTICS,ANDCLINICALPROFILESOFPERSONSWITHCHRONICHEPATITISB35核酸檢測要點靈敏度，<50copy/ml特異性分型突變定量的一致性療效觀察、驗證診斷36定量PCR技術定量是通過比較參考標準37標準品（Panel）SDA:

參照WHOHBVStandard

英國NIBSC(97/746)Adw

106IU/ml等于2.65×106拷貝/毫升

PanelNo:L0L1L2L3L4L5

CNCCL:HBVDNA1PanelNo:1，2，3，4，5國家標準局基質問題：基質(Matrix)

真實血樣：樣品純度和抑制劑38PCR定量方法的比較39技術要素5.3(14條)

-檢測儀器覆蓋分析所有過程的品種、數量滿足要求可控狀態(tài)：標志、檔案、狀態(tài)、使用安全5.3.2設備（在安裝時及常規(guī)使用中）應顯示出能夠達到規(guī)定的性能標準，并且符合相關檢驗所要求的規(guī)格。實驗室管理層應建立程序，用于定期監(jiān)測并證實設備、試劑及分析系統已適當校準并處于正常功能狀態(tài)。同時還應有文件化的預防維護程序并記錄，該程序至少應遵循制造商的建議。40性能、狀態(tài)評價—校驗或檢定（物理參數）VERIFICATION-驗證、證明、檢驗、證據—翻譯為校驗更準確！

查明和確認計量器具是否符合法定要求的活動，他包括檢查、加標志和（或）出具檢定證書。校準-CALIBRATION（校準、標定、標準化、測量的尺度）在規(guī)定的條件下，為確定測量儀器（測量系統）所指示的值，與對應的由測量標準所復現的值之間關系的一組操作。41校驗周期與內容頻度：首次（新安裝）；

后續(xù)（主要部件維修，強制周期如每年，不定期）內容：血細胞分析儀：背景計數、精密度及攜帶污染在說明書規(guī)定的范圍內（如儀器無規(guī)定，精密度應小于室間質評允許范圍的1/4，攜帶污染小于2%）全自動生化分析儀：加樣準確度、攜帶污染率，溫控，吸光度零點漂移、雜閃光、準確度、重復性、線性等儀器說明書標示的指標在規(guī)定范圍內PCR儀：溫度準確度及升降速率；熒光本地；激發(fā)及吸收波長的準確度、雜閃光、重復性、線性42434445需要校驗的儀器設備溫濕度計：環(huán)境、冰箱、冷庫等加樣設備：移液器、血沉管等制水機分析儀器46檢測儀器狀態(tài)維持—維護保養(yǎng)保養(yǎng)程序、操作手冊嚴格按照儀器使用手冊編寫，包括日、周、月、季、半年、年標識（時間、名稱）記錄4748（檢）測室內質控的SOP：耗品質檢試劑質檢質控方法（糾錯措施）質控圖室間質評的SOP：糾偏措施49室內質控質控目的：假陰性、假陽性，準確性、精密度質控點：樣本質量、模板提取、擴增效率質控物安排：空白、陰對、弱陽對、標準品控制范圍：空白、陰對-------陰性弱陽對-------陽性（上下一次方）標準品-------r值（二個9）斜率（-3.5----4.0）截距（-40左右）點間CT值（3.3左右）50如何確定CT值閾值（Threshold）的作用閾值CT閾值高度標準偏差閾值=基線信號的標準偏差×1051如何確定閾值基線的作用（Baselinecycles）

消除檢測中背景熒光信號的影響，確定閾值基線的范圍：儀器一般默認的范圍PE-5700、PE-70003-15iCycle2-10LightCycle3-12基線需根據實驗結果進行適當調整：延長基線以包括最高濃度樣本擴增曲線起跳前盡可能多的循環(huán)，可以使擴增曲線更平滑、數據也得到一定改善。

5253閾值線熒光閾值線的調整

需根據實驗結果進行適當調整1、落在陰性對照線最高點上方2、外標準擴增曲線的均一位置（點間CT3.3左右）3、盡量接近擴增曲線剛真正進入指數擴增期的位置（避免弱陽性漏檢以及一些擴增反應影響因素在指數期的放大）549.522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E+29.276E+11.085E+1H2O1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2O55ThresholdCycleCalculation:BaselinecyclesThroughThresholdPosition21420.856標準曲線

通過基線和熒光域值線的調整應達到：

相關系數（r值）≥0.99斜率-3.0----4.0截距-40±4

（這些參數根據儀器和試劑有所不同）57室內質控由實驗室工作人員采用一系列統計學的方法連續(xù)地評價檢測工作的可靠程度，判斷檢驗報告是否可以發(fā)出的過程。目的是控制本實驗室測定工作的精密度，監(jiān)測其準確度的改變，提高常規(guī)檢驗工作的批間、批內標本檢測結果的一致性。58質控血清人血清基質，分布均勻；

無傳染性；添加劑和調制物的數量少；瓶間變異?。粌龈善菲鋸腿芎蠓€(wěn)定；到實驗室后的有效期應在1年以上液體血清較優(yōu)不用定值血清，而推薦用價廉的未定值血清59

在開始進行質控時，只需要有3個質控血清測定值即可進行質控。當這組數據擴大到20次有效值時就可以計算RCV的X，s。方法：（1）先將測定值從小到大排列，X1最小，Xn最大；（2）計算X和s；（3）計算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S對照SI表，檢查是否出控，SI上、下限≤規(guī)定值，在控；

SI上或下限>規(guī)定值，失控?！凹纯绦浴辟|控：60SI值表（即刻性質控）N34567891011

N(3s)1.151.491.751.942.102.222.322.412.48N(2s)1.151.461.671.82