腫瘤干細胞的分離與鑒定

【腫瘤干細胞的分離與鑒定

】專業(yè)010203目錄1腫瘤干細胞的特性腫瘤干細胞分離腫瘤干細胞鑒定04幾種常見腫瘤干細胞的分離與鑒定010203目錄2腫瘤干細胞的特性腫瘤干細胞的分離腫瘤干細胞的鑒定04幾種常見腫瘤干細胞的分離與鑒定01腫瘤干細胞特性3具有無限增殖和分化潛能12

345678比例小具有高端粒酶活性抗凋亡家族蛋白過表達DNA修復(fù)能力顯著增強長時間處于G0期處于低氧環(huán)境中表達干細胞特異標(biāo)志物01腫瘤干細胞特性（1）具有無限增殖和分化潛能4腫瘤的發(fā)生是一個長期的突變積累過程，在皮膚及腸黏膜上皮等腫瘤的高發(fā)部位，衰老細胞不斷地死去并脫離機體，只有干細胞是唯一可以長期存在的細胞，有可能積累多次突變而生成腫瘤干細胞，進而最終形成腫瘤[PMID:20420952]。01腫瘤干細胞特性（2）比例小5腫瘤干細胞主要通過兩種方式分裂：一種是對稱分裂，即形成兩個相同的腫瘤干細胞或兩個相同的分化腫瘤細胞；另一種是非對稱分裂，即腫瘤干細胞分裂后形成的兩個細胞中有一個細胞不可逆地走向分化的終端成為功能專一的分化腫瘤細胞，而另一個保持親代的特征，仍作為腫瘤干細胞保留下來。由于這種類似于干細胞的分裂方式，低密度的腫瘤干細胞能在維持自身數(shù)量的同時產(chǎn)生出分化的腫瘤細胞[PMID：19194462]。01腫瘤干細胞特性（3）具有高端粒酶活性6高活性的端粒酶可抑制細胞增殖過程中端粒長度的縮短，延長腫瘤干細胞的增殖壽命，這為腫瘤干細胞的不斷增殖和分化提供了基礎(chǔ)條件[PMID:20420952]。01腫瘤干細胞特性（4）抗凋亡家族蛋白過表達7研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤干細胞中抗凋亡基因Bcl-2的表達量顯著增加，從而啟動腫瘤干細胞內(nèi)抗凋亡程序，阻斷Bid和Bad等促凋亡蛋白引起的線粒體凋亡途徑，并進一步阻斷胱天蛋白酶凋亡途徑，防止腫瘤干細胞發(fā)生凋亡[PMID:20394737]。01腫瘤干細胞特性（5）DNA修復(fù)能力顯著增強8研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞內(nèi)與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶等酶蛋白的合成增加、活性增強，增強了腫瘤干細胞的抗DNA損傷能力，使得腫瘤干細胞可逃避以DNA損傷為主的腫瘤治療手段[PMID:11751422]。01腫瘤干細胞特性（6）長時間處于G0期9臨床上普遍使用的化療藥物主要是針對增殖旺盛的腫瘤細胞進行殺傷，處在G0期的大多數(shù)腫瘤干細胞能逃避傳統(tǒng)腫瘤治療方法的殺傷，一旦時機成熟或停止用藥，它們便成為復(fù)發(fā)的根源[PMID:23358473]。01腫瘤干細胞特性（7）處于低氧環(huán)境中10腫瘤干細胞通常位于由發(fā)育良好的三維細胞外基質(zhì)包裹的低氧環(huán)境中，這些細胞外基質(zhì)起到很好的屏障作用，盡可能避免了腫瘤干細胞接觸到抗腫瘤藥物。同時由于射線引起的DNA損傷需要氧氣，所以腫瘤干細胞所處的低氧環(huán)境使得放療對腫瘤干細胞的殺傷作用也非常局限舊。[PMID:15170446]01腫瘤干細胞特性（8）表達干細胞特異標(biāo)志物11這些特異性蛋白或標(biāo)志物在腫瘤干細胞的增殖、腫瘤干細胞分化成腫瘤組織周圍所必須的血管等組織、腫瘤干細胞的遷移等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。利用這些特異性的表面標(biāo)志物達到腫瘤干細胞分離或鑒定的目的。02腫瘤干細胞分離1212345免疫磁珠分選（MACS）流式細胞分選（FACS）根據(jù)生物學(xué)特性分離旁群細胞分選法(SP)無血清培養(yǎng)基分選法(SFM)02腫瘤干細胞分離（1）免疫磁珠分選（MACS）13MACS是基于腫瘤干細胞表面特異性抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，之后在外部磁場的作用下，連接有單克隆抗體磁珠的腫瘤干細胞停留在磁場中，而無特異性表面抗原的腫瘤細胞則不能與免疫磁珠結(jié)合，因而不能在磁場中停留，從而得以分離出腫瘤干細胞。[PMID：30009677]。02腫瘤干細胞分離（2）流式細胞分選（FACS）14FACS是通過將待分選的腫瘤細胞和腫瘤干細胞用同一種或多種熒光素標(biāo)記的特異性抗體標(biāo)記，根據(jù)腫瘤干細胞與腫瘤細胞結(jié)合熒光素標(biāo)記抗體能力的差異，通過流式細胞儀將腫瘤干細胞分選出來的方法。[PMID：27517564]。02腫瘤干細胞分離（2）流式細胞分選（FACS）1402腫瘤干細胞分離（3）根據(jù)生物學(xué)特性分離15根據(jù)腫瘤干細胞具有的某些生物學(xué)特性將腫瘤干細胞分離篩選出的方法。如可以通過細胞核對核染料的拒染性質(zhì)、腫瘤干細胞體外培養(yǎng)所需的特殊條件等特性，分離出腫瘤干細胞[PMID:14711994]

。02腫瘤干細胞分離（4）旁群細胞分選法(SP)16腫瘤干細胞具有對核染料Hoechst33342拒染的特性。Hoechst33342是一種核酸染料，在紫外光激發(fā)下可發(fā)出藍色熒光(波長450nm左右)和紅色熒光(波長650nm左右)，腫瘤干細胞可將染料外排，而不發(fā)出熒光，從而可將這類旁群細胞分離出來。[PMID:14711994]。02腫瘤干細胞分離（5）無血清培養(yǎng)基分選法(SFM)17在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入特定的生長因子和細胞添加劑，使絕大多數(shù)腫瘤細胞由于缺乏生長所必須的血清成分而停止生長，經(jīng)長時間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細胞則可以在含特定生長因子和添加劑的無血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長，經(jīng)幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤于細胞的腫瘤細胞球在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入特定的生長因子和細胞添加劑，使絕大多數(shù)腫瘤細胞由于缺乏生長所必須的血清成分而停止生長，經(jīng)長時間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細胞則可以在含特定生長因子和添加劑的無血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長，經(jīng)幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤于細胞的腫瘤細胞球。[PMID:14645703]

。02腫瘤干細胞分離（6）聯(lián)合多種方法分離18在目前的研究中，腫瘤干細胞的分離并不是采用單一的方法，而是選用兩種或者兩種以上的分離方法，以獲得數(shù)量更多、純度更高的腫瘤干細胞。0103目錄19腫瘤干細胞特性腫瘤干細胞的鑒定04幾種常見腫瘤干細胞的分離與鑒定02腫瘤干細胞的分離03腫瘤干細胞的鑒定20123利用腫瘤干細胞特異性表面標(biāo)志物進行鑒定異種移植成瘤性實驗鑒定腫瘤干細胞的其他鑒定方法03腫瘤干細胞鑒定(1)利用腫瘤干細胞特異性表面標(biāo)志物進行鑒定21目前，腫瘤干細胞最為廣泛且可靠的鑒定方法就是利用腫瘤干細胞特異性表面標(biāo)志物。將分離出的腫瘤干細胞通過免疫組織化學(xué)法、流式細胞檢測技術(shù)等方法測定陽性或陰性細胞表面標(biāo)志物表達情況，進而鑒定是否是腫瘤干細胞。下表為幾種已鑒定出的腫瘤干細胞特異性表面標(biāo)志物。03腫瘤干細胞鑒定(1)利用腫瘤干細胞特異性表面標(biāo)志物進行鑒定22腫瘤干細胞特異性表面標(biāo)志物PMID急性粒細胞白血病CD34+/CD38-[PMID:7509044]乳腺癌Lineage-/CD24-(lower)/CD44+,ALDH1+[PMID:

20630801]

[PMID:12629218]胰腺癌CD133+,CD24+/CD44+/ESA+[PMID:

17283135]肺腺癌CD133+[PMID:18049477]神經(jīng)膠質(zhì)瘤CD133(AC133)+[PMID:

14522905]胃腸道癌CD133+,CD44+/EpCAM(high）[PMID:

21448722]

[PMID:

17122772

]肝癌CD90+,CD133+[PMID:

18242515]黑色素瘤ABCB5+[PMID:18202660]腎癌CD105+[PMID:

18614581

]卵巢癌CD44+/CD117+,CD133+,CD44+/MYD88+[PMID:

19158483][PMID:

18836486]子宮內(nèi)膜癌CD133+[PMID:

20089663]03腫瘤干細胞鑒定23將分離出的腫瘤于細胞，制備成細胞懸液后種植到異種動物體內(nèi)，如將人的腫瘤干細胞接種于NOD/SCID小鼠體內(nèi)，觀察其能否形成腫瘤病灶，且異種動物體內(nèi)形成的腫瘤病灶在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上與原發(fā)腫瘤病灶類似，則可鑒定為腫瘤干細胞。一般來說，腫瘤干細胞形成腫瘤病灶所需的細胞密度比普通腫瘤細胞要小。(2)異種移植成瘤性實驗鑒定03腫瘤干細胞鑒定23(2)異種移植成瘤性實驗鑒定03腫瘤干細胞鑒定24對于腫瘤干細胞的鑒定，還可通過腫瘤干細胞具有的類干細胞特性進行鑒定。如根據(jù)腫瘤干細胞核對核染料拒染(如Hoechst33342染料)的性質(zhì)進行鑒定；根據(jù)腫瘤干細胞長期處于靜止?fàn)顟B(tài)的特性，應(yīng)用溴脫氧尿嘧啶核苷法進行鑒定和軟瓊脂克隆形成實驗鑒定等。(3)腫瘤干細胞的其他鑒定方法01目錄26腫瘤干細胞的特性04幾種常見腫瘤干細胞的分離與鑒定02腫瘤干細胞的分離03腫瘤干細胞的鑒定04幾種常見腫瘤干細胞的分離與鑒定12肝癌腫瘤干細胞膠質(zhì)瘤干細胞273結(jié)腸癌腫瘤干細胞01肝癌腫瘤干細胞（LCSCs）分離2501肝癌腫瘤干細胞（LCSCs）分離2801肝癌腫瘤干細胞（LCSCs）鑒定29指標(biāo)：Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4qRT-PCR/WB免疫熒光02膠質(zhì)瘤干細胞（GSCs）分離流式細胞儀分選（方法略[PMID：29535786]）分離的原代GBM細胞培養(yǎng)于DMEM和Ham’sF-12培養(yǎng)基中，并補充10%胎牛血清，37℃融合培養(yǎng)。融合原代GBM細胞用0.25%胰蛋白酶和0.25%EDTA溶液消化后用神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（NBM），輔以B27（1X；GiBCO），肝素（2ug/ml），bFGF（20ng/ml，Sigma、美國）和EGF（20ng/ml，Sigma，美國）置于24孔板中進行成球培養(yǎng)。當(dāng)膠質(zhì)球直徑達到100um時，收集膠質(zhì)球并用流式細胞術(shù)、免疫熒光染