微生物的生長及其控制

微生物的生長及其控制一、微生物的生長個體生長：同化作用速度超過異化作用，原生質(zhì)總量（重量、體積、大小）不斷增加，出現(xiàn)個體生長。個體生長個體繁殖群體生長群體生長=個體生長+個體繁殖微生物學(xué)中的“生長”均指群體生長。1、測定生長量的方法直接法間接法直接法測體積：適用于菌量大的樣品，初步比較用。待測培養(yǎng)液置于刻度離心管中→沉降或離心→計算菌體體積（包括細(xì)胞體積和細(xì)胞之間的空隙體積）稱干重：適用于菌量大的樣品。離心法：離心→干燥[100~105℃或紅外線烘干或真空干燥（40℃或80℃）]→稱干重過濾法：過濾（濾紙或醋酸纖維膜過濾）→洗滌→真空干燥（40℃）→稱干重間接法比濁法原生質(zhì)含量↑→培養(yǎng)液濁度↑用分光光度計測出待測培養(yǎng)液的濁度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出菌體濃度，結(jié)果為相對值。不適用于含非細(xì)胞固形物多的樣品和絲狀微生物。生理指標(biāo)法：測含氮量，含碳量，P、DNA、RNA、ATP、DAP、N-乙酰胞壁酸的含量。LimitationsofturbiditycountIndirectcountingDeadcellsandlivingcellsarenotdistinguishedParticlesinculturedisturbmeasurementNotgoodathighconcentrations2、Totalcounts（全菌計數(shù)法）血球計數(shù)板法（countingchamber）：常規(guī)方法用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。LimitationsofmicroscopiccountDeadcellsandlivingcellsareallcountedSmallcellsaredifficulttocountNeedhighcellconcentration,106cells/ml血球計數(shù)板1個大方格分為25個中方格，每個中方格分為16個小方格1個大方格分為16個中方格，每個中方格分為25個小方格計數(shù)室容積=1×1×0.1mm31ml菌液中的總菌數(shù)=×25×104×稀釋倍數(shù)

1ml菌液中的總菌數(shù)=×16×104×稀釋倍數(shù)計菌器3、Viablecounts（活菌計數(shù)法）Platecounting（平板菌落計數(shù)法）：不適用于嚴(yán)格厭氧菌Spread-platemethod（平板表面涂布法）Pourplatemethod（瓊脂培養(yǎng)基澆注法）LimitationsofplatecountingToomanyvariablesInoculumsizeSuitabilityofmediumIncubationconditionsLengthofincubationSizeofcoloniesSinglecolonymayarisefrommorethanonecell-cellclumpcfu/ml：colony-formingunit/ml4、酵母活細(xì)胞計數(shù)美藍(lán)染色法活細(xì)胞無色，死細(xì)胞為蘭色。原理：美藍(lán)是一種弱氧化劑，氧化態(tài)呈蘭色，還原態(tài)呈無色?；畹慕湍讣?xì)胞因新陳代謝的不斷進行，具有一定的還原能力，能將進入細(xì)胞的美藍(lán)還原，而細(xì)胞不被染色。二、同步生長1、獲得同步生長的方法同步生長：細(xì)胞群體處于分裂步調(diào)一致的狀態(tài)。獲得同步生長的方法：誘導(dǎo)法：改變環(huán)境條件，用控制溫度、光線、培養(yǎng)基成分、或者用能夠影響細(xì)胞周期中主要功能的代謝抑制劑等條件，誘導(dǎo)同步生長。機械篩選法：選擇性過濾法、密度梯度離心法或膜洗脫法等。原理：在非同步生長的微生物中，微生物處于不同的生長階段，體積、大小和重量不一，可用不同孔徑的濾膜過濾或密度梯度離心，選出同一生長階段的微生物。2、同步生長曲線—階躍性曲線Bycarefulselectionofcellsthathave

justdivided,abacterialpopulationcanbe

synchronizedinthebacterialcelldivisioncycle.

Synchronycanbemaintainedforonlyafewgenerations.

Thesynchronousgrowthofabacterial

population.

三、微生物的生長曲線單細(xì)胞微生物的典型生長曲線把少量純種單細(xì)胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中后，在適宜的條件下，它們的群體就會有規(guī)律的生長起來。以細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)值作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間作橫坐標(biāo)，就得到微生物的典型生長曲線。根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)R不同，可分為：Lagphase（延滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期）Exponentialphase（指數(shù)期、對數(shù)期）Stationaryphase（穩(wěn)定期、平衡期）Deathphase（衰亡期）1、Growthcurve-lagphase特點生長速率常數(shù)R=0細(xì)胞形態(tài)變大或增長細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈堿性。合成代謝活躍，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。對外界不良條件反應(yīng)敏感。影響因素菌種特性接種齡接種量培養(yǎng)基成分2、Growthcurve-exponentialphase特點：R最大，增代時間（代時G）或倍增時間最短。細(xì)胞進行平衡生長，菌體內(nèi)各種成分最為均勻。酶系活躍，代謝旺盛。特征參數(shù)繁殖代數(shù)n：n=3.322(lgx2–lgx1)生長速率常數(shù)R：R=n/(t2–t1)=3.322(lgx2–lgx1)/(t2–t1)代時G：G=1/R=(t2–t1)/3.322(lgx2–lgx1)

影響因素菌種特性營養(yǎng)成分營養(yǎng)物濃度培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度的影響E.coli在不同溫度下的代時溫度℃代時溫度℃代時108603522151204017.520904520254047.57730293、Growthcurve-stationaryphase特點：R=0，菌體產(chǎn)量達到最高點。細(xì)胞開始儲存糖原、異染顆粒和脂肪等儲藏物。以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物的最佳收獲期。穩(wěn)定期到來的原因營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡；營養(yǎng)物的比例失調(diào)；有害代謝產(chǎn)物累積；pH、氧化還原電勢等物化條件不適宜。4、Growthcurve-deathphase特點：個體死亡速度>新生速度，群體呈現(xiàn)負(fù)生長；細(xì)胞形態(tài)多樣；細(xì)胞產(chǎn)生自溶；產(chǎn)生或釋放抗生素；芽孢桿菌中芽孢的釋放。衰亡期到來原因：環(huán)境條件越來越不利，從而引起細(xì)胞內(nèi)分解代謝大大超過合成代謝，導(dǎo)致菌體死亡。5、Theapplicationofgrowthcurve縮短lagphase，以縮短發(fā)酵周期；取exponentialphase的種子接種延長exponentialphase，有利于形成大量的微生物細(xì)胞；采用連續(xù)培養(yǎng)延長stationaryphase，有利于代謝產(chǎn)物積累；根據(jù)細(xì)胞內(nèi)含物判斷菌齡；根據(jù)生長期控制培養(yǎng)條件。四、連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)：當(dāng)微生物以單批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)到指數(shù)期的后期時，一方面以一定速度連續(xù)流進新鮮培養(yǎng)基，并立即攪拌均勻；另一方面，利用溢流的方式，以同樣的流速不斷流出培養(yǎng)物。這樣，培養(yǎng)物就達到動態(tài)平衡，其中的微生物可長期保持在指數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率上。連續(xù)培養(yǎng)器的類型

內(nèi)控制（控制菌體濃度）：恒濁器

外控制（控制培養(yǎng)液流速，以控制生長速率）：恒化器

單級連續(xù)培養(yǎng)器

多級連續(xù)培養(yǎng)器

一般連續(xù)培養(yǎng)器

固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)器

實驗室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器

發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐按控制方式分按培養(yǎng)器的級數(shù)分按細(xì)胞狀態(tài)分按用途分恒濁器恒濁器（turbidostat）：根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，并借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)器。恒化器恒化器（chemostat）：一種設(shè)法使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)裝置。恒濁器與恒化器的比較裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度無限制不恒定最高速率大量菌體生產(chǎn)為主（內(nèi)控制）生長因子或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物恒化器培養(yǎng)基有限制恒定低于不同生長實驗室流速生長因子最高速率速率菌體為主（外控制）連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點優(yōu)點高效節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽自控產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定連續(xù)培養(yǎng)的缺點缺點菌種易于退化易遭雜菌污染營養(yǎng)物的利用率低五、影響微生物生長的主要因素溫度氧氣pH滲透壓和水活度1、Temperature

最低生長溫度：一般為-5~-10℃，極端為-30℃嗜冷菌：＜20℃生長溫度最適生長溫度中溫菌：20~45℃嗜熱菌：＞45℃最高生長溫度：一般為80~95℃最適生長溫度：分裂代時最短或生長速率最高時的培養(yǎng)溫度。最適生長溫度≠發(fā)酵速度最高時的培養(yǎng)溫度≠代謝產(chǎn)物量最高時的溫度≠生長量最高時溫度微生物各生理過程的不同最適溫度菌名生長溫度℃發(fā)酵溫度℃累積產(chǎn)物溫度℃嗜熱鏈球菌374737乳酸鏈球菌3440產(chǎn)細(xì)胞：25~30產(chǎn)乳酸：30灰色鏈霉菌3728—北京棒桿菌3233~35—丙酮丁醇梭菌3733—產(chǎn)黃青霉3025202、O2根據(jù)微生物與氧的關(guān)系，可分為：

專性好氧菌：在正常大氣壓（0.2巴）下好氧呼吸產(chǎn)能以呼吸為主，兼營發(fā)酵產(chǎn)能好氧菌兼性厭氧菌以呼吸為主，兼營厭氧呼吸產(chǎn)能微好氧菌：只能在0.01~0.03巴的大氣壓下生活耐氧菌：不需氧，只能以發(fā)酵產(chǎn)能，但氧無毒害厭氧菌（專性）厭氧菌：氧有害或致死，以發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能O2+eO2

.2O2

.+2H+H2O2+O2

NADH2NAD

SOD好氧生物及耐氧菌過氧化氫酶好氧生物過氧化物酶耐氧菌H2O+?O2

2H2O厭氧菌的氧毒害機制3、pHpH：-lg[H+]，指外界環(huán)境的pH值嗜堿微生物最適生長pH值偏于堿性（如多數(shù)放線菌）耐堿微生物微生物（如鏈霉菌）嗜酸微生物最適生長pH值偏于酸性（多數(shù)真菌）耐酸微生物（乳酸桿菌）不同微生物的生長pH范圍微生物pH值最低最適最高氧化硫硫桿菌0.52.0~3.56.0嗜酸乳桿菌4.0~4.65.8~6.66.8大豆根瘤菌4.26.8~7.011.0褐球固氮菌4.57.4~7.69.0一種亞硝化單胞菌7.07.8~8.69.4醋化醋桿菌4.0~4.55.4~6.37.0~8.0金黃色葡萄球菌4.27.0~7.59.3泥生綠菌6.06.87.0水生棲熱菌6.07.5~7.89.5黑曲霉1.55.0~6.09.0一般放線菌5.07.0~8.010.0一般酵母菌3.05.0~6.08.0

幾種抗生素產(chǎn)生菌的生長與發(fā)酵的最適pH

抗生素產(chǎn)生菌生長最適pH合成抗生素最適pH灰色鏈霉菌6.3~6.96.7~7.3紅霉素鏈霉菌6.6~7.06.8~7.3產(chǎn)黃青霉6.5~7.26.2~6.8金霉素鏈霉菌6.1~6.65.9~6.3龜裂鏈霉菌6.0~6.6 5.8~6.1灰黃青霉6.4~7.06.2~6.5pH微生物在生命活動過程中，會改變外界環(huán)境中的pH值。糖類發(fā)酵、氧化有機酸有機物脂肪水解有機酸培養(yǎng)基內(nèi)蛋白質(zhì)脫羧胺類中性成分(NH4)2SO4NH4+選擇吸收H2SO4無機鹽

NaNO3NO3-選擇吸收NaOHpH調(diào)節(jié)方法

過酸時：加NaOH、Na2CO3等堿中和過堿時：加H2SO4、HCl等酸中和加適當(dāng)?shù)矗喝缒蛩?、NaNO3、過酸時NH4OH或蛋白質(zhì)等“治本”提高通氣量過堿時加適當(dāng)碳源：糖、乳酸、甘油等降低通氣量加磷酸緩沖液（K2HPO4—KH2PO4）

加CaCO3或NaHCO3“治標(biāo)”外源調(diào)節(jié)內(nèi)源調(diào)節(jié)六、有害微生物的控制幾個基本概念滅菌：采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物（包括病原微生物和非病原微生物）永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施。消毒：采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。如：巴氏消毒法。防腐：利用某種理化因素（低溫、缺氧、干燥、高滲、高酸度、防腐劑）完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。無菌：沒有活的微生物存在，如無菌操作，無菌空氣?；煟豪镁哂懈叨冗x擇毒力，（即對病原菌具有高度毒力而對宿主無顯著毒性）的化學(xué)物質(zhì)（抗生素、磺胺類）來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達到治療該傳染病的措施。PhysicalwaysHeatsterilization(includingautoclaveandpasteurization)Radiation(microwaves,UV,X-rays,γ-raysandelectrons)Filtration(depthfilter,membranefilterandnucleationtrack(nucleopore)filter)（一）HeatsterilizationCardinaltemperaturesforgrowthHightemperaturesoveroptimumforgrowthcontrolDenaturationathightemperature-theloseofstructureandabilitytofunctionofmacromolecules（大分子）ProteinsarethemostheatsensitiveamongthefourkindsofmacromoleculesHigherorderstructureswillbeeffectedfirstHeatdenaturationofproteinsFactorsaffectingefficiencyofheatsterilizationPresenceofendospores（芽孢）determinestheheatingprocess-temperatureandtime；Moistheathasbetterpenetratingpowerthandryheat；MicrobialcellsdiemorequicklyatacidicpH；Drycellsandsporesaremoreresistanttoheat；Higherconcentrationsofproteins,sugarsandfatsreduceheatpenetration.一些細(xì)菌芽孢干熱滅菌所需時間菌名不同溫度下的殺死時間（分）120℃130℃140℃150℃160℃170℃180℃炭疽桿菌——18060~1209~90—3肉毒梭菌1206015~602520~2510~155~10產(chǎn)氣莢膜梭菌5015~355————破傷風(fēng)梭菌—20~405~15301251土壤細(xì)菌芽孢———18030~9015~6015一些細(xì)菌芽孢濕熱滅菌所需時間菌名不同溫度下的殺死時間（分）100℃105℃110℃115℃120℃125℃130℃134℃炭疽桿菌2~155~10——————枯草桿菌數(shù)小時——40————腐敗厭氧菌78017041155.6———破傷風(fēng)梭菌5~905~25——————產(chǎn)氣莢膜梭菌5~455~2710~1541———肉毒梭菌300~53040~12032~9010~404~20———一種土壤細(xì)菌數(shù)小時420120156~304—1.5~10一種嗜熱菌—400100~30040~11011~353.9~83.51產(chǎn)孢梭菌1504512—————

1、干熱滅菌法火焰灼燒法：直接在火焰上灼燒滅菌。適用范圍：接種針（環(huán)），試管口，三角瓶口，金屬小工具。干熱滅菌法烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法：160℃2h，適用于耐高溫器皿。注意：溫度不可超過180℃，超過180℃，玻璃器皿上的棉塞及外面包的紙張均會被烤焦著火。由于熱空氣穿透力弱，滅菌時物品不宜堆放得太緊。降溫要緩慢，以免玻璃破裂，待溫度＜60℃時，方可打開箱門。2、濕熱滅菌法煮沸消毒法：一般用于飲用水的消毒，100℃下煮沸數(shù)分鐘。間歇滅菌法：適用于不耐熱培養(yǎng)基。

80~100℃15~60min室溫或37℃過夜巴氏消毒法（Pasteurization）加壓滅菌法（Autoclave）培養(yǎng)基徹底滅菌重復(fù)三次（1）Pasteurization（巴氏消毒法）Namedafterthegreatmicrobiologist-LouisePasteurKillingofnon-sporeformingbacteriainheatsensitivematerialsRemovalofpathogens（病原體）RemovaloffoodspoilagebacteriaKeepingqualityofthematerialsMilkpasteurizationFlashpasteurization-71oC,15secBulkpasteurization-63-66oC,30min（2）Autoclave（加壓蒸汽滅菌法）MoistheatingunderpressurePressure-1.1kg/cm2Temperature-121oCSterilizationtimeundertheseconditions-10-15min(longertimeneededforpenetrationoftheseconditionsintointeriorsofobjects)FactorsaffectingefficiencyofAutoclavingsterilization滅菌物體的含菌量：含菌量↑，滅菌時間↑滅菌對象的pH：pH<6，微生物易死亡；pH6.0~8.0，微生物不易死亡滅菌對象的體積：影響熱傳導(dǎo)率加熱與散熱速度滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響：加壓蒸汽滅菌不是靠蒸汽壓力，而是靠蒸汽溫度，滅菌時要先排盡鍋內(nèi)空氣，否則壓力表上壓力=鍋內(nèi)水蒸汽壓力+空氣壓力↓↓壓力表上溫度水蒸汽鍋內(nèi)溫度高溫對培養(yǎng)基成分的影響滅菌物體含菌量的影響芽孢數(shù)目和滅菌時間的關(guān)系芽孢數(shù)/ml在100℃下殺菌時間（分）10000000019750000001650000000142500000012100000081000006pH對滅菌時間的影響

溫度芽孢數(shù)滅菌時間（分）（℃）（個/ml）pH6.1pH5.3pH5.0pH4.7pH4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000740720180150150滅菌對象體積的影響不同容量的液體的滅菌時間容器（ml）在121~123℃下所需滅菌時間（分）三角燒瓶5012~1420012~1550017~22100020~25200030~35血清瓶900050~55空氣排除度對滅菌溫度的影響

壓力表讀數(shù)鍋內(nèi)溫度（℃）

kg/cm2磅/英寸2純蒸汽排除1/2空氣不排除空氣0.35510994720.7010115105901.0515121

112

1001.40201261181091.75251301241152.1030134128121高溫對培養(yǎng)基成分的影響形成沉淀物牛肉膏、蛋白胨、麥芽汁等天然培養(yǎng)基滅菌后，發(fā)生沉淀。（一般不影響微生物生長）培養(yǎng)基中含Ca、Mg、Fe、Zn等離子，加熱后易形成磷酸鹽、碳酸鹽沉淀。破壞營養(yǎng)，提高色澤褐變：含糖較高的培養(yǎng)基滅菌后，顏色發(fā)生變化，如黃、褐色，一般顏色越深，發(fā)酵效果越差。原因：還原糖的羰基與氨基酸或蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)→氨基糖（褐色）；部份糖分解→焦糖。改變培養(yǎng)基pH：滅菌后，培養(yǎng)基pH下降0.2~0.3降低培養(yǎng)基濃度：氣溫低時會增加冷凝水。滅菌溫度和時間對營養(yǎng)成分破壞的影響滅菌溫度（℃）滅菌時間（分）營養(yǎng)成分的破壞（%）10040099.311030671151550

1204271300.581400.0821500.01<1不同溫度下濕熱滅菌對糖類的破壞（用旋光法測定）糖類滅菌方法（10%）121℃,15分115.6~118℃,20分113~115.6℃,20分100℃,30分含量破壞含量破壞含量破壞含量破壞%%%%%%%%葡萄糖76.0024.0081.8518.1599.400.6091.988.02乳糖67.9032.1085.7014.3095.274.7381.9018.10麥芽糖83.9616.0484.6815.3286.5413.4678.8421.16蔗糖87.6812.3297.742.2698.651.3596.253.75（二）Filtersterilization（過濾除菌法）Filterwithporessizedlessthan0.22umtostopmicrobialcellsUsedforheatsensitivematerialsCannotremovevirusesorextremelysmallbacteria（三）RadiationsterilizationMicrowaves-microwaveoven,thermaleffectsUltraviolet(UV)-DNAbreakageIonizationradiationSources:X-rays,Gammarays,ElectronsMechanism:ionsandreactivemoleculestodestroymacromolecules（四）ChemicalwaysAgentsthatkillorganismsareoftencalled

cidal

agents

(bacterici