微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物殺線蟲活性測(cè)定 浸蟲法征求意見稿草案

GB/TXXXXX–2012GB/TXXXXX–2012次生代謝產(chǎn)物殺線蟲活性測(cè)定1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物殺線蟲活性測(cè)定的原理、儀器設(shè)備、試劑與材料、操作步驟、結(jié)果分析。本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物殺線蟲活性的測(cè)定。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1致死中濃度lethalconcentration50%，LC50LC50指的是使受試線蟲半數(shù)死亡的次生代謝產(chǎn)物的濃度。3原理將線蟲浸入微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物藥劑中使線蟲死亡，用中性紅將線蟲死細(xì)胞或組織染成在顯微鏡下可見的紅色，通過染色情況判斷次生代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲的致死情況，計(jì)算線蟲的校正死亡率，根據(jù)校正死亡率的幾率值和藥劑濃度對(duì)數(shù)的線性回歸關(guān)系得到回歸曲線，計(jì)算得到LC50，從而測(cè)定次生代謝產(chǎn)物殺線蟲的活性。4儀器設(shè)備4.1恒溫培養(yǎng)箱：溫度偏差在±1℃以內(nèi)。4.2顯微鏡：最小放大倍數(shù)為10倍。4.3電子天平：稱量精度0.1g以上。4.4微量移液器。4.5離心機(jī)。4.6計(jì)數(shù)器。5試劑與材料所有試劑除另有說明外，均為分析純，水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。5.15mg/mL膽固醇溶液稱取適量膽固醇，溶于相應(yīng)體積的無水乙醇中，配成5mg/mL的膽固醇溶液，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。5.21mol/L氯化鈣溶液稱取適量膽固醇，溶于相應(yīng)體積的去離子水中，配成1mol/L的氯化鈣溶液，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。5.31mol/L硫酸鎂溶液稱取適量七水硫酸鎂，溶于相應(yīng)體積的去離子水中，配成1mol/L的氯化鈣溶液，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。5.41mol/L磷酸緩沖液，pH6.0稱取118.1g磷酸二氫鉀，23.0g磷酸氫二鉀，溶解于900mL的去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0，再加去離子水定容到1L，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。5.5線蟲專用緩沖液（M9緩沖液）取3.0g磷酸二氫鉀，6.0g磷酸氫二鈉，5.0g氯化鈉，1mL濃度為1mol/L的七水硫酸鎂，用去離子水溶解，并定容到1L，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。5.6次氯酸鈉裂解液取0.1g氫氧化鈉，溶于3.5mL去離子水中，再加入1mL含活氯10-15%的次氯酸鈉溶液混合。5.7瓊脂培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）稱取10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母粉，10.0g氯化鈉，去離子水定容到1L，121℃滅菌20min。5.8線蟲生長(zhǎng)固體培養(yǎng)基（nematodegrowthmedia，NGM）稱取2.5g胰蛋白胨，3.0g氯化鈉，17.0g瓊脂粉，用去離子水溶解并定容到975mL，121℃滅菌20min，冷卻到55℃左右時(shí)，加入1mL濃度為5mg/mL的膽固醇溶液，1mL濃度為1mol/L的氯化鈣溶液，1mL濃度為1mol/L的硫酸鎂溶液，25mL濃度為1mol/LpH6.0的磷酸鉀緩沖液。5.90.1%（w/v）中性紅溶液稱取適量中性紅粉末溶于相應(yīng)體積的生理鹽水中，配成0.1%的中性紅溶液，0.22μm孔徑的濾膜過濾。5.10N2野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans，theBristolstrainN2）5.11尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（EscherichiacoliOP50）6操作步驟6.1大腸桿菌OP50的培養(yǎng)與接種挑取大腸桿菌OP50單菌落于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，取0.1mL菌液涂布于NGM固體培養(yǎng)基上，室溫放置約30min。6.2N2野生型秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與同步化將N2野生型秀麗隱桿線蟲接入含有大腸桿菌OP50的NGM固體培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)3天，用M9緩沖液沖洗NMG固體培養(yǎng)基上，收集處于產(chǎn)卵期的線蟲。用移液器吸取1mL含產(chǎn)卵期線蟲的M9緩沖液至10mL的離心管中，向管中加入4.5mL次氯酸鈉裂解液，上下顛倒混合約3-5分鐘，約800g的轉(zhuǎn)速離心2分鐘，棄上清收集蟲卵，用M9緩沖液重復(fù)洗滌和離心3次后，用0.2mL無菌M9緩沖液懸浮蟲卵，將卵液轉(zhuǎn)移到含大腸桿菌OP50的NMG固體培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)48h，線蟲成長(zhǎng)至四齡幼蟲。6.3藥劑活性測(cè)定6.3.1藥劑配制水溶性藥劑直接用水溶解，非水溶性藥劑用二甲基亞砜溶解。在0.001~10mg/mL濃度范圍內(nèi)按照等比或等差的方法設(shè)置5以上個(gè)系列質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度藥液量不少于10mL。6.3.2試蟲準(zhǔn)備用無菌M9緩沖液將6.2中的四齡線蟲從NGM固體培養(yǎng)基上沖洗下來，800g轉(zhuǎn)錄離心2分鐘，棄上清液，棄上清收集蟲體，用M9緩沖液重復(fù)洗滌和離心2次，最后用無菌M9緩沖液重懸線蟲至濃度80-100頭/mL，備用。6.3.3藥劑處理用移液器分別吸取6.3.1中不同濃度的藥劑溶液和清水對(duì)照各2mL，加入到不同的5mL試管中，每個(gè)試管另加入大腸桿菌OP50的M9緩沖液懸液1mL，將6.3.2的線蟲懸液1mL加入到上述試管中，將試管置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每個(gè)濃度的藥劑和清水處理各設(shè)置3次重復(fù)。6.3.4線蟲染色與死亡線蟲記錄6.3.3藥劑處理后，將試管置于離心機(jī)中，800g離心5分鐘，棄上清收集蟲體，用M9緩沖液重復(fù)洗滌和離心2次。加入100μL的0.1%中性紅溶液進(jìn)行染色，染色5min后，800g離心5min，棄上清，加入M9緩沖液100μL懸浮線蟲，并轉(zhuǎn)移至96孔板中。半身以上染為紅色的線蟲判定為死亡線蟲。在顯微鏡下觀察線蟲死亡情況，記錄每個(gè)濃度藥劑處理后觀察到的線蟲總數(shù)和死亡線蟲數(shù)。每個(gè)處理的重復(fù)試驗(yàn)，觀察的線蟲不少于30頭。7結(jié)果分析7.1結(jié)果計(jì)算死亡率和校正死亡率分別按公式（1）和（2）計(jì)算：P1=式中：P1——死亡率（%）；K——死亡線蟲數(shù)（頭）；N——觀察總線蟲數(shù)（頭）。P2=式中：P2——校正死亡率（%）P1——處理線蟲死亡率（%）P0——對(duì)照線蟲死亡率（%）若對(duì)照死亡率小于5%，無需校正；若對(duì)照死亡率在5~15%之間，應(yīng)按照公式（2）進(jìn)行校正；對(duì)照死亡率大于15%，試驗(yàn)需要重做。根據(jù)藥劑濃度對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)校正死亡率的幾率值作回歸分析，計(jì)算回歸曲線的R2值。選擇R2值在0.95以上且最高的5個(gè)以上連續(xù)梯度的藥劑濃度來得到最終的回歸曲線Y=aX+b，其中Y為校正死亡率的幾率值，X為濃度對(duì)數(shù)值，a為回歸曲線斜率，b為常數(shù)。根據(jù)回歸曲線，計(jì)算藥劑的LC50及其95%置信區(qū)間。以平行樣的平均值為最終的降解率值，計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后兩位。7.2重復(fù)性在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。__________________________前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院