【恩諾沙星完全抗原的制備探究8500字（論文）】

恩諾沙星完全抗原的制備研究目錄TOC\o"1-3"\f\u摘要 摘要恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）屬于氟喹諾酮類藥物，其抗菌譜廣、抗菌作用強，常作為飼料添加劑來治療和預(yù)防畜禽類疾病，而藥物的濫用使其在畜產(chǎn)品中大量殘留，嚴(yán)重危害人類的身體健康。為快速檢測恩諾沙星藥物殘留的方法奠定基礎(chǔ)，本研究采用活化酯法將ENR分別與雞卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）、牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin，BSA）進行偶聯(lián)，經(jīng)SDS鑒定后，成功制備出完全抗原ENR-BSA和ENR-OVA。以ENR-BSA作為免疫原免疫BALB/C小鼠，三免后用ENR-OVA作為包被原測定其抗體效價約為1:6400，其IC50約為68ng/mL，可為ENR快速檢測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：恩諾沙星；完全抗原合成；雞卵清白蛋白；牛血清白蛋白第1章引言1.1恩諾沙星研究概況1.1.1恩諾沙星的理化性質(zhì)恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）又名乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星[1]，是一種人工化學(xué)合成藥物，屬于氟喹諾酮類藥物。其抗菌譜廣、抗菌作用強，至今在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中備受青睞，是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中治療畜禽疾病常用藥之一[2]。恩諾沙星(Enrofloxacin)是一種類白色或微黃色結(jié)晶性針狀粉末。該品在酸性或堿性條件下溶解，在二甲基甲酰胺、氯仿中略溶，甲醇中微溶，水中不溶。該品長時間光照色澤加深[3]。圖1ENR的化學(xué)結(jié)構(gòu)式1.1.2恩諾沙星的作用機理恩諾沙星具有廣譜抗菌性和獨特的殺菌抑菌性，其在豬疫病防治中有著重要的作用，它是一種廣譜、高效、低毒的抗菌新藥，其作用機理與以前的抗菌藥和抗生素不同[4]。恩諾沙星的作用機理是通過抑制細菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，從而阻礙細菌DNA的復(fù)制而起到迅速殺菌作用，它采用分散體工藝技術(shù)，以高分子優(yōu)質(zhì)材料為載體，使不溶于水的恩諾沙星以分子態(tài)在水中均勻分散，克服了恩諾沙星不溶于水的特性，增加了其它機體組織的親和力，使其生物利用度提高2-4倍[5]。該藥內(nèi)服及肌肉注射吸收迅速，但代謝物生成與消除緩慢、分布廣泛，長期用藥在畜禽產(chǎn)品中的殘留、耐藥性的增加等方面已引起廣泛關(guān)注，因此加強對該藥物在動物性食品中的殘留檢測和監(jiān)督至關(guān)重要。1.2恩諾沙星殘留物的檢測方法1.2.1儀器法高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography；HPLC）。HPLC是藥物殘留檢測中常用的方法之一，其自動化程度好、靈敏度高、分析速度快。目前，絕大多數(shù)獸藥都建立了HPLC檢測方法。色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。色譜質(zhì)譜聯(lián)用法是集分離和定性于一體的分析技術(shù)，包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LquidChromatograph-MassSpectrometer，LC-MS)和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GasChromatography-MassSpectrometry，GC-MS)。其中，LC-MS是獸藥殘留檢測中最常用的方法，其發(fā)展較早，技術(shù)較為成熟，靈敏度高、特異性強、分析范圍廣，可以對樣品進行定量、定性分析[6]。儀器檢測法結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，假陽性低，在藥物殘留檢測領(lǐng)域常作為標(biāo)準(zhǔn)方法，但該檢測方法操作較繁瑣，上樣前必須對樣品進行預(yù)處理，且檢測所需時間較長，對儀器設(shè)備精密度要求較高，而且無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。1.2.2免疫分析法酶聯(lián)免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）。該檢測方法主要依賴于抗原抗體之間的特異性反應(yīng)，與其他方法相比，ELISA檢測方法簡單，反應(yīng)迅速，且靈敏度高，特異性強，不需要大型精密儀器，能夠現(xiàn)場快速檢測大量樣品，是目前獸藥殘留檢測中應(yīng)用最多的分析技術(shù)[7]。（1）抗原包被直接競爭ELISA在直接競爭ELISA中將抗原特異性捕獲抗體吸附在微量滴定板上，然后與已知標(biāo)準(zhǔn)品或未知測試樣品一起孵育。另外還添加了酶聯(lián)抗原（標(biāo)記的抗原），僅當(dāng)抗體的結(jié)合位點未被測試樣品中的抗原標(biāo)準(zhǔn)物或抗原占據(jù)時，才能與捕獲抗體結(jié)合。未結(jié)合的標(biāo)記和未標(biāo)記的抗原被洗去并添加底物[8]。標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測樣品中抗原的含量決定了與抗體結(jié)合的報告分子標(biāo)記的抗原的含量，產(chǎn)生的信號與樣品中的抗原濃度呈反比。因此測試樣品中的抗原濃度越高，與捕獲抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原越少，所得信號越弱。（2）間接競爭ELISA間接競爭ELISA(indireetcELISA)將固定在微量滴定板上的抗原與溶液中的抗原進行反應(yīng)，以與抗原特異性抗體結(jié)合。溶液中的抗原在測試樣品時，首先與抗原特異性抗體一起孵育，然后將這些抗體抗原復(fù)合物添加至微量滴定板，其孔中用已被純化的抗原包被。洗滌孔以去除未結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物和游離抗原。然后加入酶標(biāo)記的二抗，最后加入底物。底物水解產(chǎn)生的信號與樣品中的抗原濃度成反比。這是因為當(dāng)測試樣品中的抗原濃度很高時，大多數(shù)抗體在將溶液添加到板上之前都已結(jié)合。大多數(shù)抗體保留在溶液中(作為復(fù)合物)，因此在添加酶標(biāo)記的二抗和底物之前被洗掉。因此，測試樣品中的抗原濃度越高，在檢測步驟中得到的信號越弱。間接ELISA通常用于競爭性檢測和定量生物樣品中抗病毒性疾病的抗體。1.2.3半抗原偶聯(lián)原則半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)方法的選擇取決于半抗原和載體上存在的功能群，以及半抗原向免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)所需的方向。當(dāng)半抗原是化學(xué)反應(yīng)分子(如異氰酸酯)時，半抗原與載體的結(jié)合可以是自發(fā)的，也可以借助于交聯(lián)劑(如戊二醛或碳二亞胺)發(fā)生，該交聯(lián)劑至少具有兩個化學(xué)反應(yīng)基。非活性半抗原可使用與最終產(chǎn)物結(jié)合的試劑或可激活載體蛋白位點以進行后續(xù)連接的試劑耦合到載體上。當(dāng)制備共軛物時，可發(fā)生分子間和分子內(nèi)交聯(lián)[9]。影響最終偶聯(lián)物交聯(lián)程度的幾個因素有:載體和半抗原與偶聯(lián)劑的比例、載體或半抗原的濃度、溶液離子強度、溫度和pH以及半抗原的可溶性、穩(wěn)定性等。免疫半抗原具有小分子末端的活性基團，小分子與載體蛋白之間的連接臂，還有待測物的特征結(jié)構(gòu)。首先待測物的特征結(jié)構(gòu)指的是和一些其他物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不一樣，具體體現(xiàn)在以下幾個方面:電負性的大小、立體幾何空間結(jié)構(gòu)、氫鍵間的相互作用力等等。在對小分子進行改造的時候，改造后的半抗原還應(yīng)該有改造前的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，改造后的半抗原要有目標(biāo)靶向結(jié)構(gòu)，這是為了后期試驗?zāi)軌虻玫礁咛禺愋缘目寡錥10]。要想后期免疫效果好，能夠很大程度的被免疫細胞識別，就要必須保證改造的半抗原的一些結(jié)構(gòu)特征能夠完全暴露出來，所以我們可以通過引入連接臂的方式來實現(xiàn)。如果要引入連接臂，那么連接臂的長度是有一定要求的，不能過長，也不能過短，一般為4-6個碳是最合適的。通常情況下，機體的免疫系統(tǒng)都會對遠離載體那一端的化學(xué)結(jié)構(gòu)識別能力比較強，而對連接載體蛋白那一端的化學(xué)結(jié)構(gòu)識別能力比較弱[11]。

1.2.4常用的偶聯(lián)方法ENR屬于半抗原，必須與載體蛋白偶聯(lián)才能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫記憶功能和抗體應(yīng)答反應(yīng)。目前，常見的載體蛋白有牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)、雞卵清蛋白（ChickenOvalbumin，OVA）、匙孔血藍蛋白（Keyholelimpethemocyanin，KLH）等[12]。半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)方法有混合酸酐法、活化酯法、碳化二亞胺法、戊二醛法、重氮化法等。（1）混合酸酐法：偶聯(lián)時，半抗原分子中的羧基可與氯甲酸異丁酯在有機溶劑中形成混合酸酐，然后與蛋白分子中的氨基形成肽鍵[13]。而用同氯甲酸異丁酯反應(yīng)形成的混合酸酐則可以進一步提高產(chǎn)率，廣泛用于多肽合成中的方法[14]。（2）活化酯法：利用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)作為交聯(lián)劑，幫助膠原分子的羧基和氨基之間形成酰胺鍵。碳化二亞胺首先是和羧基偶合形成一個O-異酰基脲結(jié)構(gòu)，這一活化中間物受到-NH2基團進攻形成酰胺交聯(lián)，而活化中間物可以消除并被清洗掉。EDC交聯(lián)劑具有無毒、生物相容性良好的特點，并且EDC交聯(lián)的膠原基支架表現(xiàn)出更為優(yōu)異的細胞相容性，該類交聯(lián)劑得到各國研究者的廣泛關(guān)注[15]。活化酯的優(yōu)點在于所用的N-保護氨基酸活化酯很多都能分離純化出來得到純品，而且比較穩(wěn)定，能夠長期放置保存[16]。1.3本研究的目的與意義ENR抗菌廣譜、殺菌活性強、能被動物快速吸收，是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中治療畜禽疾病常用藥之一，但長期不合理的使用導(dǎo)致動物組織及產(chǎn)品中ENR的大量殘留，嚴(yán)重危害人類健康。至今，越來越多的試驗結(jié)果證實動物或人類對氟喹諾酮類藥物可產(chǎn)生耐藥性，我國對ENR的殘留限量做了規(guī)定，對動物肌肉中的殘留量做了要求。目前，檢測ENR殘留的方法主要有HPLC、ELISA等，這些檢測方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法，但檢測前需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理，且檢測所需時間較長，對儀器設(shè)備精密度要求較高，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求[17]。ENR屬于半抗原，因此完全抗原的合成效果直接影響抗體的性能，而如何根據(jù)具體的檢測要求，有效制備ENR完全抗原，是后續(xù)抗ENR單克隆抗體制備及相關(guān)實驗的開展的基礎(chǔ)[18]。

第2章實驗材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗動物BALB/C小鼠：新鄉(xiāng)學(xué)院動物疫病分子診斷實驗室提供2.1.2實驗試劑表1主要試劑實驗試劑實驗試劑生產(chǎn)廠家恩諾沙星（ENR）索萊寶生物有限公司牛血清白蛋白（BSA）美國Sigma公司雞卵清白蛋白（OVA）美國Sigma公司碳二亞胺（EDC）美國Sigma公司N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）索萊寶生物有限公司過硫酸銨（APS）索萊寶生物有限公司十二烷基硫酸鈉（SDS）索萊寶生物有限公司考馬斯亮藍G-250北京鼎國生物技術(shù)公司Bradford蛋白濃度測定試劑盒索萊寶生物有限公司弗氏完全佐劑（FCA）美國Sigma公司弗氏不完全佐劑（FIA）美國Sigma公司Tris堿索萊寶生物有限公司硼酸鈉北京鼎國生物技術(shù)公司30％制膠液北京鼎國生物技術(shù)公司2.1.3實驗儀器與設(shè)備表2主要試驗儀器設(shè)備與儀器名稱（型號）儀器生產(chǎn)廠家多功能酶標(biāo)儀Enspire美國PerkinElmer公司電泳儀伯樂（上海）有限公司脫色搖床其林貝爾儀器制造有限公司凝膠成像儀其林貝爾儀器制造有限公司pH計上海梅特勒-托利多儀器有限公司超凈工作臺美國ThermoFisher公司電子天平德國Sartorius2.1.4主要溶液配制（1）硼酸鈉溶液（0.05mol/L，pH8.6）稱取9.5g四硼酸鈉，4.39g氯化鈉溶解于500mL雙蒸水中，室溫保存。（2）PBS緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）稱取8gNaCl，0.2gKCl，2.9gNa2HPO4.12H2O，0.2gKH2PO4，放到燒杯中，先加400mL雙蒸水，濃鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.4，繼續(xù)加水使終體積為1L。（3）把1.0gSDS、14.4gGlycine、3.0gTris堿稱量好，溶于50mL雙蒸水中，定容到100mL，貼上標(biāo)簽紙，寫上溶液名稱和配制時間，室溫放置，在使用前稀釋成工作液(工作液濃度為1×Tris)。（4）PBST溶液往配好的1LPBS溶液中加入1mLTween-20，粘貼標(biāo)簽紙寫上溶液名稱和配制時間。（5）5×SDSLoadingBuffer稱量5mL1mol/LTris-HCl(pH6.8)、10mL甘油，2gSDS、100mg溴酚藍、1mLβ-巰基乙醇，最后加適量的雙蒸水使終體積達到20mL，粘貼標(biāo)簽。（6）10%過硫酸銨量取0.5g過硫酸銨，溶于5mL雙蒸水中，每300μL分裝一個EP管，粘貼標(biāo)簽紙，并標(biāo)明溶液名稱和配置時間，-80℃凍存?zhèn)溆谩＃?）染色液和脫色液脫色液：200mL甲醇和100mL冰醋酸加到一個大容器里邊，然后加雙蒸水使終體積為1L，在室溫下保存。染色液的配置:在配好脫色液的基礎(chǔ)上加1.0g考馬斯亮藍G-250，最后將液體轉(zhuǎn)移到棕色瓶中室溫保存(少量配置)。（8）2×YT液體培養(yǎng)基用電子天平稱量8.5g胰蛋白胨、5.0g醇母浸粉、2.5gNaCl。加雙蒸水并定容到500mL，配制成液體培養(yǎng)基。（9）TBSTBuffer緩沖液稱取8.8gNaCl，加入1MTris-HCl(pH8.0)20mL，加入0.5mLTween-20，定容至1L，4℃保存?zhèn)溆?。?0）5%封閉緩沖液稱取脫脂奶粉5g，用TBSTBuffer緩沖液定容至100mL。（現(xiàn)用現(xiàn)配）2.2實驗方法2.2.1ENR完全抗原的制備采用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化酯法制備恩諾沙星-載體蛋白結(jié)合物[18]，原理見圖2：稱取3mgENR溶于1mLMESBuffer溶液中(0.1mol/L，PH5.0)，在攪拌過程中加入10mgEDC和8mgNHS，室溫下磁力攪拌反應(yīng)過夜。分別稱取20mgOVA和BSA于1mL硼酸鈉溶液中（0.1mol/L，PH8.5），分別將上述溶液逐滴加入OVA和BSA溶液中，4℃下過夜反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，裝入透析袋于0.1mol/L，PH7.4的PBS緩沖液中透析三天，4℃，攪拌，每6-8h換一次透析液。透析結(jié)束，收集透析袋中的溶液，即為完全抗原；將制備好的完全抗原進行分裝，放于-20℃保存?zhèn)溆?。圖2ENR的人工抗原合成路線2.2.2ENR完全抗原濃度的測定檢測ENR-BSA和ENR-OVA濃度時，為了讓結(jié)果更準(zhǔn)確，所以使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒進行檢測，然后用酶標(biāo)儀讀取OD595nm的值。具體步驟是：把BSA載體蛋白用0.1mol/L，PH7.4的PBS溶液配制成一組濃度為0mg/mL，0.02mg/mL，0.04mg/mL，0.06mg/mL，0.08mg/mL，0.12mg/mL，0.16mg/mL，0.20mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，測定這組溶液的吸光度，得到蛋白質(zhì)濃度對吸光度的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作BSA體積（μL）02468121620PBS體積（μL）2018161412840BSA濃度（mg/mL）00.020.040.060.00G-250體積（μL）200測定未知蛋白質(zhì)濃度樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)的濃度。在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的時候，橫坐標(biāo)是BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，縱坐標(biāo)是測得的OD595nm吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線建出來以后，根據(jù)公式算出待測樣品的蛋白濃度。

2.2.3ENR完全抗原的鑒定將偶聯(lián)產(chǎn)物及載體蛋白等量上樣進行SDS電泳鑒定。（1）先配制12%的分離膠，往膠板中加入分離膠，然后加異丙醇，目的是為了封住膠面，在室溫放置1h后，查看膠的狀態(tài)。（2）待分離膠凝固后，將異丙醇傾去，然后加配制好的5%濃縮膠，隨即插入10孔梳子，在室溫下放置30min后，查看膠的狀態(tài)。（3）待濃縮膠完全凝固，拔出梳子備用。將BSA載體蛋白與ENR-BSA樣品濃度稀釋至1mg/mL，將OVA載體蛋白與ENR-OVA樣品濃度稀釋至2mg/mL，取20μL樣品與4μL5×loadingbuffer緩沖液混勻，沸水浴中煮10min后上樣。（4）前30min用80V電壓，然后調(diào)節(jié)120V電壓1-2h。待電泳結(jié)束后，將膠取出用考馬斯亮藍G-250染色1h，脫色液過夜脫色至條帶清晰后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件分析結(jié)果。2.4動物免疫將鑒定偶聯(lián)成功的ENR-BSA（1mg/mL）抗原對BALB/C小鼠進行免疫刺激，其中抗原量是50μg/只，注射體積為200μL/只。初次免疫的時候，先將ENR-BSA用PBS稀釋后，加完全佐劑(比例為1:1)開始乳化。完全乳化后免疫小鼠，第二次、第三次免疫時用不完全佐劑乳化ENR-BSA抗原，每次免疫間隔15d。除第一次免疫外，每次免疫10d后，采集小鼠尾靜脈血用PBS稀釋后（1:100）用于檢測抗體效價。免疫程序如表4所示。表4免疫程序免疫次數(shù)抗原量（μg）佐劑劑量（μL）間隔時間免疫方式150FCA200—皮下多點250FIA20015d皮下多點350FIA20015d皮下多點2.5小鼠血清抗體效價的檢測采集小鼠尾部靜脈血，通過ELISA測定其血清效價。具體步驟如下：（1）包被：將濃度為2mg/mL的ENR-OVA和OVA溶液加到96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，放于冰箱4℃過夜包被(保鮮膜封口，防止液體揮發(fā))，第二天用PBST重復(fù)洗板五次，每次2min，拍干；（2）封閉:每孔加200μL5%脫脂奶粉，放于37℃恒溫箱中封閉2h；PBST重復(fù)洗板五次，每次2min，拍干；（3）加一抗:每只小鼠采5μL血液(尾部采血)，加入495μLPBS中進行1:100倍稀釋，加到酶標(biāo)板中，在此之前每孔先加50μL5%脫脂奶粉-PBST，再加入50μL稀釋好的小鼠血液，按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800進行倍比稀釋，37℃孵育30min，重復(fù)洗板五次，每次2min，洗去未與抗原結(jié)合的一抗，同時做陰性對照和空白對照。（4）加酶標(biāo)二抗:用5%脫脂奶粉-PBST溶液按照1:5000倍稀釋羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育30min;重復(fù)洗板五次，每次2min，洗去未與一抗結(jié)合的酶標(biāo)二抗。（5）顯色:每孔中加TMB單組分顯色液100μL，室溫避光顯色10min，然后加終止液，100μL/孔。（6）讀數(shù):先空白對照調(diào)零，用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成）。2.6血清抗體敏感性測定（IC-ELISA法）利用間接競爭ELISA的方法測定BALB/C小鼠血清抗體對不同濃度ENR的抑制率（B/B0，B是不同濃度ENR的OD450nm值，B0是濃度為0時OD450nm值）以B/B0為縱坐標(biāo)，以不同濃度的ENR為橫坐標(biāo)繪制抑制曲線，計算50％抑制濃度（IC50）,以IC50作為敏感度[19]。具體步驟如下:在4℃條件下，用2mg/mL的ENR-OVA包被酶標(biāo)板；次日，PBST清洗5次，拍干；每孔加200μL5%脫脂奶，37℃封閉2h；PBST清洗5次，拍干后每孔加50mL用PBS稀釋后小鼠的血液和50mLENR稀釋液(稀釋液濃度依次為100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0ng/mL)，37℃反應(yīng)40min，PBST清洗5次，拍干后每孔加100μL商品化、標(biāo)記為HRP的羊抗鼠(1:5000稀釋)，37℃反應(yīng)30min，PBST清洗5次，拍干后每孔加100μLTMB顯色液，37℃反應(yīng)10min；最后加100μLELISA終止液，靜置2min后用酶標(biāo)儀測定每孔OD450nm處的吸光值。計算其IC50。第3章結(jié)果與分析3.1ENR完全抗原濃度的測定表5標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度測定濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD595nm（y值）0.000.5290.020.5500.040.6400.060.6820.080.7240.120.7850.160.8910.200.976圖3蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得：ENR-BSA濃度為6.67mg/mL，ENR-OVA濃度為3.0mg/mL。3.2ENR完全抗原的鑒定使用SDS凝膠電泳鑒定完全抗原，結(jié)果如圖4、5所示。從圖中可以看出，BSA和OVA的大小約為66kD和45kD，偶聯(lián)產(chǎn)物ENR-BSA和ENR-OVA的大小約為75kD和47kD，偶聯(lián)產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量明顯大于載體蛋白，說明ENR完全抗原制備成功，可用于后續(xù)試驗。M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:BSA;2:ENR-BSA圖4偶聯(lián)產(chǎn)物ENR-BSA的SDS鑒定M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:ENR-OVA;2:OVA

圖5偶聯(lián)產(chǎn)物ENR-OVA的SDS鑒定3.3免疫小鼠效價評價本研究使用濃度為3mg/mL的ENR-OVA和OVA包被酶標(biāo)板，并測定小鼠血清抗體效價。以陽性血清的OD450nm為P，陰性血清的OD450nm為N，選擇P/N≥2.1時血清的最大稀釋倍數(shù)為抗體效價[20]，三免后經(jīng)測定，顯示小鼠的抗體效價達到了1:6400，證明了制備的ENR完全抗原是成功的且效果良好。

表6小鼠血清效價檢測血清稀釋倍數(shù)ENR-OVAOVAP/N≥2.11:1001.9070.308Y1:2001.8990.173Y1:4001.5980.131Y1:8001.1940.096Y1:16000.6650.074Y1:32000.4320.061Y1:64000.2300.058Y1:128000.0940.051N3.4血清抗體敏感性測定以ENR標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光值B/B0(B:添加標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm;B0:不添加標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm)為縱坐標(biāo)(Y)，建立針對與ENR的競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]，如圖6。表7血清抗體敏感度測定濃度（ng/mL）B/B010000.2548131371000.533408834100.72593431510.84937712301R2R2=0.99996IC50=68ng/mL圖6ENR的競爭抑制曲線一般IC50的數(shù)值越小，說明抗體的特異性能越強。半數(shù)抑制是用來衡量抗體靈敏度，半數(shù)抑制越低，說明抗體的靈敏度越高[22]。三免后小鼠ENR多克隆抗體經(jīng)測定，其IC50約為68ng/mL，表明制備的ENR完全抗原能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的抗ENR的抗體。第4章討論4.1恩諾沙星殘留物檢測方法分析恩諾沙星屬于氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)。目前，氟喹諾酮殘留的研究方法有很多種[23]。其中微生物分析通常容易進行且價格便宜，然而，這些方法復(fù)雜，費時且缺乏特異性。儀器檢測方法包括液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和高效液相色譜（HPLC）等是ENR殘留檢測的最新方法。這些方法靈敏且具有高度特異性，但它們需要昂貴的設(shè)備和專門的技術(shù)人員，且樣品的預(yù)處理也比較復(fù)雜。隨著科技的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附測定法在獸藥殘留快速分析中得到廣泛應(yīng)用。ELISA具有選擇性強、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便的特點，既能用于抗菌藥物殘留的快速篩選，又能進行定量測定是藥物殘留檢驗最實用的檢測方法[24]。4.2恩諾沙星完全抗原偶聯(lián)方法分析恩諾沙星屬于半抗原，本身不具備免疫原性，它必須和載體蛋白結(jié)合才能刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[25]。本試驗選擇的載體蛋白是BSA和OVA，原因是:1）這兩種蛋白具有化學(xué)活性基團，免疫原性好；2）分子量適中；3）經(jīng)濟易得。ENR分子中含有羧基，活化羧基的方法主要有混合酸酐法、碳二亞胺法和活化酯法。本實驗針對ENR的結(jié)構(gòu)特點，結(jié)合碳二亞胺法和活化酯法進行偶聯(lián)[26]。碳二亞胺是一類很強的脫水劑，能使ENR上的的羧基與載體蛋白上的氨基形成胺鍵，但這種縮合反應(yīng)沒有選擇性，易形成蛋白分子間的自身聚合，產(chǎn)生非均一性產(chǎn)物，因此本實驗對傳統(tǒng)的碳二亞胺法進行了改進，即在反應(yīng)體系中加入一定量的NHS，以減少非均一性產(chǎn)物；活化酯法是利用ENR上的羧基在EDC的作用下，與NHS反應(yīng)，生成活潑酯衍生物，后者與載體蛋白上的氨基反應(yīng)，形成以酰胺鍵連接的偶聯(lián)物[27]。第5章結(jié)論本研究采用活化酯法制備的ENR-BSA和ENR-OVA完全抗原，經(jīng)SDS初步鑒定偶聯(lián)成功。用ENR-BSA去免疫小鼠，三免后，以ENR-OVA作為包被原對小鼠血清效價進行評價，結(jié)果顯示效價為1:6400，免疫效果良好，為后續(xù)抗ENR單克隆抗體制備及相關(guān)實驗的開展奠定基礎(chǔ)。

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