犬巴貝斯蟲病診斷技術

1犬巴貝斯蟲病診斷技術注：本文件所稱犬巴貝斯蟲病為吉氏巴貝斯蟲感染引起的犬巴貝斯GB/T6682分析實驗室用水規(guī)GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范3.1犬巴貝斯蟲病Caninebabes3.2吉氏巴貝斯蟲Babesiagibsoni4縮略語bp：堿基對（BasePair）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleDTT：二硫蘇糖醇（1,4-DithiothreiDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicaciIPTG：異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalPCR：聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Tris-acetate-25.1流行病學調(diào)查顯示臨床巴貝斯蟲病例中約75％-85％為吉氏巴貝斯蟲。1985年我國南京發(fā)現(xiàn)首例犬感染巴貝斯蟲5.2典型臨床癥狀5.2.2貧血：漸進性貧血，可視黏膜蒼白至黃染（見附錄C圖C.1中①②)。5.3典型病理變化5.3.3肝臟和脾臟腫大易碎，約為正常犬的2-3倍，甚至3-4倍（見圖C.1中③)。5.4流行特點5.5結果判定36.2.3姬姆薩染液工作液，按照A.2加甲醇于血涂片，使甲醇完全覆蓋血涂層，待晾干后重復加姬姆薩染液于已固定好的血涂片，使其完全覆蓋血涂層。室溫條件染色30min。染色結束之后，47.2.12×RapidTaqMasterMix（商品化）包含TaqDNA聚合酶、延伸促進因子、dNTP以及優(yōu)化的7.2.610000×GelRed或綠如藍核酸染料。7.2.7吉氏巴貝斯蟲陽性基因組對照（用體外純培養(yǎng)的5用商業(yè)化的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，方法按照試劑盒說明書。提取的DNA立擴增吉氏巴貝斯蟲P47基因的引物BgF/BgR按照附錄F中表F.1引物序列合成。配制PCR反應體系，然后95℃變性15s，61℃退火15s，72℃延伸1min，共擴增35個循環(huán)；72℃延伸5min。用1×TAE緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物10μL與2μL6×加樣緩沖液混合，加樣于含10000×GelRed或綠如藍核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠制備的凝膠塊中，在1×TAE緩沖液中，5V/cm電泳大約30min，當溴酚藍達到底部時停止電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結果，并拍照保存。吉氏巴貝斯蟲陽性DNA對照出現(xiàn)1071bp的特異性條帶，且陰性對照無擴增條用特異性引物自待檢樣品基因組DNA中擴增出大小為1071bp的條帶，判定為吉氏巴貝斯待檢樣品無特異性的陽性擴增條帶出現(xiàn)，判定為吉氏巴貝斯蟲核8.2.1吉氏巴貝斯蟲BgSA1抗體檢測6斯蟲標準陽性血清按照附錄L制備，吉氏巴貝斯蟲抗體檢測試紙條按照附錄M制備，其他相關試劑按照3000g離心10min，收集上清于1.5mL離心管中，于-20℃保），液，試紙條上將有紅色條帶移動。靜置15min，觀在試紙條上出現(xiàn)兩條線（檢測線和質(zhì)控線見附錄N.1.A）。在試紙條上僅出現(xiàn)一條線（質(zhì)控線見附錄N.19綜合判定7a)出現(xiàn)6.8.1結果的，判為吉氏巴貝斯蟲A.1姬姆薩染液A.2姬姆薩染液工作液gA.5His-bindingBuffer（pH=8.0）NaclNaH2PO4去離子水1.21g9ACTGCAAAAACTGGAGGGGGTGTTGTCCCCCAGGAGTTA③——脾臟腫大，邊緣鈍圓；注：③引自翟曉虎，2022。），假頭基矩形，寬約為長的1.7倍（包括基突）；兩側緣幾乎平行；基突強大，三角形，長與其基部寬約雌蜱：體長3.29-3.92mm（包括假頭），寬為1.93-2.5側溝明顯，末端延至眼后。氣門板長大于寬，呈短逗點形，背突粗短。足基節(jié)I外距直，較內(nèi)距稍短；基節(jié)II~Ⅳ外距粗短，按節(jié)序漸小。跗節(jié)II~Ⅳ腹面亞末端具一鈍齒，末端均具一尖齒。爪墊約達爪長雄蜱：體長3.94-4.77mm（包括假頭），寬為2.20-2.61mm。體型與雌蜱相似。須肢粗短，第I、末端尖細。氣門板長逗點形，背突粗短，末端圓鈍。足與雌蟲相似。長角血蜱形態(tài)特征見圖D.1，鐮形扇頭蜱形態(tài)特⑤引自RajeevKungurBrahma,etal.,2014；⑥引自DesmondO.Agwunobi,etal.,2020。采用PCR方法開展巴貝斯蟲檢測時，需合成擴增P47基因的引物見表BgR——反向引物；111G.2.1在配制PCR反應體系過程中，陽性對照DNA與待檢樣品DNA應該在不同區(qū)域添加，以免造成G.2.2所有試劑應按照要求分別在4℃或-20℃條件保存，使用時在室溫條件下融化，混合均勻，放置用吉氏巴貝斯蟲P47基因特異性引物，僅可自吉氏巴貝斯蟲陽性基因組中擴增出大小約為1071bpM——核酸分子Marker；用吉氏巴貝斯蟲P47基因特異性引物，自待檢樣品基因組中擴增出大小約為1071bp的片段（見圖M——核酸分子Marker；ACACAAATAACAACACCTGTGGATGACAATGATTCTGCTCCAATGGAGCCACATTCTGTATGTTACACTTCCTAGGTAAATTGCAGCAGGACACAAACCTGAAAGAAAAGTTTGTCAATGGAGAAGGTAGTTAAGGAGTATCTGGACACCACGCAAGTTGAGAAAAAAGGGTATACTGTTTCGATAGTTTGTTGGAACACGTGAATAAACTACGTCATGAGCTGTTGAACGACACCGGATGGAAAATTTAAGGATCTTAACGAAGAGGGTGTGACAAAGGCTTTTGAAATACTTGTCCGATTCCAATCTTGCACAGTGAGTTTTCGTTGCTGTATTTCCTCTCCTCTACGGAGGGTGGCGGAAATCAATGGATTGAACAATATTTCGGACCAGAGCATACAGGTACACAGGCTGGTTGACTGATAAGTTAAATGAAGCTAAGGACCCTTTCACTGTGAAGAAAGGTTTTGATGATCTAAAACGAGGTGGTAGGATTACCGCAGCTGTGACTGGTAATCTGGGAATAAACCCGGCGGACCTCTAAACTACATGCAATATGGACTGTTTTTCCTTTCTGGTGATACTTTGCGAATCTTGCAAGCGCCCTTCTATTCCTGGCAGAGTTCTGTAGGGAAGTAAGTGAGAACAAGCCCGAGAAGACCACGCTTGATAAATATAAATGTCTTAAGGATGTATGCAAGGATGTAAAATTGATGCTTTTCATAAGCATATTTTGCCTCTATATAATCCTTTAACGGTTGAAGACATAGTGATGACGATAGTAAACTTGGTGAGGTTGTACGCATGGCGGAGGGTAGGTGTAATGACAAAGGAAAGTTAAAAAAAGAGAAATTTGACGAATATGTCACATGGATGAAAAGGAATCTAAACTTATGCTTCTGCTGAGGGAGATGCACACTGACTCTGCCAGATGGACTGTTGAAGATTGTATGTCCAGTCTCATGGACCATCCAAATACGGTTATACGTTCGTGGATAAGAGATGGGAGTATATATTTCACATTTAAGCAGTCTATAGAAGACCTTGCACTTTTTGAATCAAGCAATGGTTAGTCTGCTTAGGTGCTTAGATGGCCAGAGGGCATTAAGAGAGAGGGAAGTCTTTGAAAAAGAAGAAGAAAAGAAAAAGAAAGAAGAGGCTAATAAAAAAGTAAGACGGGTAGCTAAACCCAACTGAGGTTGGAGAAGGAGAGGGGAATTCGTCAGGAAAACAGACACCAGTTCCTACACACTGGTAAGACCCAGTTGAAGGAACAAACACTTGCGGATGGTCATTCTGAAGATCCAAAAAGGGTGCAACTAAGCAGACCTCTGAAACCGTTCCACCTGCTCACCAAACAACAGCCTCCAACAGAAAATGAGGCAGGCCATAAGGCATCAAAGCCAAATGAAACTGAGTCTAACAGAAGGGGTTCCTAAGAAGGAAGAGGAAGTGCCTCAAGAAGGAAAAGGAGATGAGAAAGGTCCATACCTCCGTTAAAGCAAAGGCGGAAGGCACAGCGAATGAGGCATCATTCTCTGCTTTGAGAGTGGCCACAGCATTTTTGGCCCTTTTGTCTGTAATG引物ExpSA1-F-F/ExpSA1-R（20μmol/LBamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，克隆載體pETASY-Blunt，表達載體pET-28a，感受態(tài)大腸桿菌DH5α,感LB培養(yǎng)基，一次性針頭濾器（孔徑0.45μm蛋白濃縮管。BamHIXhoI物轉化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α,操作步驟根據(jù)說明書進行。rJ.5.6將透析后的蛋白轉入蛋白濃縮管，于4℃4000rpm離心采集符合K.1要求的犬耳尖靜脈血1mL，分離血清犬血清中抗吉氏巴貝斯蟲的抗體。當出現(xiàn)8.7.2結果時符將符合K.2要求的犬頸動脈放血至死亡，無菌收集全該血清即為標準陰性對照血清，分裝于不同規(guī)格的血清瓶或離心管，置于-20℃冰箱將已知染蟲率的吉氏巴貝斯蟲培養(yǎng)物進行2800g2min離心，取下層107個染蟲紅細胞于無菌EP管中，加入1mL生理鹽水混勻。選擇符合L.1要求的比格犬，進行保定，隨后對注射位點消毒，將含107脈血1mL，分離血清。用BgSA1抗體檢測試紙條，檢測L.2分離的感染前血清和感染后將符合L.3要求的犬頸動脈放血至死亡，無菌收集全部血液，或采集需要量的靜脈血，分離血清。該血清即為吉氏巴貝斯蟲標準陽性對照血清，分裝于不同規(guī)格的血清瓶或離心管，置于-20℃冰箱保存羊抗鼠IgG：用純化的鼠免疫球蛋白免疫山羊后，取羊的B淋巴細胞，利用雜交瘤技術，通過細胞融合，篩選制成羊抗鼠抗體。該抗體用于膠體金試紙條硝酸纖維素膜（NC膜）的質(zhì)控線，以此檢驗試鼠抗犬IgG：用純化的犬免疫球蛋白免疫小鼠后，取小鼠的B淋巴細胞，利用雜交瘤技術，通過細胞融合，篩選制成鼠抗犬抗體。該抗體可與金標抗原-吉氏巴貝斯蟲抗體復合物結合，形成夾心抗原抗用氯金酸制備40nm膠體金顆粒，將SA1重組抗原與膠體金顆粒用配方為2%Tris，4%Casein的封閉液進行封閉。標記好將重懸好的金標記抗原溶液從冰