GB/T 18642-2021 旋毛蟲診斷技術(shù)

代替GB/T18642—2002旋毛蟲診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforTrichinellaspp.國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15壓片鏡檢法 26集樣消化法 37酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA法) 48熒光免疫層析試紙卡法 7 9 附錄A(規(guī)范性附錄)壓片鏡檢法溶液配制及判定示意圖 附錄B(規(guī)范性附錄)消化液配制 附錄C(資料性附錄)旋毛蟲集樣消化法流程圖 附錄D(規(guī)范性附錄)酶聯(lián)免疫吸附試驗用溶液配制 附錄E(規(guī)范性附錄)熒光免疫層析試紙卡試驗用溶液配制 附錄F(資料性附錄)熒光免疫層析試紙卡結(jié)構(gòu)及判定示意圖 附錄G(規(guī)范性附錄)多重PCR法用溶液配制 ⅢGB/T18642—2021本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T18642—2002《豬旋毛蟲病診斷技術(shù)》,與GB/T18642—2002相比，除編輯性修改外主要技術(shù)變化如下：——增加了規(guī)范性引用文件(見第2章);-——增加了術(shù)語和定義(見第3章);——增加了縮略語(見第4章);——增加了酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)診斷方法、酶聯(lián)免疫吸附試驗用溶液的配制(見第7章、附——增加了熒光免疫層析試紙卡診斷方法、熒光免疫層析試紙卡試驗用溶液配制、熒光免疫層析試紙卡結(jié)構(gòu)及判定示意圖(見第8章、附錄E和附錄F);——增加了用于旋毛蟲蟲種鑒定的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(多重PCR)診斷方法、多重PCR法用溶液配制(見第9章、附錄G);——增加了綜合判定(見第10章);--——增加了壓片鏡檢法溶液配制及判定示意圖(見附錄A)——增加了消化液的配制(見附錄B);——增加了旋毛蟲集樣消化法流程圖(見附錄C)。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林大學(xué)、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：GB/T18642—2021旋毛蟲(Trichinellaspp.)由英國學(xué)者JamesPanesPaget于1835年首次在倫敦一人尸體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，同年RichardOwen把該病原定名為Trichinellaspiralis。目前，旋毛蟲經(jīng)種屬鑒定已發(fā)現(xiàn)9個種及3個尚未明確的基因型。旋毛蟲是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，可感染人和150多種動物，主要通過生食或半生食寄生有活旋毛蟲的肉類(如豬肉、馬肉、犬肉及野生動物肉等)而引發(fā)。人旋毛蟲病(HumanTrichinellosis)的潛伏期長達(dá)2周～4周，死亡率2%～30%。該病被世界動物衛(wèi)生組織疫病。本標(biāo)準(zhǔn)的修訂參考了OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊》2017版(ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals,2017)、國際旋毛蟲病委員會(InternationalCommissiononTrichinellosis,ICT)《血清學(xué)試驗檢測動物和人體旋毛蟲感染的建議》2018版(Recommendationson theuseofserologicaltestsforthedetectionofTrichinellainfectioninanimalsandhumans,2018)和《旋毛蟲肌幼蟲基因分型建議》2018版(RecommendationsforgenotypingTrichinellamusclestagelar- vae,2018)相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)。血清學(xué)診斷增加了酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和熒光免疫層析試紙卡兩種技術(shù)，血清學(xué)診斷技術(shù)判定為旋毛蟲感染陽性或疑似陽性的樣本可進(jìn)一步通過消化法確證；分子生物學(xué)診斷增加了多重聚合酶鏈反應(yīng)(多重PCR)技術(shù)。1GB/T18642—2021旋毛蟲診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了家畜(豬、馬和犬屬動物)和野生動物旋毛蟲病原學(xué)診斷、酶聯(lián)免疫吸附試驗——多重PCR方法適用于旋毛蟲分離株種屬及基因型的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3.13.4旋毛蟲通過表皮分泌或通過消化道排出的各種分子產(chǎn)物。寄生于宿主肌細(xì)胞時期的旋毛蟲幼蟲。DMEM:杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay)2GB/T18642—2021HEPES:4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid]IL-ESP:腸道期幼蟲排泄分泌物(intestinallarvae-excretory/secretoryproducts)MES:2-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonicacid)ML-ESP:肌幼蟲排泄分泌物(musclelarvae-excretory/secretoryproducts)NHS:N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)PBS:磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsalinebuffer)SD:標(biāo)準(zhǔn)差(standarddeviation)5壓片鏡檢法5.1.3夾壓玻璃板。5.2.2本標(biāo)準(zhǔn)所有試驗用水均應(yīng)符合GB/T6682中一級水標(biāo)準(zhǔn)。剝離脂肪和結(jié)締組織，用剪刀順肌纖維方向，按隨機(jī)采樣的要求，從樣本上至少剪取28粒燕麥粒(2mm×10mm)大小的肉樣，將肉樣均勻地放置在夾壓玻璃板上，排成一排，每個夾壓玻璃板可放置16粒。將制好的壓片放在低倍顯微鏡下(放大倍數(shù)4×10),從壓片一端邊沿開始觀察，直到另一端為止。不清晰處，可在10×10的放大倍數(shù)下進(jìn)一步觀察。5.4.1肌細(xì)胞內(nèi)有圓形或橢圓形包囊，且包囊中央有蜷曲的蟲體，判定為形成包囊的旋毛蟲。旋毛蟲包囊鏡下判定示意圖見圖A.1。5.4.2肌細(xì)胞內(nèi)有呈直桿狀或略蜷曲狀態(tài)蟲體，判定為無包囊的旋毛蟲。無包囊旋毛蟲鏡下判定示意圖見圖A.2。3GB/T18642—20215.4.4發(fā)現(xiàn)形成包囊的旋毛蟲和無包囊的旋毛蟲均判定為旋毛蟲感染。6.1.4分液漏斗。6.1.7電動刀式絞肉機(jī)或碎肉機(jī)(孔徑≤3mm)。6.1.10恒溫培養(yǎng)箱。6.1.12培養(yǎng)皿(帶標(biāo)尺)。6.2試劑6.3操作流程操作流程見附錄C的圖C.1。宿主種類主要選擇的肌肉檢測質(zhì)量/g豬膈肌、舌肌馬咬肌、舌肌犬膈肌、咬肌、舌肌野豬膈肌、腓腸肌、舌肌熊膈肌、咬肌、舌肌海洋哺乳動物(海豹、海象)膈肌、舌肌、鰭肌鱷魚咬肌、肋間肌其他野生肉食動物舌肌、腓腸肌4GB/T18642—2021每只動物可采集100g肌肉組織樣本，或?qū)?shù)只動物肌肉樣本混合為100g(混合動物數(shù)量≤30個)。剝離脂肪和結(jié)締組織，與100g肉樣同等體積的鹽酸水溶液(B.1)混合，用刀式電動絞肉機(jī)短時間(5s～10s)絞碎10次～20次或用碎肉機(jī)攪碎，至樣本無可見細(xì)碎塊為止。6.4.3.1將攪碎樣本取出，放入3L燒杯中，用預(yù)熱的45℃±2℃消化液沖洗絞肉機(jī)或碎肉機(jī)中殘留樣本，并用預(yù)熱的消化液補(bǔ)足至2L(即每克樣本加入20mL消化液)。6.4.3.2用錫箔紙覆蓋燒杯防止溶液飛濺，置于加熱磁力攪拌器上(燒杯內(nèi)放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子),或置于普通攪拌器并將攪拌器放入45℃±2℃恒溫培養(yǎng)箱中，持續(xù)加熱攪拌30min～60min(可根據(jù)實際情況適當(dāng)延長或縮減時間),至消化液中無肉眼可見碎肉為止。6.4.4.1取不銹鋼篩網(wǎng)(篩孔直徑180μm),放置于漏斗上方，漏斗下方接一分液漏斗，消化完成后5min內(nèi)將樣本混懸液倒入篩網(wǎng)。6.4.4.2過濾后的燒杯和篩網(wǎng)用至少100mL的溫水(37℃)沖洗，以確保篩網(wǎng)上沒有蟲體殘留(允許存留少量不易消化的脂肪和結(jié)締組織)。6.4.4.3若篩網(wǎng)上有碎肉殘渣，則需將碎肉殘渣重新消化。6.4.5.1將濾液在分離漏斗中沉淀30min,使旋毛蟲沉到底部，此時完全開啟漏斗開關(guān)，將底部混懸液(約40mL)移入50mL的離心管中。6.4.5.2將離心管中的混懸液靜置10min,棄去部分上清液，保留10mL底部混懸液。6.4.5.3如底部混懸液仍較為混濁，則向底部混懸液中加入30mL溫水(37℃),重復(fù)6.3.5.2,直至底部混懸液清澈。將濾清的沉淀物倒入有標(biāo)尺的培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡(放大倍數(shù)4×10或10×10)下觀察有無蟲體和鈣化包囊。6.5結(jié)果判定結(jié)果判定如下：——顯微鏡下發(fā)現(xiàn)旋毛蟲或鈣化包囊，可確診為旋毛蟲感染?！旌蠘颖緸殛栃詴r，需對每個樣本進(jìn)行單獨消化鏡檢，以最終確定感染動物個體。7酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA法)5GB/T18642—20217.1.2不銹鋼篩網(wǎng)(篩孔直徑180μm)。7.1.3漏斗。7.1.4分液漏斗。7.1.5燒杯(1L和5L)。7.1.6離心管(15mL和50mL)。7.1.7注射器(10mL)。7.1.8電動刀式絞肉機(jī)或碎肉機(jī)(孔徑≤3mm)。7.1.9溫度計。7.1.10磁力攪拌器和轉(zhuǎn)子。7.1.11恒溫培養(yǎng)箱。7.1.12顯微鏡。7.1.13一次性針頭濾器(0.22μm)。7.1.14細(xì)胞培養(yǎng)箱。7.1.15超濾管或透析袋(截留分子質(zhì)量5000Da)。7.1.16酶標(biāo)板(48孔或96孔)。7.1.17微量可調(diào)移液器(2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格)。7.1.18培養(yǎng)皿(帶篩網(wǎng)，網(wǎng)孔直徑180μm)。7.2.1培養(yǎng)液，見附錄D的D.1。7.2.2青霉素、鏈霉素。7.2.30.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),見D.2。7.2.4包被緩沖液：超純水。7.2.5洗滌緩沖液，見D.3。7.2.6過氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物，見D.4。7.2.7顯色液，見D.5。7.3實驗動物Wistar大鼠，體重200g±20g。7.4操作方法7.4.1旋毛蟲收集將人工感染旋毛蟲的Wistar大鼠去除皮膚、內(nèi)臟、脂肪和結(jié)締組織后，按照6.4.2～6.4.5所列方法，收集旋毛蟲肌幼蟲。7.4.2旋毛蟲抗原制備7.4.2.1旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌物(ML-ESP)抗原制備7.4.2.1.1將收集的旋毛蟲肌幼蟲用含有青霉素(500U/mL)和鏈霉素(500U/mL)的培養(yǎng)液洗滌三次(每次靜置20min)。7.4.2.1.2將其放入含青霉素(250U/mL)和鏈霉素(250U/mL)的培養(yǎng)液中(密度為5000條/mL),37℃,10%二氧化碳，培養(yǎng)18h,收集上清液。6GB/T18642—20217.4.2.1.3用一次性針頭過濾器濾掉殘留的肌幼蟲及碎片后，用PBS通過超濾管或透析袋透析，去除分子質(zhì)量小于3000Da的蛋白，將回收得到的旋毛蟲ML-ESP抗原(終濃度為1000μg/mL,吸光度280/260>0.1)保存于—70℃?zhèn)溆谩?.4.2.1.4培養(yǎng)過程中應(yīng)保證培養(yǎng)基未被細(xì)菌、真菌等污染。7.4.2.1.5具體可參見ICT《旋毛蟲血清學(xué)診斷方法》(2018版)。7.4.2.2.1將收集的旋毛蟲肌幼蟲經(jīng)口感染W(wǎng)istar大鼠(8000條/只),6h后將大鼠處死，并立即取出的培養(yǎng)液洗滌3次，每次洗滌后2000g離心10min。將收集到的蟲體按照7.4.2.1.2～7.4.2.1.4所列用包被緩沖液分別將旋毛蟲ML-ESP及IL-ESP抗原稀釋至濃度為10μg/mL,將兩種抗原按1:1比。封板膜密封后置入37℃恒溫箱孵育60min或者4℃恒溫箱過夜。揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)包被液，在吸水紙上拍干或吹風(fēng)筒吹干。每孔加滿洗滌緩沖液，靜置30s后7.4.5.2用洗滌緩沖液將待測血清稀釋至工作濃度(1:50),加入待測樣本孔中，每孔100pL;陽性血清和陰性血清按照同樣比例稀釋至工作濃度并分別加入陽性和陰性對照孔，加樣量均為100μL;空白7.4.5.3用封板膜密封后放置室溫孵育30min。陰性對照血清和陽性對照血清來源見D.7。7.4.6加過氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物類的過氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物。7.4.6.2用洗滌緩沖液將抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物稀釋至工作濃度(1:5000～1:10000或按照試劑的操作說明),每孔加入100μL,放置室溫孵育30min。加入終止液后10min內(nèi)，通過酶標(biāo)儀檢測各孔在波長450nm處的光吸收值(OD?50值)。GB/T18642—2021若空白對照孔OD值小于0.1,陽性參考血清OD值在1.0±2SD范圍，且P/N值大于4,則試驗成待測樣本的P/N值≥4,判定該樣本為旋毛蟲感染陽性血清；若3≤P/N值<4,則判定該樣本為疑似旋毛蟲感染血清。8熒光免疫層析試紙卡法8.1.4pH計。8.1.7超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。8.1.8水平搖床。8.1.10微量可調(diào)移液器(2.5pL、10μL、100μL、200uL、1000μL等不同規(guī)格)8.2.1時間分辨熒光微球(1%,避光)。8.2.2山羊抗豬IgG。8.2.3兔抗山羊IgG。8.2.6玻璃纖維素膜。8.2.7吸水紙。8.2.11N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。78GB/T18642—2021方法同7.4.2,用0.01mol/LPBS緩沖液分別將旋毛蟲ML-ESP及IL-ESP抗原稀釋至2mg/mL,將兩種抗原按1:1比例充分混合(工作濃度均為1mg/mL)。8.3.2.3加入40μL的5mg/mL山羊抗豬IgG(0.01mol/LPBS緩沖液稀釋),室溫孵育1h。8.3.2.54℃,8100g離心15min,棄上清液。8.3.2.74℃超聲分散1mi將含有偶聯(lián)抗體的熒光微球用試紙噴膜儀噴涂至300mm×5mm玻璃纖維素膜上，噴涂量為50μL/cm,4℃真空抽干，于4℃干燥保存?zhèn)溆谩?.3.3.2.1用濃度為1mg/mL旋毛蟲ES混合抗原和0.625mg/mL兔抗山羊IgG(0.01mol/LPBS緩沖液稀釋)分別作為檢測線和對照線試劑。8.3.3.2.2用試紙噴膜儀將兩種試劑分別點在硝酸纖維素膜上，點樣量為1pL/cm。37℃干燥2h,4℃密封保存?zhèn)溆?。條切割機(jī)將其切成3.5mm寬的試紙條，將試紙條放入試紙卡中，將試紙卡放入含有干燥劑的密封袋8.4.2將試紙卡平放于操作臺面，加樣孔朝上，向加樣孔中加入100μL稀釋后的血清樣本，室溫靜置8.5試驗成立條件結(jié)果判定應(yīng)在加樣后20min內(nèi)進(jìn)行。試驗成立條件如下：——若陽性血清樣本的對照線和檢測線均顯色，陰性血清僅對照線顯色而檢測線不顯色，則試驗成立；9GB/T18642—2021——熒光免疫層析試紙卡檢測結(jié)果判定示意圖見附錄F的圖F.2。9多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(多重PCR法)9.1.3穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽。9.1.4凝膠成像儀(或紫外透射儀)。9.1.6無核酸酶水處理的離心管與吸頭。9.1.7PCR擴(kuò)增管。下列5條引物為上游引物：——5'-GTTCCATGTGAACAGCAGT-3';——5'-GCTACATCCTTTTGATCTGTT-3';——5'-GCGGAAGGATCATTATCGTGTA-3';——5'-GTGAGCGTAATAAAGGTGCAG-3';——5'-CAATTGAAAACCGCTTAGCGTGTTT-3'。下列5條引物為下游引物：——5'-CGAAAACATACGACAACTGC-3';—-——5'-AGACACAATATCAACCACAGTACA-3';——5'-TGGATTACAAAGAAAACCATCACT-3'; 5'-TTCATCACACATCTTCCACTA-3':———5'-TGATCTGAGGTCGACATTTCC-3'。合工作液。GB/T18642—20219.3試劑9.3.1PCR試劑9.3.1.3MgCl?:25mmol/L。9.3.2.1電泳緩沖液：50×TAE貯存液(見附錄G的G.1),臨用時加蒸餾水配成1×TAE緩沖液(配方9.3.2.4DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：分子大小范圍100bp～500bp,50bp梯度。9.4.2用T.spiralis蟲體作為陽性樣本。9.4.3用未感染旋毛蟲的豬或其他動物的肌肉作為陰性樣本。9.5.1DNA提取使用經(jīng)驗證的商品化DNA提取試劑盒提取DNA。10×PCR緩沖液dNTP(2.5mmol/L)MgCl?(25mmol/L)1pL下游引物混合工作液(10μmol/L)DNA模板雙蒸水補(bǔ)足至25mL具體可參見參考文獻(xiàn)[3]。第二階段，95℃變性10s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共進(jìn)行35個循環(huán)；9.6擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測9.6.12%瓊脂糖凝膠板的制備稱取2g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液中。加熱融化后加5pL(10mg/mL)溴乙錠，混勻后倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依據(jù)樣本數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔),放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。取10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2pL加樣緩沖液混勻后加入一個加樣孔。每次電泳同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker、陰性對照和陽性對照。電壓110V～130V或電流80mA～100mA,電泳30min～40min。9.7試驗成立條件陽性對照樣本有一條173bp擴(kuò)增條帶，陰性對照沒有條帶或僅有引物二聚體條帶，則試驗成立，結(jié)果有效。9.8結(jié)果判定9.8.1擴(kuò)增條帶分析不同大小擴(kuò)增條帶判定結(jié)果如下：-——待測樣本有一條173bp的擴(kuò)增條帶，可判定該旋毛蟲蟲種為T.spiralis(T1);——待測樣本有一條129bp的擴(kuò)增條帶，可判定該旋毛蟲蟲種為T.nativa(T2);——待測樣本有兩條擴(kuò)增條帶，分別為129bp和253bp,可判定該旋毛蟲蟲種為T.britovi(T3)-—待測樣本在292bp～360bp之間有1～3條擴(kuò)增條帶，可判定該旋毛蟲蟲種為T.pseudospir-alis(T4);——待測樣本有兩條擴(kuò)增條帶，分別為129bp和316bp,可判定該旋毛蟲蟲種為T.murrelli(T5);———待測樣本有兩條擴(kuò)增條帶，分別為129bp和210bp,可判定該旋毛蟲蟲種為T6;——待測樣本有兩條擴(kuò)增條帶，分別為135bp和253bp,可判定該旋毛蟲蟲種為T9;——待測樣本有一條240bp的擴(kuò)增條帶，可判定該旋毛蟲蟲種為T.papuae(T10);9.8.2序列分析9.8.2.1T.britovi(T3)、T8和T9擴(kuò)增條帶相近，可通過測序比對分析，確定蟲種或基因型。序列分析如下：GB/T18642—2021T3GTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTTGTTCGAATTT70T8GTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTTGTTCGAATTT70T9GTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTTGTTCGAATTT70**********************************************************************T3GCGACATGAATTGTAAGACTGTGTGT TTATTGTGTGTGTGCAGTTGTCGTATGTTTTCG129T8GCGACATGAATTGTAAGACTGTGTGTGTTTATTGTGT GTGCAGTTGTCGTATGTTTTCG129T9GCCACATGAATTGTAAGACTGTGTGTGTTTATTGTGTGTGCCTGTGCAGTTGTCGTATGTITICG135*********************************************************9.8.2.2T.nativa(T2)和T.patagoniensis(T12)擴(kuò)增條帶相近，可通過測序比對分析，確定蟲種或基因型。序列分析如下：T2GGTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTTGTTCGAATT70T12GGITCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGICAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTIGTTCGAATT70**********************************************************************T2TGCGACATGAATTGTAAGACTG1GTG--AATTGTGTGTGTGTGCAGITGTCGTATGTTITC129T12TGCGACATGAATTGTAAGACIGIGIGIGAATTGGGTGTGCAGITGTCGTATGTTITC127******************************************************10綜合判定10.1受檢動物樣本經(jīng)壓片鏡檢法(第5章)和集樣消化法(第6章)任一項檢測出旋毛蟲蟲體或包囊10.2受檢動物樣本經(jīng)ELISA法(第7章)和熒光免疫層析試紙卡法(第8章)任一項檢測出旋毛蟲特異抗體的，判定為該動物血清旋毛蟲抗體陽性，需進(jìn)一步通過集樣消化法(第6章)進(jìn)行確證。10.3經(jīng)多重PCR法(第9章)鑒定，可區(qū)分旋毛蟲不同種屬和基因型。GB/T18642—2021(規(guī)范性附錄)濃鹽酸(37%,密度1.179g/cm3)加雙蒸水至20mLA.2旋毛蟲包囊及無包囊旋毛蟲鏡下判定示意圖旋毛蟲包囊鏡下判定示意圖見圖A.1,無包囊旋毛蟲鏡下判定示意圖見圖A.2。圖A.1旋毛蟲包囊鏡下判定示意圖圖A.2無包囊旋毛蟲鏡下判定示意圖GB/T18642—2021(規(guī)范性附錄)消化液配制B.1鹽酸水溶液鹽酸(37%,密度1.179g/cm3)加雙蒸水至B.2消化液胃蛋白酶(1:10000NF/1:12500BP/1:2000FIP)鹽酸水溶液(B.1)消化液現(xiàn)用現(xiàn)配，用前預(yù)熱至45℃。2000mL2000mL(資料性附錄)旋毛蟲集樣消化法流程圖旋毛蟲集樣消化法流程圖見圖C.1。雙蒸水43℃~47℃20g(1:10000)10mL企部用于鏡檢40mi.圖C.1旋毛蟲集樣消化法流程圖(規(guī)范性附錄)酶聯(lián)免疫吸附試驗用溶液配制D.1培養(yǎng)液谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)液D.20.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCl)調(diào)pH值至7.2。gggD.3洗滌緩沖液氯化鈉(NaCl)脫脂奶粉50g調(diào)pH值至7.4。D.4過氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物(從試劑公司購買)選擇使用相應(yīng)動物種類的過氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物。D.5顯色液(TMB-過氧化氫尿素溶液)無水乙醇加雙蒸水至Na?HPO?檸檬酸GB/T18642—2021加雙蒸水至100mL調(diào)pH值至5.0～5.4。D.6終止液雙蒸水濃硫酸加雙蒸水至D.7陰性對照血清和陽性對照血清200mL34mL300mL陰性對照血清和陽性對照血清可從以下OIE認(rèn)證的旋毛蟲病協(xié)