備課素材：菌落計(jì)數(shù)易錯(cuò)點(diǎn)-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

菌落計(jì)數(shù)易錯(cuò)點(diǎn)“微生物數(shù)量的測(cè)定”是高中生物學(xué)選擇性必修三教學(xué)的重難點(diǎn)。稀釋涂布平板法是對(duì)微生物計(jì)數(shù)的常用方法，用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約有多少活菌：但對(duì)菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果處理往往成為學(xué)生的易錯(cuò)點(diǎn)。如：在從土壤中分離產(chǎn)脲酶細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)中，將10g土壤樣液梯度稀釋?zhuān)?個(gè)培養(yǎng)基平板上均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣液0.1mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為42、200、256。則1g土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為個(gè)。很多學(xué)生得出的答案為：1.66×108。同時(shí)，學(xué)生對(duì)于42這個(gè)數(shù)據(jù)如何處理存在疑問(wèn)：是否需要舍棄？如果需要舍棄，標(biāo)準(zhǔn)是什么？根據(jù)教材的表述：為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30~300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。但是，若想當(dāng)然地認(rèn)為42、200、256三個(gè)數(shù)據(jù)均處于30~300范圍之內(nèi)，然后直接求平均值，再乘以稀釋倍數(shù)，就會(huì)得出1.66×108的錯(cuò)誤結(jié)果。這也是很多學(xué)生產(chǎn)生錯(cuò)誤的原因。事實(shí)上，教材中的相關(guān)表述只是在說(shuō)明可計(jì)數(shù)的菌落數(shù)量的適宜范圍。某一稀釋度下的3個(gè)平板中菌落數(shù)并不能簡(jiǎn)單地直接求平均值，還應(yīng)該關(guān)注稀釋度的設(shè)置以及計(jì)數(shù)結(jié)果的允許差。為了確保有效活菌數(shù)的準(zhǔn)確測(cè)定，在采用平板計(jì)數(shù)檢測(cè)中，必須設(shè)3個(gè)稀釋度且成梯度，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用104、105和106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測(cè)定放線菌的數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋?zhuān)粶y(cè)定真菌的數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋。如果平板中菌落的數(shù)量太少，必然會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差太大；反之，如果平板中菌落數(shù)量過(guò)多，會(huì)造成計(jì)數(shù)上的困難。因此，國(guó)際上通用的菌落計(jì)數(shù)的基本原則，是以平板上出現(xiàn)30~300個(gè)菌落數(shù)的稀釋平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)要求，同一個(gè)稀釋度重復(fù)3次的平板上菌落數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差值應(yīng)小于允許差值。也就是說(shuō)，在平板計(jì)數(shù)檢測(cè)中，如果同一稀釋度下的3次重復(fù)菌落數(shù)雖然均處于30~300個(gè)范圍之內(nèi)，但數(shù)據(jù)相差較大，就需要舍棄。同一稀釋度下3個(gè)重復(fù)的允許差值標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算公式如下：

式中：SD——標(biāo)準(zhǔn)差，x——同一稀釋度任一平板菌落數(shù)，——同一稀釋度平板菌落平均值，n——同一稀釋度平板重復(fù)次數(shù)。平板菌落數(shù)的允許差值如表1：。由表1可知，如果平板上3次重復(fù)的菌落平均數(shù)較小，其允許的誤差就?。环粗?，如果菌落平均數(shù)較大，則其允許的誤差就大一些。若選一個(gè)適宜稀釋度計(jì)數(shù)，則3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差值應(yīng)小于規(guī)定的允許差值。若3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差值大于規(guī)定的允許差值，則無(wú)法正確計(jì)數(shù)，必須重新測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差公式，對(duì)上題計(jì)算如下：參照表1中菌落數(shù)的允許差值可以看出，平板菌落平均數(shù)166處于101~300之內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)所允許差值為±≤50。但經(jīng)計(jì)算得知，該稀釋度下3個(gè)平板菌落數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差值±111已遠(yuǎn)超允許差值。因此，本次的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合要求，無(wú)法正確計(jì)數(shù)，需要重做。為更好地理解和熟練掌握微生物平板菌落計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)處理方法，提供3組示例（表2）以供參考和借鑒。例、如圖是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的過(guò)程。（1）圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以_____為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需添加_____作指示劑，產(chǎn)脲酶細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，其菌落周?chē)闹甘緞⒆僟___________________色。（2）在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。該過(guò)程采取的接種方法是_____，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為_(kāi)___________×108個(gè)；與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比，此計(jì)數(shù)方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)較_____。DNA疫苗是指將編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因(圖甲)插入到適宜的質(zhì)粒(圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導(dǎo)入人體內(nèi)，在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物可直接誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)。圖中BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ分別是限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。試回答下列問(wèn)題：（3）基因工程的核心步驟是______________。將編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因與質(zhì)粒連接在一起要用到_____酶，該酶的本質(zhì)是_________。（4）DNA疫苗表達(dá)的產(chǎn)物稱(chēng)之為_(kāi)____，人體是否產(chǎn)生免疫應(yīng)答，需檢測(cè)血漿中的_____。（5）從分子水平上分析，不同種生物的基因可在人體細(xì)胞中成功表達(dá)，可以說(shuō)明__________。（6）編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因(圖甲)和質(zhì)粒(圖乙)構(gòu)建重組DNA，即DNA疫苗。限制性核酸內(nèi)切酶的切點(diǎn)分別是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯(cuò)誤的是_____。A.構(gòu)建DNA疫苗時(shí)，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒B.構(gòu)建DNA疫苗時(shí)，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒C.圖乙中的質(zhì)粒只用EcoRⅠ切割后，含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)D.用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，只能產(chǎn)生一種連接產(chǎn)物【答案】尿素酚紅紅稀釋涂布平板法1.75少構(gòu)建重組DNA分子(質(zhì)粒)DNA連接蛋白質(zhì)抗原抗體它們共用一套遺傳密碼D【解析】1、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理：培養(yǎng)基的氮源為尿素只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素以尿素作為氮源缺乏脲酶的微生物因?yàn)椴荒芊纸饽蛩?，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖而受到抑制所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。2、鑒定分解尿素的細(xì)菌:細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌若指示劑變紅可確定該種細(xì)菌能夠產(chǎn)生脲酶，并分解尿素?；蚬こ痰幕静僮鞒绦颍?、目的基因的獲?。海?）目的基因是指：編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。（2）獲取方法：①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲?。虎谌斯ず铣桑ǚ崔D(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法）；③PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建:（1）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（2）組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因。①啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。③標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞:（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射技術(shù)、Ca2+處理法。（3）重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。4、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)：（1）首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。（2）其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。（3）最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原--抗體雜交。（4）有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物是否出現(xiàn)抗蟲(chóng)性狀。（1）篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基應(yīng)以尿素為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需要添加酚紅作指示劑，產(chǎn)脲酶細(xì)菌產(chǎn)生的脲酶可以將尿素分解成氨，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH升高，菌落周?chē)闹甘緞⒆兂杉t色。（2）圖中過(guò)程采取的接種方法是稀釋涂布平板法，舍棄13的平板，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為：(156+178+191)/3÷0.1×105=1.75×108，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法所得數(shù)據(jù)包括死的細(xì)菌，且稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)所計(jì)菌落數(shù)少于真正的活細(xì)菌數(shù)，故與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比，此計(jì)數(shù)法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)較少。（3）基因工程的核心步驟是構(gòu)建重組DNA分子(質(zhì)粒)。基因工程中要用DNA連接酶將編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因與質(zhì)粒連接在一起；DNA連接酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。（4）據(jù)題意可知，DNA疫苗是指將編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因插入適宜的質(zhì)粒中得到的重組DNA分子，其表達(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，又因?yàn)樵摦a(chǎn)物可直接誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，由此推知該產(chǎn)物是抗原；人體是否產(chǎn)生免疫應(yīng)答，需檢測(cè)血漿中是否含相應(yīng)抗體。（5）不同種生物的基因可在人體細(xì)胞中成功表達(dá)，從分子水平上說(shuō)明了不同生物共用一套遺傳密碼。（6）用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因，目的基因的兩端將形成不同的粘性末端，若用BglⅡ和Sau3AⅠ切割圖乙所示質(zhì)粒，質(zhì)粒的兩端也將形成這樣兩種相同的粘性末端，它們可構(gòu)成重組DNA分子，A正確；據(jù)圖甲可知，Sau3AⅠ的切割位點(diǎn)在EcoRⅠ的左側(cè)，因此用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因，目的基因的兩端將形成不同的粘性末端，若用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割圖乙所示質(zhì)粒