早胚發(fā)育課件

早胚發(fā)育的細(xì)胞生物學(xué)早胚發(fā)育為研究早胚發(fā)育提供一些構(gòu)思框架，均為涉及發(fā)育通性的內(nèi)容早胚發(fā)育人胚胎發(fā)生（Embryogenesis）從受精到出生后歷時(shí)約38周前8周為胚胎（Embryos）

受精卵→二胚層胚盤形成（2周末）→三胚層胚盤形成→進(jìn)一步形成各組織、器官、系統(tǒng)以及初具雛形的胎兒。后30周為胎兒（Fetus）

逐漸長(zhǎng)大，各器官、系統(tǒng)的發(fā)育逐漸完善并出現(xiàn)功能活動(dòng)。早胚發(fā)育Embryodevelopment

(Preimplantation)早胚發(fā)育(A)lateblastocyst(B)shortlyafterimplantation早胚發(fā)育(C)slightlylaterthanthe(B)早胚發(fā)育About9to10daysfertilizationage早胚發(fā)育About13daysfertilizationage早胚發(fā)育SchemeillustratingtheoriginandderivativesoftissueBlastocystEmbryonicectodermEmbryonicendodermInnercellmassTrophoblastEpiblastHypoblastEmbryonicepiblastAmnioticectodermExtra-amnioticectodermPrimitivestreakNotochordralprocessMesodermAllantoicendodermExtra-embryonicendodermEmbryonicendodermYolksacendodermCytotrophoblastSyncytiotrophoblast早胚發(fā)育歷史回顧早胚發(fā)育早在十九世紀(jì)初，人們已意識(shí)到生命有機(jī)體是由細(xì)胞組成的，發(fā)育期間的許多新生的細(xì)胞都是來自卵裂的產(chǎn)物，并由這些產(chǎn)物形成一些新型的細(xì)胞。這就否定了過去的先成論者（preformation）的論點(diǎn)，即認(rèn)為胚胎預(yù)先存在于動(dòng)植物的配子中，而是支持漸成論（epigenesis）的論點(diǎn)，即從受精卵漸進(jìn)發(fā)育而來的。早胚發(fā)育Aristotle(384-322B.C)，研究人體從何而來？“無果”Galen(130-200A.D)，肉眼觀察，收效甚微；Graaf(1672)，卵巢、卵泡肉眼觀察；Hamm&Leeuwenhoek(1677)，開始意識(shí)到雌雄配子(gametes)在發(fā)育中的價(jià)值。就此出現(xiàn)了“Thespermists”&“Theovists”

兩大陣營(yíng)。早胚發(fā)育Somepreformationistsbelievedthatanhomunculuswascurledupintheheadofeachsperm.

(一些先成論者相信，在每一個(gè)精子頭部存在卷曲的侏儒型人體)Animaginativedrawing,afterNicholasHartsoeker(1694)早胚發(fā)育Bonnet(1745)發(fā)現(xiàn)某些昆蟲卵能孤雌生殖發(fā)育，使Ovists陣營(yíng)占上風(fēng)；Spallanzani(1729-1799)，意大利神父，指出在正常情況下，雄性和雌性產(chǎn)物對(duì)發(fā)育的啟動(dòng)是必需的；Wolff(1733-1794)，德國(guó)生物學(xué)家，提出涉及epigenesis的新論點(diǎn)，即認(rèn)為胚胎發(fā)育是通過漸進(jìn)重塑(remoeling)和生長(zhǎng)來實(shí)現(xiàn)的。本論點(diǎn)的提出致使一些陳舊的學(xué)說均遭拋棄；Vonbaer(1828)，首次強(qiáng)調(diào)在發(fā)育過程中，任何類型動(dòng)物具通性的基礎(chǔ)特征（basicfeatures）均于發(fā)育早期呈現(xiàn)。該觀點(diǎn)有時(shí)被稱作“Vonbaer'slaw”。他還提出在胚胎中存在胚層（germlayers），就其存在的真正意義仍不清楚。早胚發(fā)育Weismann(1834-1914)assumedthattherewerefactorsinthenucleusthatweredistributedasymmetricallytodaughtercellsduringcleavageanddirectedtheirfuturedevelopment

(魏斯曼假定,核內(nèi)有一些因子，它們會(huì)在卵裂過程中不均一的分配進(jìn)子細(xì)胞，并指導(dǎo)決定后者的發(fā)育方向）Weismann’stheoryofnucleardetermination早胚發(fā)育

首次將體細(xì)胞系(somaticcelllines)和生殖細(xì)胞系(germcelllines)區(qū)別開，他認(rèn)為生殖細(xì)胞系對(duì)確保種系的永存是必需的，而體細(xì)胞是維護(hù)和保存種質(zhì)（germplasm）的主要載體。就今天來看，該觀點(diǎn)顯得不夠全面，但無論如何提及到生殖細(xì)胞系在維持種系生命中的重要性。早胚發(fā)育Roux(1850-1924)，hisexperimenttoinvestigateWeismann’stheoryofmosaicdevelopment經(jīng)過第一次卵裂后的蛙胚胎一分為二，用熱針將其中一個(gè)燙死，保留另一個(gè)。待發(fā)育到囊胚階段，可以看出，在胚胎的正常未受損側(cè)細(xì)胞，正常分裂為多細(xì)胞。其發(fā)育僅限于未受損的半側(cè)。而受損的半側(cè)無細(xì)胞形成。在神經(jīng)胚階段，未受損細(xì)胞發(fā)育成類似于正常的半胚胎，從而似乎支持了Weismann的鑲嵌型發(fā)育學(xué)說。早胚發(fā)育

Driesch不久在海膽卵上重復(fù)（類似）Roux的實(shí)驗(yàn)，卻獲得完全不同的結(jié)果。通過分離2細(xì)胞期海膽早胚的兩個(gè)卵裂球，發(fā)現(xiàn)單個(gè)卵裂球亦能發(fā)育為一個(gè)完整的正常幼體，唯體型小些。他首次提出發(fā)育從屬一種調(diào)控現(xiàn)象（phenomenonofregulation）早胚發(fā)育Spemann&Mangold(1924)取蠑螈原腸胚的胚孔背唇(紅色)移植至另一品種帶色素的蠑螈原腸胚的胚孔對(duì)側(cè)部位，結(jié)果移植塊將帶色素的寄主組織誘導(dǎo)出新的含神經(jīng)管和體節(jié)的體軸。他們將該背唇的組織者(organizer)區(qū)稱作Spemannorganizer。早胚發(fā)育

Johannsen(1909)，首先提出有助于將遺傳學(xué)與胚胎學(xué)聯(lián)系起來的重要觀點(diǎn)——即基因型(genotype)與表型(phenotype)的區(qū)別?；蛐拖嗤碾p生子之間，可因一些非遺傳因素而出現(xiàn)表觀上的差異。早胚發(fā)育20世紀(jì)40年代，基因編碼蛋白的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步有助揭示細(xì)胞性狀與其所含蛋白的關(guān)系，證明基因具控制發(fā)育期間細(xì)胞組分和行為的作用。60年代，意識(shí)到某些基因編碼的蛋白能控制其它基因的活性。第一個(gè)發(fā)育相關(guān)基因是通過自發(fā)突變（spontaneousmutation）鑒定出來的，因變異導(dǎo)致功能混亂并由此產(chǎn)生異常的表型。早胚發(fā)育突變類型隱性突變（Recessivemutation）只有在homozygous狀態(tài)下才顯示；只有在heterozygous狀態(tài)下不顯示半顯性突變（Semi-dominantmutation）以Brachyury基因?yàn)槔?，在homozygous狀態(tài)下，致死（胚胎）；在heterozygous狀態(tài)下，尾巴短小早胚發(fā)育小鼠半顯性突變Brachyury(T)的遺傳譜早胚發(fā)育最近，一類與發(fā)育相關(guān)的新基因被發(fā)現(xiàn)，它們不編碼蛋白質(zhì)而是編碼一段特殊的短RNA，稱為小RNA（microRNAs，miRNAs）。它們通過阻止特定的一些mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這種天然的（基因表達(dá)）沉默模式與小分子干擾RNA的RNA干擾模式類似。盡管在加工機(jī)器上有一些交叉重疊，但是miRNAs仍然是作為一種獨(dú)特的現(xiàn)象出現(xiàn)的。microRNAs首次是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的，是基因let-7,和lin-4的產(chǎn)物，它們控制著發(fā)育的時(shí)相。在線蟲（nematodes）中，也發(fā)現(xiàn)一些其它miRNA已在發(fā)育中的作用。在果蠅中，miRNA的bantam具抑制細(xì)胞凋亡的作用?，F(xiàn)在已經(jīng)有證據(jù)表明有多達(dá)1%的人類基因編碼miRNA，其中一些人類miRNA的調(diào)節(jié)作用正在被揭示。早胚發(fā)育

初級(jí)miRNA(primarymiRNA)具幾百個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，包含成熟miRNA具備的一段反向重復(fù)序列。經(jīng)過核內(nèi)的初步加工后，該轉(zhuǎn)錄本自身回折形成一個(gè)雙鏈RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即前miRNA（pre-miRNA），這種前miRNA將被運(yùn)送到胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，它被Dicer酶剪切成一個(gè)單鏈的長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的短miRNA。如同RNA干擾反應(yīng)，miRNA作為向?qū)NA（guideRNA）參入到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，這種復(fù)合物專一地靶向一種mRNA。比較典型的是，動(dòng)物的miRNA并不與它們的靶mRNA完全互補(bǔ)，與siRNA不一樣，前者存在少量錯(cuò)配的堿基。一旦結(jié)合，這種蛋白復(fù)合物將使靶mRNA失活，從而阻抑翻譯，但靶mRNA并未降解?？墒牵S多植物的miRNA似乎與它們的靶mRNA完全互補(bǔ)，因此，這些靶mRNA被一種與RNA干擾反應(yīng)中采用的相同機(jī)制降解。早胚發(fā)育MicroRNA早胚發(fā)育發(fā)育的兩個(gè)主要功能1、在每一子代中確保細(xì)胞的多樣性和細(xì)胞的有序性（Celldiversityandorder）。2、保證代代相傳的生命連續(xù)性（Continuityoflife）。*細(xì)胞多樣性產(chǎn)生的過程----分化（Differentiation）；*分化細(xì)胞構(gòu)成組織和器官的過程-----形態(tài)發(fā)生和生長(zhǎng)

（MorphogenesisandGrowth）；*生命連續(xù)性的實(shí)現(xiàn)靠-----生殖（Reproduction）。早胚發(fā)育針對(duì)發(fā)育具共性的研究焦點(diǎn)為：一、發(fā)育的通用轉(zhuǎn)錄調(diào)控戰(zhàn)略（以哺乳動(dòng)物骨骼肌特化的機(jī)制為例）。二、發(fā)育中一些轉(zhuǎn)錄程序（transcriptionprogram）和細(xì)胞間信號(hào)通訊及通訊之間的關(guān)系（以TGFβ-超家族蛋白作為細(xì)胞外信號(hào)實(shí)現(xiàn)的胚胎發(fā)育背腹圖式的機(jī)制為例）。早胚發(fā)育一、發(fā)育的通用轉(zhuǎn)錄調(diào)控戰(zhàn)略（以骨骼肌特化的機(jī)制為例）三步曲1、成肌細(xì)胞（Myoblast）的決定（Determination），體節(jié)（一些中胚層細(xì)胞的集合物）中某些細(xì)胞被允諾規(guī)格化并成為成肌細(xì)胞；2、成肌細(xì)胞增殖或某種情況下遷移（ProliferationandMigration）；3、分化為成熟的具多核的骨骼肌細(xì)胞（Differentiation）。早胚發(fā)育細(xì)胞在獲得一些特化功能（分化）之前，均涉及一個(gè)允諾（Commitment）的過程。經(jīng)允諾，這些細(xì)胞的表型與未經(jīng)允諾的無差別，但其發(fā)育的命運(yùn)受限制。整個(gè)Commitment過程可區(qū)分為兩個(gè)階段，第一階段稱作規(guī)格化（specification），在合適的環(huán)境中該細(xì)胞能自主分化，屆時(shí)的允諾是可逆的；第二階段為決定（determination），屆時(shí)的細(xì)胞即便植入到胚胎的另一部位（或環(huán)境中），仍能自主分化，表明其允諾已是不可逆的。早胚發(fā)育成肌細(xì)胞（Myoblasts）的決定成肌細(xì)胞源自由中胚層細(xì)胞群組成的胚胎體節(jié)（somites），為骨骼肌細(xì)胞的前體，而這些體節(jié)位于胚胎神經(jīng)管的兩側(cè)。當(dāng)然，體節(jié)還能衍生出其它組織。源自神經(jīng)管和兩側(cè)外胚層的信號(hào)對(duì)體節(jié)中myoblast的決定起非常重要的作用。早胚發(fā)育一些即將形成肢體肌肉的生肌細(xì)胞自其從屬的肌節(jié)（Myotome）的兩側(cè)部分遷移至發(fā)育中的肢芽；成肌細(xì)胞排列成行、停止分裂、融合成合胞體（Syncytium）或稱肌管（myotube）；再經(jīng)分化形成開始有收縮能力的肌細(xì)胞。在“融合的期間”，一些與肌肉發(fā)育和功能化有關(guān)的基因表達(dá)。其它一些處在肌節(jié)背側(cè)部分和中部部分尚未遷移的生肌細(xì)胞則將分化為軀干的肌肉。誘導(dǎo)每一群生肌細(xì)胞“決定”的一些特異的細(xì)胞外信號(hào)只作“瞬間表達(dá)”。由這些信號(hào)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)不少因子的表達(dá)，以便在無誘導(dǎo)信號(hào)的情況下維持生肌程序（ＭaintenanceofMyogenicprogram）。早胚發(fā)育Embryonicdeterminationandmigrationofmyoblastsinmammals.(a).Skeletalmuscleisderivedfromembryonicstructurescalledsomites,whichareblocksofmesodermalcells.(b).Afterformationoftheneuraltube,eachsomiteformsadermomyotome（生皮肌節(jié)）,whichgivesrisetoskinandmuscle,andasclerotome（生骨節(jié)）,whichdevelopsintoskeletalstructures.Myoblastsformateachedgeofadermomyotome.Lateralmyoblastsmigratetothelimbbud.Axialmyoblastsformthemyotome（生肌節(jié)）.(c).Thedermotomegiesrisetoskinelements(dermis),andthemyotometoaxialmuscle.早胚發(fā)育以C3H10T1/2成纖維細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停隗w外成功地剖析了骨骼肌發(fā)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制當(dāng)這些細(xì)胞培養(yǎng)在含有5-氮胞嘧啶核苷（5-azacytidine）的培養(yǎng)液中，不少細(xì)胞成為肌管。推測(cè)：由于5-氮胞嘧啶核苷是一些不能被甲基化的胞嘧啶核苷衍生物，進(jìn)入細(xì)胞后被轉(zhuǎn)化為5-氮脫氧胞嘧啶核苷并摻入DNA，使摻入的DNA部分具轉(zhuǎn)錄活性，致使被摻入到位的細(xì)胞因原先被甲基化而遭抑制的基因重新活化，由此驅(qū)動(dòng)肌肉發(fā)育程序。早胚發(fā)育ExperimentalsystemforstudyingmammalianmyogenesisAfibroblastcelllinecalledC3H10T1/2canbeconvertedintomusclecellsbyincubatingthemwith5-azacytidine.Underappropriateconditions,intermediateprecursorcells,termedazamyoblasts,accumulate.DNAisolatedfromazamyoblastscandriveconversionofuntreatedC3H10T1/2cellsintomusclecells.早胚發(fā)育為了檢驗(yàn)上述假說，研究者分離了在含5-氮胞嘧啶核苷的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的C3H10T1/2（azamyoblasts）DNA，轉(zhuǎn)染到未經(jīng)5-氮胞嘧啶核苷處理的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)萬分之一被轉(zhuǎn)染細(xì)胞成為肌管，啟示有”一個(gè)或少數(shù)”被5-氮胞嘧啶核苷化的基因與成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌管有關(guān)。

通過差減篩選源自Azamyoblasts和Myoblasts的cDNAs，取得一些與骨骼肌發(fā)生有關(guān)的基因，統(tǒng)稱肌肉調(diào)節(jié)因子（Muscle-regulatoryfactors，MRFs），包括myoD(myogenicdeterminationgeneD,成肌決定因子),myogenin（成肌素），myf5和myf4，均為轉(zhuǎn)錄因子。早胚發(fā)育MyoD、myogenin、myf5、myf4均為堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）家族成員（轉(zhuǎn)錄因子）

這些蛋白的中央段為HLH結(jié)構(gòu)域（Helix-Loop-Helixdomain，HLH），其N端毗連能結(jié)合DNA的堿性區(qū)（DNA-bindingbasicregion,B）。HLH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)形成二聚體。在DNA-binding/dimerization區(qū)的兩翼為反式激活結(jié)構(gòu)域（transactivationdomains）。上述的4種生肌bHLH蛋白總稱為MRFs(muscle-regulatoryfactors)。早胚發(fā)育關(guān)于MEFs，稍后會(huì)有述及。早胚發(fā)育

bHLH蛋白有同源二聚體和異源二聚體之分，這些蛋白分子均能與具有由CANNTG序列（Ebox，N代表任一核苷酸）組成的DNA位點(diǎn)結(jié)合。Ebox出現(xiàn)在基因組的許多不同部位（每256個(gè)核苷酸就可有一個(gè)Ebox），因此必然有某些機(jī)制以確保MRFs專一地調(diào)節(jié)這些肌肉特異基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。早胚發(fā)育MyoD與另一種bHLH蛋白“E2A”可構(gòu)成異源二聚體，其DNA親和力要比同源二聚體的高十倍。正是如此，在制備azamyoblasts的過程中，發(fā)現(xiàn)E2A與MyoD復(fù)合成異源二聚體為C3H10T1/2細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞所需。E2A和MyoD結(jié)合DNA的堿性區(qū)氨基酸序列非常相似，均能識(shí)別DNA的Ebox序列。由于E2A也在其它組織中有表達(dá)，因此它并不是構(gòu)成肌肉特化(myogenicspecificity)的充分條件。早胚發(fā)育abcAnMRF-E2A-MEFcomplexcanassembleinthetranscription-controlRegionofmuscle-specificgenescontaininganEbox,MEFbox,orbothThesynergisticactionoftheMEFhomodimerandMRF-E2Aheterodimer,whichdirectlyinteract,driveshigh-levelexpressionofmuscle-specificproteins.早胚發(fā)育只有當(dāng)兩個(gè)或者更多的MyoD結(jié)合多元Eboxes，MyoD才激起轉(zhuǎn)錄，這種多元結(jié)合具協(xié)同作用。雖然大部分的肌肉特異增強(qiáng)子中有多元Eboxes序列，但這些多元Eboxes序列也在其它組織中專一表達(dá)的基因中出現(xiàn)。例如，E2A亦為B細(xì)胞的正常發(fā)育所需，它通過與含多元Eboxes的結(jié)合調(diào)節(jié)著B細(xì)胞的一些專一基因表達(dá)。因此不論是多元Eboxes或是E2A均不是構(gòu)成肌肉特化的充分條件。在酵母中亦發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)不同組合,作用在不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)的，可達(dá)到產(chǎn)生不同特化型細(xì)胞的作用，這一現(xiàn)象對(duì)解釋肌肉特化機(jī)制很有啟發(fā)。早胚發(fā)育骨骼肌細(xì)胞究竟是如何特化的？有些看法源自對(duì)E2A變體蛋白的一些分析研究結(jié)果。野生型E2A蛋白自身無能驅(qū)動(dòng)C3H10T1/2細(xì)胞成為成肌細(xì)胞。為查明MyoD的哪些特性賦予引發(fā)肌肉特化，研究者從改造E2A分子入手，即將MyoD分子中的特異氨基酸取代E2A相應(yīng)部位的氨基酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2A變體中只需有3個(gè)氨基酸被置換成MyoD相應(yīng)部位的3個(gè)氨基酸就能使C3H10T1/2細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌管。其中2個(gè)為位于E2A中央堿性DNA結(jié)合區(qū)的氨基酸，另一則為毗鄰該區(qū)的氨基酸。早胚發(fā)育雖然這些氨基酸的取代使E2A能驅(qū)動(dòng)向生肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但并未影響E2A的DNA結(jié)合專一性。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)推測(cè)：特化肌肉的生成似乎應(yīng)歸因于MyoD與其它一些蛋白專一作用的結(jié)果。最近的一些研究又進(jìn)一步表明，所有MRFs的bHLH結(jié)構(gòu)域中有些專一氨基酸可使MRF-E2A復(fù)合物能與另一類DNA結(jié)合蛋白家族成員專一結(jié)合，該家族成員被稱為肌肉增強(qiáng)子-結(jié)合因子（MEFs,

muscleenhancer-bindingfactors）。早胚發(fā)育*MADS域?yàn)镸EFs的DNA結(jié)合區(qū)，具有56個(gè)殘基的保守序列早胚發(fā)育生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)：MEF同源二聚體蛋白能結(jié)合從屬肌肉專一增強(qiáng)子結(jié)合的某些DNA序列(MEFBox)，MEFs從屬于轉(zhuǎn)錄因子的MADS家族。MEFs除了含有N-末端MADS結(jié)構(gòu)域外，還含有一小段氨基酸序列緊挨MADS結(jié)構(gòu)域的C-末端（稱作MEF結(jié)構(gòu)域）和一個(gè)C-末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（C-terminaltranscription-activationdomain

）。有兩個(gè)理由可將MEFs視作能與MRFs相互作用的最佳侯選因子：其一，肌肉的許多專一基因含有MEF-和MRF-識(shí)別序列；其二，雖然MEFs無能誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞的生肌轉(zhuǎn)化，卻具增強(qiáng)MRFs實(shí)現(xiàn)C3H10T1/2的生肌轉(zhuǎn)化能力。這種轉(zhuǎn)化作用有賴于MEF與MRF-E2A異源二聚體之間的相互作用。早胚發(fā)育不同轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用有賴于MEF同源二聚體中的MADS和MEF結(jié)構(gòu)域，以及有賴于MRF-E2A異源二聚體bHLH中的生肌專一氨基酸序列。根據(jù)結(jié)合在DNA的MRF-E2F晶體學(xué)分析表明被埋藏在DNA大溝內(nèi)的氨基酸，無能直接與MEFs接觸。所以，這些氨基酸似乎賦予MRF-E2A異源二聚體的其它區(qū)域以特有的構(gòu)型專一地與MEFs作用。早胚發(fā)育奇怪的是，雖然這兩類蛋白均能分別與一些特異的DNA序列結(jié)合，但只要識(shí)別其中任一類型蛋白的DNA單一位點(diǎn)，均足以成為組裝MRF-E2A-MEF的平臺(tái)(見第18張的圖)。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)推測(cè)：由這些因子識(shí)別的一些不同的DNA位點(diǎn)，均可能驅(qū)動(dòng)高水平的肌肉專一基因表達(dá)。事實(shí)上，有些肌肉專一基因含一些bHLH結(jié)合位點(diǎn)(即Eboxes)；另外有些則含一些MEF結(jié)合位點(diǎn)(即MEFBox)。與那些僅在發(fā)育中肌肉表達(dá)的MRFs相反，MEFs還在其它組織包括發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。早胚發(fā)育在體外的C3H10T1/2細(xì)胞中，四種MRFs（myoD,myogenin,myF5和myF4）的任一種表達(dá)均能誘導(dǎo)該細(xì)胞分化為肌肉細(xì)胞。在體內(nèi),這些蛋白在正常生肌過程中的功能已在基因敲除的動(dòng)物中進(jìn)行了分析研究。采用靶基因敲除變異法，已成功獲得myoD、myf5或myogenin等基因被敲除的一些小鼠。通過分析敲除基因后的效應(yīng)，可判斷出這些基因是否為肌發(fā)生所需，在何時(shí)起作用。早胚發(fā)育早胚發(fā)育敲除myoD或myf5基因的小鼠仍具備正常肌肉，但是敲除了myogenin基因的小鼠，其大部分的骨骼肌缺失。在缺myogenin基因的小鼠中，在一些正常情況下被骨骼肌占位的地方卻被大量成肌細(xì)胞集聚，結(jié)果為成肌細(xì)胞的形成無需myogenin，但這些成肌細(xì)胞無能進(jìn)一步形成肌管。然而在體外培養(yǎng)環(huán)境中,任一種MRF蛋白均能驅(qū)動(dòng)生肌程序，任一基因的缺失均可借助其它基因的功能所補(bǔ)償。早胚發(fā)育事實(shí)上，一些myf5和myoD變異的純合子小鼠，它們?cè)诔錾蟛痪镁退廊?，且無骨骼肌。與myogenin變異體相反，myf5變異體中成肌細(xì)胞無能聚集；根據(jù)一些myoD和myf5雙變異體中觀察的結(jié)果，推測(cè)myoD和myf5為成肌細(xì)胞的形成或存活所需。myf5和myoD的一些重疊作用經(jīng)常被視作為冗余（redundancy）的互補(bǔ)作用結(jié)果。這種冗余為發(fā)育程序提供了更強(qiáng)健的保證，并可使發(fā)育中機(jī)體不同分化區(qū)的細(xì)胞對(duì)源自細(xì)胞外的一些調(diào)節(jié)肌發(fā)生的信號(hào)能作出更具靈活性的反應(yīng)。早胚發(fā)育基因敲除的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與5-氮胞嘧啶核苷處理的C3H10T1/2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，即在融合前表達(dá)Myf5和MyoD，但只在融合后的合胞體中表達(dá)myogenin并由此形成肌管。MyoD和Myf5被視為具相似但重疊功能，能自發(fā)育中的體節(jié)內(nèi)篩選出一些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，為正常肌肉發(fā)生期間成肌決定所需。myogenin則為成肌細(xì)胞融合成為肌管所需。第四種MRF蛋白Mrf4是在發(fā)育的較晚階段才表達(dá)，可能起維持肌細(xì)胞的作用。早胚發(fā)育早胚發(fā)育在最近的一些研究中，對(duì)E2A和MEFs在肌發(fā)生中功能作了分析。E2A基因敲除小鼠的肌肉發(fā)育正常，而B-細(xì)胞的發(fā)育卻混亂。推測(cè)在肌肉發(fā)育期間，存在一些E2A的相關(guān)基因，它們能補(bǔ)償E2A的缺失，就像myoD和myf5能相互補(bǔ)償。為進(jìn)一步驗(yàn)證這種冗余（redundancy）的推測(cè)，研究者必須敲除這些E2A相關(guān)基因，以制備一些無E2A及其相關(guān)基因的小鼠供研究分析。早胚發(fā)育在小鼠中，四種生肌bHLH蛋白（MRFs）的表達(dá)引出一些使人迷惑的問題。這些蛋白是否具不同的固有生化特性并在肌肉發(fā)育中發(fā)揮不同作用？功能上不同的MRFs是否是獨(dú)立進(jìn)化而成的？這種多元MRFs的進(jìn)化是否較易滿足復(fù)雜有機(jī)體中基因表達(dá)的要求，即MRF始祖基因先是通過重復(fù)（duplication）、隨即分別形成不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（transcription-controlelements）的進(jìn)化方式，較在單一基因中整合入不同調(diào)控元件更為有效？因?yàn)椴簧僬{(diào)控發(fā)育中的小鼠基因均為多拷貝，如能了解MRFs在表觀上引起的重復(fù)，則有可能從另一側(cè)面揭示一些涉及發(fā)育的機(jī)制。早胚發(fā)育有一種略作改進(jìn)的基因敲除技術(shù)，稱作knock-in(敲入術(shù))。在該技術(shù)中，某一基因編碼序列（如myf5的）取代另一基因的編碼序列（如myogenin基因的）。將敲除和敲入技術(shù)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示：myogenin和myf5在體內(nèi)的功能并不相同。最近的生化研究結(jié)果表明Myf5(和MyoD)的染色質(zhì)重塑能力（chromatin-remodelingability）比myogenin的大，而這種重塑能力對(duì)絕大部分組織的正常發(fā)育甚為關(guān)鍵。早胚發(fā)育如前所述，敲除myogenin基因的純合子小鼠雖能產(chǎn)生聚集的成肌細(xì)胞，但無肌管形成不能存活。如將敲除myogenin基因小鼠的myf5基因座敲入1個(gè)拷貝的myogenin基因（使之受myf5調(diào)控元件調(diào)控），是否還能顯示出myogenin原有專一的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。結(jié)果，這種敲入?yún)s不能挽救已敲除myogenin基因的純合小鼠死亡命運(yùn)，表明一些myogenin基因調(diào)控序列的特有表達(dá)模式也是正常發(fā)育所需的。由這些研究結(jié)果推測(cè)：由基因重復(fù)而進(jìn)化演變出一些編碼功能不同的MRFs基因，是受不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件調(diào)節(jié)的。早胚發(fā)育在體內(nèi)，有關(guān)myogenin無法取代Myf5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：方法是將myogenin編碼序列插入取代myf5基因中涉及編碼Myf5的序列位置中，使之沿用野生型小鼠Myf5相同的時(shí)空表達(dá)方式。早胚發(fā)育業(yè)已知生肌細(xì)胞的終末分化（Terminaldifferentiation）是受正和負(fù)雙重調(diào)控的被決定而未分化的成肌細(xì)胞能對(duì)發(fā)育中一些控制細(xì)胞增殖和控制細(xì)胞遷移的細(xì)胞外信號(hào)作出反應(yīng)。相反，一些已分化的肌細(xì)胞或肌管不能對(duì)這些信號(hào)作出反應(yīng)。由決定到分化狀態(tài)的過渡調(diào)節(jié)作用，如同一些復(fù)雜的多細(xì)胞有機(jī)體中確保正常形態(tài)發(fā)生所需的細(xì)胞分化，在時(shí)、空上受嚴(yán)密控制。迄今，對(duì)不同發(fā)育中起調(diào)控該類過渡的一些因子了解甚微。然而，一些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果啟示有多種專一的因子起促進(jìn)或抑制肌發(fā)生期間的分化作用。早胚發(fā)育抑制性蛋白（Inhibitoryproteins）通過篩選一些與myoD有關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)有一種相關(guān)的蛋白，它保留一些構(gòu)成二聚體的螺旋結(jié)構(gòu)，但缺失與DNA結(jié)合的堿性區(qū)，不能與DNA中E-box序列結(jié)合，在它與MyoD和E2A作用后，抑制后二者形成MyoD-E2A異源二聚體，使它們喪失結(jié)合DNA的高親和力結(jié)合。該蛋白質(zhì)被稱作Id(InhibitorofDNAbinding)。在分析增殖中的氮化成肌細(xì)胞(Azamyoblasts)DNA時(shí)（氮化成肌細(xì)胞表達(dá)MyoD，E2A和Id），發(fā)現(xiàn)編碼肌酸激酶（Creatinekinase）的肌肉專一基因啟動(dòng)子中，其MyoD結(jié)合位點(diǎn)（或E2A結(jié)合位點(diǎn)）均未被占據(jù)。早胚發(fā)育這一發(fā)現(xiàn)可能表明無活性的MyoD-Id或E2A-Id形成，也表明Id具有在細(xì)胞增殖生長(zhǎng)期間維持細(xì)胞于決定狀態(tài)(Determinationstate)的作用。當(dāng)這些細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為肌細(xì)胞（例如撤除增殖生長(zhǎng)所需的含一些生長(zhǎng)因子的血清）時(shí)，Id的濃度就下降。結(jié)果導(dǎo)致MyoD-E2A二聚體形成，并結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)氮化成肌細(xì)胞分化為肌管。由此可見，轉(zhuǎn)錄因子與不同伴侶的二聚體化不僅能改變它們與一些專一DNA位點(diǎn)結(jié)合的專一性或親和力，也可能阻止它們與DNA的結(jié)合。早胚發(fā)育細(xì)胞周期蛋白（Cell-CycleProteins）由于不少類型細(xì)胞的分化都與其細(xì)胞周期的停滯有關(guān)。大部分細(xì)胞都停頓在G1相，推測(cè)一些與細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)的蛋白（如Cyclins和Cdks）可能影響著成肌細(xì)胞由決定向分化狀態(tài)的過渡。最近發(fā)現(xiàn)某些Cyclin-cdk蛋白激酶活性的抑制因子（CKIs）能誘導(dǎo)培養(yǎng)中的細(xì)胞分化為肌肉，在體內(nèi)明顯起上調(diào)分化的作用。早胚發(fā)育Cdk4-cyclinDCdk6-cyclinDG0ActivityofmammalianCdk-cyclincomplexesthroughthecourseofthecellcycleinG0cellsinducedtodividebytreatmentwithgrowthfactors.Thewidthofthecoloredbandsisapproximatelyproportionaltotheproteinkinaseactivityoftheindicatedcomplexes.CyclinDreferstoallthreeD-typecyclins早胚發(fā)育相反，體外培養(yǎng)中的成肌細(xì)胞，在有些條件下能正常分化，但轉(zhuǎn)染編碼CyclinD1DNA(具可供控制的活性啟動(dòng)子)之后，卻抑制了成肌細(xì)胞的分化。這種正常僅在G1相出現(xiàn)的CyclinD1的表達(dá)，在不少類型細(xì)胞中能被一些生肌因子上調(diào)。在體外，CyclinD1阻止成肌細(xì)胞分化的能力可能模擬了一些在體內(nèi)拮抗分化的信號(hào)某些方面特征。在G1相進(jìn)程中，一些負(fù)和正調(diào)控因子之間的拮抗作用似乎在體內(nèi)肌發(fā)生機(jī)制中起到主要作用。早胚發(fā)育總之，生肌程序是由交錯(cuò)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來維持的肌節(jié)不同區(qū)域中的前軀細(xì)胞（Precursorcells）形成不同的肌肉：背內(nèi)側(cè)的前軀細(xì)胞演變成軸上?。╡paxialmuscles），側(cè)向的前軀細(xì)胞演變成軸下?。╤ypaxialmuscles），而腹-側(cè)向的前軀細(xì)胞（在遷移之后）演變成肢體肌肉。每一群前軀細(xì)胞通過其周圍組織提供的不同信號(hào)誘導(dǎo)顯示出有區(qū)別的生肌基因活化途徑。一旦生肌程序在體節(jié)某一區(qū)域被活化，一大串相互交錯(cuò)的調(diào)控機(jī)制行使著維持活化的作用。早胚發(fā)育這些交錯(cuò)的調(diào)控機(jī)制發(fā)生在兩個(gè)水平上。首先，生肌因子（myogenicfactors）MRFs和MEFs通過與一些順式作用調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合，相互正調(diào)控各自的表達(dá)。其次，MRFs和MEFs相互作用，協(xié)調(diào)促進(jìn)一些驅(qū)動(dòng)分化的生肌基因表達(dá)。因此，雖然生肌程序是由體節(jié)周圍組織瞬間表達(dá)的細(xì)胞外信號(hào)誘導(dǎo)的，但一種細(xì)胞內(nèi)相互作用的網(wǎng)絡(luò)維持著無信號(hào)情況下的生肌程序。早胚發(fā)育這些交錯(cuò)的調(diào)控機(jī)制發(fā)生在兩個(gè)水平上：首先，生肌因子（myogenicfactors）MRFs和MEFs通過與一些順式作用調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合，相互正調(diào)控各自的表達(dá)。其次，MRFs和MEFs相互作用，協(xié)調(diào)促進(jìn)一些驅(qū)動(dòng)分化的生肌基因表達(dá)。因此，雖然生肌程序是由體節(jié)周圍組織瞬間表達(dá)的細(xì)胞外信號(hào)誘導(dǎo)的，但一種細(xì)胞內(nèi)相互作用的網(wǎng)絡(luò)維持著無信號(hào)情況下的生肌程序。早胚發(fā)育生肌程序的維持：Figure:Maintenanceofthemyogenicprogram.Transientsignalsfromthedevelopingspinalcordandectoderminduceasubsetofcellsinthedevelopingsomitetobecomemyoblasts.InductionismarkedbytheexpressionofMRFsandother’sexpressionandalsodirectlyinteracttocontroltranscriptionofothermyogenicgenes.Thisnetworkofinteractionsmaintainsthemyogenicprogramafterthetransientinductivesignalsdisappear.Variousfactorscontrolthefinaldecisiontobecomepostmioticandtodifferentiateintomuscle.早胚發(fā)育發(fā)育轉(zhuǎn)錄程序與細(xì)胞間信號(hào)通訊的關(guān)系（TGFβ超家族蛋白決定背腹圖式的機(jī)制為例）早胚發(fā)育一些在調(diào)控?zé)o脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物發(fā)育過程中起廣泛作用的相關(guān)細(xì)胞外信號(hào)組成了β-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族（TransforminggrowthfactorsβSuperfamily,TGFβs）。TGFβ超家族首批成員的鑒定是建立在體外它們具有誘導(dǎo)培養(yǎng)物中某些細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上。業(yè)已知這些分泌型的生長(zhǎng)因子對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育具一些明顯的廣譜效應(yīng)。早胚發(fā)育有些TGFβ超家族成員對(duì)某些組織具抑制增殖的作用，而對(duì)另一些組織則具促增殖作用。這些生長(zhǎng)因子也具促進(jìn)一些細(xì)胞粘連分子、其它的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)分子的生成。我們先介紹TGFβ蛋白的通用結(jié)構(gòu)，一些能與之結(jié)合的受體，然后述及TGFβ與受體結(jié)合后引起活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路。最后，討論有關(guān)這些分子在背腹圖式形成中的作用（以Xenopuslaevis為例），借此揭示發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序與細(xì)胞間信號(hào)通訊的關(guān)系。早胚發(fā)育TGFβ超家族成員源自無活性分泌型前軀蛋白，經(jīng)蛋白酶酶解加工而成其前軀蛋白（precursor）含一個(gè)N終末端信號(hào)肽；一個(gè)處在中央的含50-375氨基酸的原結(jié)構(gòu)域(Pro-domain）；以及一個(gè)C末端的成熟結(jié)構(gòu)域（構(gòu)成活性生長(zhǎng)因子）。生長(zhǎng)因子單體(monomer)具110-140個(gè)氨基酸，由4個(gè)反平行的β鏈和3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵構(gòu)成的所謂胱氨酸結(jié)（Cystineknot）等組成。該胱氨酸結(jié)具相對(duì)強(qiáng)的抗變性作用，可能適合于細(xì)胞外分子早胚發(fā)育precursormonomerMatureform(homo-orheterodimer)Figure.TGF-β-superfamilyproteinsfunctionasinducersduringvertebrateandinvertebrateSchematicdiagramofformationofmaturedimericTGFβproteinsfromsecretedmonomericTGFβprecursors.Thematuredomaincontainssixcysteineresidues(yellowdots),whichformthreeintrachaindisulfidebonds.AnotherN-terminalcysteineinthematuredomainformsaninterchaindisulfidebondthatlinksmonomersintotheactivehomo-orheterodimericproteins.早胚發(fā)育不同TGFβ蛋白間序列差異的大部分位于N-終末端區(qū)、連結(jié)β鏈的環(huán)和α-螺旋中。每個(gè)單體近N-末端的一個(gè)半胱氨酸，將TGFβ單體連結(jié)成功能化的同源二聚體和異源二聚體。借助于單體和其結(jié)構(gòu)上的差異，能增加不同單體組合的異源二聚體功能的多樣性。早胚發(fā)育通過放射性碘標(biāo)記TGFβ分子結(jié)合細(xì)胞表面的實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)存在分子量分別為55，85和280kD等三種不同TGFβ受體，分別稱作I型、II型和III型TGFβ受體。I型和II型TGFβ受體均為跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶。TGFβ的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致多聚受體形成。該多聚受體為異源四聚體，由I型和II型受體組成。四聚體中的II型亞基將I型亞基毗鄰膜區(qū)的高度保守序列中絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，由此激活其激酶活性。III型TGFβ為分布在細(xì)胞表面的蛋白聚糖（proteoglycan），稱之為β-glycan。它似乎起著調(diào)節(jié)TGFβ與I型、II型受體異源四聚體之間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的易接近性。早胚發(fā)育活化的TGFβ受體將一些Smad轉(zhuǎn)錄因子磷酸化通過遺傳學(xué)研究，揭示出TGFβ家族受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的一些轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)基因，這些轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)稱為Smads。有三種Smad蛋白：受體調(diào)節(jié)的Smads(R-Smads)，具協(xié)調(diào)性能或合作性能的Smads(co-Smads)，以及具抑制性能的Smads(I-Smads)。Smad是線蟲和果蠅Mad基因的同源基因MADS是MCM1,AGAMOUS,DEFICIENS

和SRF(Serumresponsefactor)的字首組成的縮寫，它們均屬M(fèi)ADS家族。早胚發(fā)育首先，配體TGFβ與I和II受體（均為絲氨酸/蘇氨酸激酶）結(jié)合，誘導(dǎo)形成多聚體形式的受體；II型受體將I型受體磷酸化使后者活化；接著近R-SmadsC-末端的一些殘基被活化的I型TGFβ受體磷酸化；磷酸化的R-Smads與co-Smads形成二聚體；該異源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其它的轉(zhuǎn)錄因子一起激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。R-Smads有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（*MH1和MH2），它們由一柔性較強(qiáng)的連接區(qū)隔開。在無活性的狀態(tài)下，N末端的MH1結(jié)構(gòu)域阻遏C-末端MH2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；在有活性的磷酸化狀態(tài)下，MH1結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合，而MH2結(jié)構(gòu)域調(diào)整R-Smads與co-Smads的相互作用，促進(jìn)R-Smads與相關(guān)DNA結(jié)合蛋白相互作用，由此激發(fā)靶基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。*MH為Mad-Homology的縮寫TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：早胚發(fā)育TGFsignalingpathway.BindingofligandtothetypeIandtypeIIreceptors,whichareserine/threoninekinases,inducesformationofmultimericreceptors.TypeIIreceptorsphosphorylatetypeIreceptorsinthejuxtamembraneregion.Phosphorylatereceptor-regulatedSmads(R-Smads),whichthendimerizewithCo-Smadinthecytosol.TheR-Smad/Co-Smadcomplextranslocatestothenucleuswhereitbindstoregulatorysequencesincombinationwithspecifictranscriptionfactors,leadingtotranscriptionofspecifictargetgenes.早胚發(fā)育不同的TGFβ超家族生長(zhǎng)因子與它們的特異受體結(jié)合，產(chǎn)生不同的細(xì)胞反應(yīng)。通過這些相關(guān)受體產(chǎn)生的專一性反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)放的共有現(xiàn)象。TGFβ信號(hào)發(fā)放途徑是達(dá)到這種反應(yīng)專一性的戰(zhàn)略極佳例證：例如，TGFβ結(jié)合其受體，導(dǎo)致Smad2的磷酸化，并與Smad4二聚體化，隨即移位至細(xì)胞核內(nèi)，激活專一的靶基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。另一TGFβ家族成員BMP2與受體結(jié)合后導(dǎo)致Smad1磷酸化，與Smad4二聚體化，——分別活化專一的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。早胚發(fā)育一些有序誘導(dǎo)事件調(diào)控著爪蟾的早期發(fā)育未受精的爪蟾卵具固有的不對(duì)稱性，動(dòng)物極多色素，植物極富卵黃。精子穿入動(dòng)物極，導(dǎo)致富含肌動(dòng)蛋白的皮質(zhì)區(qū)旋轉(zhuǎn)約30?。皮質(zhì)的旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生第2個(gè)不對(duì)稱性，即導(dǎo)致將來背腹軸的產(chǎn)生；精子入口處為胚胎的腹側(cè)。如果皮質(zhì)旋轉(zhuǎn)遭抑制（例如通過紫外線輻射的辦法），背腹極性的建立就遭阻斷。從受精開始，早期胚胎按常規(guī)模式進(jìn)行快速、同步的細(xì)胞分裂。當(dāng)胚胎動(dòng)物極出現(xiàn)囊胚腔，該胚胎就取名為囊胚。早胚發(fā)育早胚發(fā)育經(jīng)歷12次細(xì)胞分裂后，合子基因組轉(zhuǎn)錄活動(dòng)開始，屆時(shí)的細(xì)胞分裂速度減慢并變得不同步。約在中囊胚期，三胚層細(xì)胞沿著動(dòng)物極/植物極軸按單層模式排列。動(dòng)物極將成為外胚層（ectoderm），如皮膚和神經(jīng)組織；植物極成為內(nèi)胚層（endoderm），如腸；兩極間的邊緣帶（marginalzone）成為中胚層（將形成脊索、肌肉、血液等等）。在原腸胚形成期間，中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞向胚胎內(nèi)部遷移；進(jìn)入胚胎內(nèi)部的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)始于胚孔背唇。原腸胚形成時(shí)，其整個(gè)外表覆蓋著外胚層。內(nèi)胚層在胚胎中央，中胚層將內(nèi)胚層與外胚層分隔開。早胚發(fā)育沿著背腹軸的誘導(dǎo)中胚層形成模式有賴于源自三方面的信號(hào)。在囊胚期間，源自腹側(cè)植物