(高清版)GBT 39914-2021 主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè) 玉米

ICS65.020.20主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè)玉米國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T39914—2021 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ) 13.1術(shù)語(yǔ)和定義 1 2 2 25.1總則 2 35.3檢測(cè)平臺(tái) 35.4樣品 35.5檢測(cè)條件 46儀器設(shè)備、試劑和溶液配制 46.1儀器設(shè)備 46.2試劑 56.3溶液配制 5 57.1引物合成 57.2DNA提取 8 8 97.5數(shù)據(jù)分析 8品種純度檢測(cè)程序 8.1DNA提取 8.2引物篩選和合成 8.4擴(kuò)增產(chǎn)物分離 8.5數(shù)據(jù)分析 9結(jié)果計(jì)算與表示 9.1真實(shí)性鑒定 9.2純度測(cè)定 GB/T39914—202110.1真實(shí)性鑒定 附錄A(規(guī)范性附錄)溶液配制 附錄B(資料性附錄)等位基因擴(kuò)增片段信息 表1真實(shí)性鑒定引物 5表2PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 8表3純度測(cè)定候選引物 表B.1已知品種主要等位基因擴(kuò)增片段信息 ⅡⅢGB/T39914—2021本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)農(nóng)作物種子標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC37)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心、北京市種子管GB/T39914—2021主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè)玉米1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了玉米(ZeamaysL.)品種真實(shí)性和品種純度SSR分子標(biāo)記的檢測(cè)原則、檢測(cè)方案、檢測(cè)程序和結(jié)果報(bào)告。本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米品種真實(shí)性驗(yàn)證和真實(shí)性身份鑒定，不適用于實(shí)質(zhì)性衍生品種(EDV)和轉(zhuǎn)基因品種的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T3543.1農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1品種真實(shí)性驗(yàn)證varietyverification與其對(duì)應(yīng)品種名稱(chēng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，檢測(cè)證實(shí)供檢樣品品種名稱(chēng)標(biāo)注是否名副其實(shí)。3.1.2經(jīng)SSR分子標(biāo)記檢測(cè)并通過(guò)審定品種SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)(3.1.4)篩查比較，確定供檢樣品的真實(shí)品種名稱(chēng)。3.1.3標(biāo)準(zhǔn)樣品standardsample國(guó)家指定機(jī)構(gòu)保存的經(jīng)認(rèn)定代表審定品種特征特性的實(shí)物種子樣品。3.1.4SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)SSRfingerprintblastplatform采用SSR分子標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化方法對(duì)品種標(biāo)準(zhǔn)樣品等位基因進(jìn)行檢測(cè)，并運(yùn)用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)所構(gòu)建的審定品種分子數(shù)據(jù)信息的檢索比對(duì)載體。3.1.5參照樣品referencecontrolsample用于校準(zhǔn)檢測(cè)樣品SSR等位基因已定義擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小的樣品。12GB/T39914—20213.1.6一條互補(bǔ)結(jié)合在模板DNA鏈上的短單鏈，能提供3′-OH末端作為DNA合成的起始點(diǎn)，延伸合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。3.1.7能夠組合在一起電泳的，具有不同顏色或相同顏色而擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小不同的熒光標(biāo)記的一組3.1.8等位基因allele在一對(duì)同源染色體上同一基因座上的一對(duì)基因。注1:對(duì)于SSR檢測(cè)，等位基因差異以擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小來(lái)表示。注2:對(duì)于熒光標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小是指一個(gè)已定義片段大小的區(qū)間范圍，本標(biāo)準(zhǔn)將之稱(chēng)為Bin。3.2縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。bp:basepair,堿基對(duì)。CTAB:cetyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨。DNA:deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸。dNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphates,脫氧核苷三磷酸。PAGE:polyacrylamidegelelectrophoresis,聚丙烯酰胺凝膠電泳。PCR:polymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。SDS:sodiumdodecylsulfate,十二烷基苯磺酸鈉。SSR:simplesequencerepeat,簡(jiǎn)單序列重復(fù)。4總則玉米的不同品種，其基因組存在著能夠世代穩(wěn)定遺傳的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)的重復(fù)次數(shù)差異。這種差異可以通過(guò)從抽取有代表性的檢測(cè)樣品中提取DNA,用SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增和電泳，從而通過(guò)其擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小不同而加以區(qū)分品種。依據(jù)SSR檢測(cè)原理，采用固定數(shù)目的SSR引物，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較或與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)的方式，對(duì)品種真實(shí)性進(jìn)行驗(yàn)證或身份鑒定。真實(shí)性驗(yàn)證依據(jù)規(guī)定數(shù)目引物的SSR分子標(biāo)記差異數(shù)目而判定，品種真實(shí)性身份鑒定依據(jù)SSR分子標(biāo)記數(shù)目沒(méi)有差異的原則進(jìn)行篩查、鑒定而確定。采用篩選能夠準(zhǔn)確識(shí)別品種異常個(gè)體指紋數(shù)據(jù)或圖譜的適宜引物，通過(guò)對(duì)一定數(shù)量檢測(cè)樣品的異常個(gè)體數(shù)目或百分率的品種純度估測(cè)，從而對(duì)其整體的典型一致程度作出評(píng)價(jià)。5檢測(cè)方案3GB/T39914—2021在嚴(yán)格控制條件下，合成選擇的引物，按照確定的檢測(cè)平臺(tái)對(duì)檢測(cè)樣品按按規(guī)定要求填報(bào)檢測(cè)結(jié)果，檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)注明檢測(cè)方案所選擇的影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵信息。5.2引物5.2.1.1檢測(cè)引物數(shù)目越多，結(jié)果漏檢和誤判的概率降低，工作量也隨之增加，這需要依據(jù)檢測(cè)目的在可接受結(jié)果準(zhǔn)確率的前提下進(jìn)行兼顧。經(jīng)對(duì)我國(guó)審定通過(guò)玉米品種進(jìn)行全面試驗(yàn)后，依據(jù)高分辨率、染色體均勻分布等篩選原則，本標(biāo)準(zhǔn)遴選了40對(duì)作為品種真實(shí)性鑒定的檢測(cè)引物，具體見(jiàn)表1,并據(jù)此構(gòu)建了已知品種的SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)。表1引物可分為I、Ⅱ兩組，編號(hào)PM01～PM20為I組，編號(hào)PM21～PM40為Ⅱ組，每組包含20對(duì)。5.2.1.2品種真實(shí)性驗(yàn)證強(qiáng)調(diào)的是對(duì)結(jié)果的否定，相對(duì)而言對(duì)引物數(shù)量要求不高，檢測(cè)允許采用序貫方式。先采用I組引物進(jìn)行檢測(cè)，若未檢測(cè)到或檢測(cè)到可以判定不符結(jié)果的差異位點(diǎn)數(shù)的，可終止檢測(cè)。對(duì)于采用I組引物進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)到而未達(dá)到可以判定不符結(jié)果的差異位點(diǎn)數(shù)的，則繼續(xù)完成Ⅱ組引物的檢測(cè)。5.2.1.3品種真實(shí)性身份鑒定強(qiáng)調(diào)的是對(duì)結(jié)果的肯定，在已具備已知審定品種的SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)的前提下，通過(guò)已知檢測(cè)信息能夠篩查確定至具體品種。為盡量降低誤判，檢測(cè)時(shí)會(huì)對(duì)引物數(shù)量要求較高，可采用序貫方式，也可直接采用表1的40對(duì)SSR引物進(jìn)行檢測(cè)，直至與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比較后能夠確定為止。經(jīng)比較后仍與已知品種存在沒(méi)有位點(diǎn)差異而無(wú)法得出結(jié)論的，允許采用其他能夠區(qū)分的SSR分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。5.2.2.1純度測(cè)定要明確所檢測(cè)的異常個(gè)體類(lèi)型，異常個(gè)體的類(lèi)型不同，所選引物和數(shù)目也有所不同，有時(shí)還需借助相應(yīng)父母本的DNA指紋數(shù)據(jù)。雜交種異常個(gè)體主要類(lèi)型為自交、異交、混雜；自交系異5.2.2.2品種純度測(cè)定所選的引物，應(yīng)通過(guò)檢測(cè)樣品預(yù)試驗(yàn)，篩選出能夠準(zhǔn)確識(shí)別該樣品品種的異常個(gè)體。篩選時(shí)還需綜合考慮引物的雜合度、DNA快速提取和多重組合電泳的潛力。篩選結(jié)果表明，樣品在個(gè)別位點(diǎn)存在遺傳不穩(wěn)定狀況的可將其剔除，檢測(cè)樣品存在嚴(yán)重遺傳不穩(wěn)定狀況的可終止純度測(cè)定。5.3檢測(cè)平臺(tái)5.3.1電泳是檢測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)于真實(shí)性鑒定，可選擇采用變性PAGE電泳、毛細(xì)管電泳，但應(yīng)注意變性PAGE電泳檢測(cè)數(shù)據(jù)與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)困難，難以進(jìn)行真實(shí)性身份鑒定；對(duì)于純度測(cè)定，可以采用PAGE電泳、毛細(xì)管電泳，在選擇等位基因擴(kuò)增片段差異較大的引物前提下也可采用瓊脂5.3.2對(duì)于樣品量較大的，可將樣品粉碎組合的毛細(xì)管電泳進(jìn)行組合，以提高檢測(cè)的綜合效率。5.3.3DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳的技術(shù)條件要求，在適于檢測(cè)目的和不影響檢測(cè)質(zhì)量的前提下，按照檢測(cè)平臺(tái)的要求允許對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定做適宜的局部改進(jìn)。5.4.1.1送驗(yàn)樣品為種子，質(zhì)量應(yīng)不低于200g或不少于500粒。在種子生產(chǎn)基地取樣，送驗(yàn)樣品可為4GB/T39914—2021果穗，數(shù)量應(yīng)不低于5個(gè)(總粒數(shù)不少于500粒)?；虬~的數(shù)量至少含有20個(gè)個(gè)體，采用混合樣品檢測(cè)的先單獨(dú)提取DNA,再取等量DNA混合。5.4.1.2從送驗(yàn)樣品中分取有代表性的試樣，采用混合樣或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)?；旌蠘釉嚇觼?lái)源應(yīng)至少含有20個(gè)個(gè)體，單個(gè)個(gè)體試樣應(yīng)至少含有5個(gè)個(gè)體。5.4.2.1送驗(yàn)樣品為種子，對(duì)于雜交種質(zhì)量應(yīng)不低于200g或不少于500粒；對(duì)于自交系質(zhì)量應(yīng)不低于400g或不少于1000粒。與真實(shí)性鑒定同時(shí)開(kāi)展檢測(cè)的，可以為同一送檢樣品。5.4.2.2從送驗(yàn)樣品中分取規(guī)定數(shù)量的試樣，試樣采用單個(gè)個(gè)體進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)。送驗(yàn)樣品或試樣的抽對(duì)照)×2粒種子；對(duì)于自交系，應(yīng)至少含有96(適用時(shí)可含對(duì)照)×4粒種子?！N子檢驗(yàn)員具備熟悉所使用檢測(cè)技術(shù)的知識(shí)和技能；——使用適當(dāng)?shù)燃?jí)的試劑和滅菌處理的耗材；——使用校準(zhǔn)影響檢測(cè)結(jié)果評(píng)定的適宜參照樣品。6.1.1DNA提取5GB/T39914—20216.2試劑6.2.1DNA提取6.2.2PCR擴(kuò)增去離子甲酰胺(Formamide)、溴酚藍(lán)(BrphBlue)、二甲苯青FF、甲叉雙丙烯酰胺(Bisacrylamide)、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、無(wú)水乙醇、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸銨(APS)、冰醋酸、乙酸銨、硝酸銀、甲6.3溶液配制DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳、銀染的溶液試劑配制所用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水的要求，其中銀染溶液配制可以使用符合三級(jí)要求的水。7真實(shí)性檢測(cè)程序7.1引物合成根據(jù)真實(shí)性驗(yàn)證或身份鑒定的要求，選定表1的引物。選用變性PAGE電泳，只需合成普通引物，采用單引物電泳。選用熒光毛細(xì)管電泳，需在正向引物的5'端標(biāo)記熒光染料合成引物，采用單引物或組合引物電泳。表1標(biāo)記熒光欄所列的僅作為示例，只適用于某一檢測(cè)平臺(tái)使用。表1真實(shí)性鑒定引物編號(hào)引物名稱(chēng)染色體位置引物序列(5′—3')標(biāo)記熒光PM01bnlg439wl正向：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC反向：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTCNEDPM02umcl335y5正向：CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG反向：GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATGPET6GB/T39914—2021表1(續(xù))編號(hào)引物名稱(chēng)染色體位置引物序列(5′—3')標(biāo)記熒光PM03umc2007y42.04正向：TTACACAACGCAACACGAGGC反向：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACACFAMPM04bnlg1940k72.08正向：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC反向：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCCPETPM05umc2105k3反向：ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCGPETPM06phi053k2正向：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG反向：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGCNEDPM07phi072k44.01正向：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGG反向：CGTTGCCCATACATCATGCCTCVICPM08bnlg2291k44.06正向：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG反向：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCVICPM09umc1705wl正向：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG反向：CACGTACGGCAATGCAGACAAGVICPM10bnlg2305k4正向：CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG反向：CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTGNEDPM11bnlg161k86.00正向：TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG反向：GATGGATGGAGCATGAGCTTGCVICPM12bnlg1702kl6.05正向：GATCCGCATTGTCAAATGACCAC反向：AGGACACGCCATCGTCATCAVICPM13umc1545y2正向：AATGCCGTTATCATGCGATGC反向：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGTNEDPM14umc1125y3正向：GGATGATGGCGAGGATGATGTC反向：CCACCAACCCATACCCATACCAGVICPM15bnlg240k18.06正向：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTCPETPM16phi080k158.08正向：TGAACCACCCGATGCAACTTG反向：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTCPETPM17phi065k99.03正向：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC反向：GGACCCAGACCAGGTTCCACCNEDPM18umc1492y139.04反向：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGPETPM19umc1432y6正向：GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATCPETPM20umc1506k12反向：TTCAGTCGAGCGCCCAACACFAMPM21umcl147v4正向：AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC反向：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGCNED7GB/T39914—2021表1(續(xù))編號(hào)引物名稱(chēng)染色體位置引物序列(5'—3)標(biāo)記熒光PM22bnlg1671y17正向：CCCGACACCTGAGTTGACCTGFAMPM23phi96100yl2.00正向：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG反向：CCATCTGCTGATCCGAATACCCFAMPM24umc1536k92.07正向：TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCGNEDPM25bnlg1520kl2.09正向：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC反向：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTGFAMPM26umc1489y3正向：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC反向：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGTNEDPM27bnlg490y44.04正向：GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG反向：TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTANEDPM28umc1999y34.09正向：GGCCACGTTATTGCTCATTTGC反向：GCAACAACAAATGGGATCTCCGFAMPM29umc2115k3正向：GCACTGGCAACTGTACCCATCG反向：GGGTTTCACCAACGGGGATAGGVICPM30umcl429y7正向：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC反向：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTGVICPM31bnlg249k26.01正向：GGCAACGGCAATAATCCACAAG反向：CATCGGCGTTGATTTCGTCAGVICPM32phi299852y26.07正向：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG反向：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGTVICPM33umc2160k3正向：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG反向：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATTVICPM34umc1936k4正向：GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG反向：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTCPETPM35bnlg2235y58.02正向：CGCACGGCACGATAGAGGTG反向：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCTVICPM36phi233376yl8.09正向：CCGGCAGTCGATTACTCCACG反向：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTCPETPM37umc2084w29.01反向：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGCNEDPM38umc1231k49.05正向：ACAGAGGAACGACGGGACCAAT反向：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTCFAMPM39phi041y6正向：CAGCGCCGCAAACTTGGTT反向：TGGACGCGAACCAGAAACAGACPETPM40umc2163w3正向：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC反向：CTTCGTACCATCTTCCCTACTTCATTGCNED8GB/T39914—2021DNA提取方法應(yīng)保證提取的DNA質(zhì)量符合PCR擴(kuò)增的要求，DNA無(wú)降解，溶液的紫外光吸光度OD?60與OD2s0的比值宜介于1.8～2.0之DNA提取可任選7.2.2至7.2.5所列的一種方法。其中：CTAB和試劑盒法提取量大，質(zhì)量好，可7.2.2CTAB法取試樣的幼苗或葉片200mg～300mg置于2.0mL離心管，加液氮充分研磨，或取種子充分磨碎后移入2.0mL離心管。每管加入700μL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴60min。期間不時(shí)多次輕緩顛倒混勻。每管加入等體積的三氯甲烷/異戊醇(24:1)混合液，充分混合后靜置10min,在12000r/min離心15min至分相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min后在4℃、12000r/min離心10min。棄上清液，加入70%乙醇，旋轉(zhuǎn)數(shù)次后棄去乙醇溶液，并倒立于墊有濾紙的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，室溫放置10min以上。加入100μL超純水或TE緩沖液1,充分溶解后供備用。7.2.3試劑盒法選用適宜SSR分子標(biāo)記法的商業(yè)試劑盒，并經(jīng)驗(yàn)證合格后使用。DNA提取方法，按照提供的使用取試樣的幼苗或葉片，或切取干種子的胚，置于1.5mL離心管，加入100μL氯仿后研磨，再加入和300μL5mol/L氯化鈉溶液的1.5mL離心管中。待成團(tuán)后，挑出DNA,經(jīng)70%乙醇洗滌后，加入200μLTE緩沖液1,充分溶解后供備用。切取試樣干種子的胚，或?qū)⒎N子發(fā)芽至幼苗長(zhǎng)度達(dá)到3cm左右時(shí)剪取1.5cm長(zhǎng)的幼苗，放入96孔深孔板中。每孔加入150μL氫氧化鈉提取液，沸水加熱5min,然后加入150μLTE緩沖液2,充分溶解后供備用。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積和組分的終濃度參照表2進(jìn)行配量，可以依據(jù)試驗(yàn)條件不同做相應(yīng)調(diào)整。表2中的緩沖液若含有MgCl?,不再加MgCl?溶液，加等體積無(wú)菌水替代。表2PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)組分原濃度終濃度體積/μLddH?O——10×緩沖液29GB/T39914—2021表2(續(xù))反應(yīng)組分原濃度終濃度體積/μLMgCl?25mmol/L2.5mmol/L22.5mmol/La0.15mmol/LTaq酶0.05U/μL引物DNA2每一種類(lèi)的濃度。反應(yīng)程序的反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)PCR擴(kuò)增儀型號(hào)、酶、引物等不同而做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。通常采用下列反b)擴(kuò)增：94℃變性40s,60℃退火35s,72℃延伸45s,進(jìn)行35次循環(huán)；形成的擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。7.4.1.1對(duì)于玉米，SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增片段大小范圍較廣，可以依據(jù)不同儀器選擇采用不多于10重的組合引物進(jìn)行電泳。按照預(yù)先確定的組合引物，分別取等體積的同一組合引物的不同熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)7.3.2),充分混勻。從混合液中吸取1μL,加入DNA分析儀專(zhuān)用96孔板孔中。各孔再分別加10min以上。瞬時(shí)離心10s后供備用。7.4.1.2打開(kāi)DNA分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)和試劑狀態(tài)。7.4.1.3將裝有樣品的微孔板放置于樣品架基座上，打開(kāi)數(shù)據(jù)收集軟件，按照DNA分析儀使用手冊(cè)進(jìn)沾洗滌靈用清水將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，再用雙蒸水、95%乙醇分別擦洗兩遍。玻璃板干燥后，將取20μL擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)7.3.2),加入4μL6×加樣緩沖液，混勻。在PCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行95℃變性GB/T39914—20215min,4℃冷卻10min后供備用。7.4.2.3.1在電泳正極槽(下槽)加入1×TBE緩沖液600mL,負(fù)極槽(上槽)加入經(jīng)65℃預(yù)熱的1×TBE緩沖液600mL,拔出樣品梳，在90W恒功率下預(yù)電泳10mi槽孔氣泡和雜質(zhì)，插入樣品梳(鯊魚(yú)齒朝下)。每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5μL樣品(見(jiàn)7.4.2.2),在80W恒功率下進(jìn)行電泳。7.4.2.3.2電泳的適宜時(shí)間，參考二甲苯青指示帶移動(dòng)的位置和擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段大小范圍(參見(jiàn)表B.1)加以確定。二甲苯青指示帶在4.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所移動(dòng)的位置與150bp擴(kuò)增產(chǎn)物泳動(dòng)的位置大致相當(dāng)。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在(150±50)bp、(250±50)bp、(350±50)bp范圍的，指將附著凝膠的玻璃板浸入固定液中，輕輕晃動(dòng)3min后取出，在雙蒸水中快速漂洗，時(shí)間不超過(guò)入顯影液中，輕輕晃動(dòng)待條帶清晰后取出，再迅速放入固定液中定影5min取出，在雙蒸水中漂洗引物等位基因片段大小范圍內(nèi)(參見(jiàn)表B.1),對(duì)于毛細(xì)管電泳，特異峰呈現(xiàn)為穩(wěn)定的尖銳峰型，純合位位點(diǎn)顯示為雙條。a)對(duì)于連帶(pull-up)峰，即因某一位置某一顏色熒光的峰值較高而引起同一位置其他顏色熒光7.5.1.3對(duì)于PAGE電泳，位于其相應(yīng)的等位基因擴(kuò)增片段大小范圍之外的譜帶需要甄別是非特異性擴(kuò)增帶還是新增的稀有等位基因譜帶。采用單個(gè)個(gè)體提取的，出現(xiàn)雙帶以上的多帶則可能為非特異性7.5.1.4采用混合樣檢測(cè)，無(wú)論是毛細(xì)管電泳還是PAGE電泳，結(jié)果表明在引物位點(diǎn)出現(xiàn)異質(zhì)性而無(wú)法識(shí)別特異譜帶或特異峰的，應(yīng)采用單個(gè)個(gè)體獨(dú)立檢測(cè)，試樣至少含有20個(gè)個(gè)體的數(shù)量。若樣品在一GB/T39914—2021制參數(shù)等進(jìn)行分析；選擇少量的對(duì)照),校準(zhǔn)不同電泳板間的數(shù)據(jù)偏差后再讀取擴(kuò)增片段大小。甄別后的特異峰落入Bin范7.5.2.2變性PAGE電泳對(duì)甄別后的特異譜帶(見(jiàn)7.5.1)進(jìn)行讀取。擴(kuò)增片段大小的讀取，統(tǒng)一采用兩段式數(shù)據(jù)記錄方式。純合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/X,雜合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/Y(其中X、Y分別為該位點(diǎn)兩個(gè)等位基因擴(kuò)增片7.5.3.2采用毛細(xì)管電泳與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)的，按照數(shù)據(jù)導(dǎo)入模板的要求，將數(shù)據(jù)及其指7.5.3.3采用PAGE電泳與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)的，按照數(shù)據(jù)導(dǎo)入模板的要求，將數(shù)據(jù)上傳到注：采用PAGE電泳與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)較為困難，建議作為參考使用，比對(duì)前采取以下措施：a)讀取擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小數(shù)據(jù)的，檢測(cè)樣品與參照樣品(附錄B)同時(shí)在同一電泳板上電泳；c)檢測(cè)樣品存在擴(kuò)增片段差異較小的，按片段大小順序重新電泳進(jìn)行復(fù)核確定后讀取。數(shù)據(jù)比對(duì)后，按照位點(diǎn)存在差異或完全相同、數(shù)據(jù)缺失、無(wú)法判定等情形，記錄每個(gè)引物的位點(diǎn)狀況。8品種純度檢測(cè)程序8.1DNA提取DNA提取可任選7.2所列方法，優(yōu)先推薦7.2.5堿煮法。GB/T39914—2021——對(duì)于鑒定自交個(gè)體，識(shí)別特征為該等位基因具有母本而父本缺失，篩選1對(duì)能檢測(cè)雜合位點(diǎn)(通常表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)帶)的引物；——對(duì)于鑒定異交個(gè)體，識(shí)別特征為該等位基因具有母本而父本錯(cuò)誤，在具備父母本對(duì)照或其SSR指紋數(shù)據(jù)的條件下，篩選2對(duì)以上的引物；——對(duì)于鑒定混雜個(gè)體，識(shí)別特征為該等位基因具有父本而母本錯(cuò)誤或不具有父母本，在具備父母本對(duì)照或其SSR指紋數(shù)據(jù)的條件下，篩選2對(duì)以上的引物；-—對(duì)于同時(shí)鑒定自交、異交、混雜個(gè)體或者其中兩者的，應(yīng)綜合考慮篩選3對(duì)以上的引物。對(duì)于自交系品種純度測(cè)定，鑒定異交個(gè)體、混雜個(gè)體的，各需篩選2對(duì)以上的引物。8.2.2本標(biāo)準(zhǔn)推薦了8對(duì)品種純度測(cè)定引物(見(jiàn)表3),作為優(yōu)先篩選的候選引物。篩選時(shí)，可用至少含20粒的小樣品進(jìn)行試驗(yàn)，依據(jù)5.2.2的要求，確定適宜的引物或引物組合。推薦8對(duì)引物仍未達(dá)到篩選效果的，可選擇表1另外32對(duì)引物或其他引物進(jìn)行篩選。表3純度測(cè)定候選引物編號(hào)引物名稱(chēng)染色體位置引物序列(5′—3′)標(biāo)記熒光擴(kuò)增片段范圍/bp雜合度PM01bnlg439wl正向：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC反向：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTCNED0.83PM23phi96100yl2.00正向：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG反向：CCATCTGCTGATCCGAATACCCFAM0.62PM08bnlg2291k44.06正向：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG反向：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCVIC0.81PM13umc1545y2正向：AATGCCGTTATCATGCGATGC反向：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGTNED0.82PM15bnlg240k18.06正向：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC反向：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATACPET0.83PM17phi065k99.03正向：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC反向：GGACCCAGACCAGGTTCCACCNED0.78PM20umc1506k12正向：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG反向：TTCAGTCGAGCGCCCAACACFAM0.74PM31bnlg249k26.01正向：GGCAACGGCAATAATCCACAAG反向：CATCGGCGTTGATTTCGTCAGVIC0.63注：本表標(biāo)記熒光欄所列的僅作為示例，只適用于某一檢測(cè)平臺(tái)的使用，8個(gè)引物可以進(jìn)行8重組合電泳。8.2.3選定引物后，按照電泳方法的不同，依據(jù)7.1要求合成引物。8.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序執(zhí)行7.3的要求，形成擴(kuò)增產(chǎn)物。按瓊脂糖濃度為2.0%比例的要求，稱(chēng)取一定量瓊脂糖，加入1×TAE電泳緩沖液，混合煮沸溶解。GB/T39914—2021溶液冷卻至60℃,加入核酸染色劑混勻，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳。待凝膠完全凝固后，從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，置入盛有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液液面高出凝膠表面約1mm。高電壓不超過(guò)5V/cm(100V~150V恒壓電泳)下進(jìn)行電泳，使擴(kuò)增產(chǎn)物從負(fù)極向正極移動(dòng)。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移的位置表明DNA擴(kuò)增片段已足夠分離時(shí)，才可結(jié)束電泳。熒光毛細(xì)管電泳執(zhí)行7.4.1的要求。8.5數(shù)據(jù)分析通過(guò)電泳后呈現(xiàn)的特異譜帶(見(jiàn)8.4.1.3)或特異峰(見(jiàn)8.4.2),依據(jù)8.2.1的規(guī)定，準(zhǔn)確識(shí)別該品種正9結(jié)果計(jì)算與表示9.1真實(shí)性鑒定統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)差異記錄的結(jié)果，計(jì)算差異位點(diǎn)數(shù)，核實(shí)差異位點(diǎn)的引物編號(hào)。檢測(cè)結(jié)果用檢測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品比較的位點(diǎn)差異數(shù)目表示，檢測(cè)結(jié)果的容許差距不能大于2個(gè)等位位點(diǎn)。9.2純度測(cè)定檢測(cè)結(jié)果根據(jù)檢測(cè)目的，選擇使用檢測(cè)樣品的自交個(gè)體、其他異常個(gè)體數(shù)目表示，也可使用正常個(gè)體數(shù)目(檢測(cè)試樣總數(shù)減去異常個(gè)體數(shù)目)占檢測(cè)試樣總數(shù)的百分率表示。統(tǒng)計(jì)與檢測(cè)樣品正常表現(xiàn)不一致的異常個(gè)體數(shù)，計(jì)數(shù)個(gè)體數(shù)目或計(jì)算百分率，檢測(cè)結(jié)果的容許差距應(yīng)符合GB/T3543.1的要求。10結(jié)果報(bào)告10.1.1按照GB/T3543.1的檢驗(yàn)報(bào)告要求，對(duì)品種真實(shí)性驗(yàn)證或身份鑒定的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行填報(bào)。10.1.2對(duì)于真實(shí)性驗(yàn)證，選擇下列方式之一進(jìn)行填報(bào)：a)通過(guò)對(duì)引物，采用電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較未能檢測(cè)出位點(diǎn)差異。b)通過(guò)對(duì)引物，采用電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較檢測(cè)出差異位點(diǎn)數(shù)通過(guò)對(duì)引物，采用電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)與DNA指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)篩查并鑒定，檢GB/T39914—2021測(cè)樣品屬于XXX品種，或者屬于XXX、XXXX其中的一個(gè)?！万?yàn)樣品低于5.4.1.1規(guī)定數(shù)量的；——與DNA指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)的；——檢測(cè)樣品遺傳不穩(wěn)定嚴(yán)重的位點(diǎn)(引物編號(hào))清單；——檢測(cè)采用了其他SSR引物的名稱(chēng)及序列。10.2.1按照GB/T3543.1的檢驗(yàn)報(bào)告要求，可以選擇下列方式之一進(jìn)行品種純度檢測(cè)結(jié)果的填報(bào)：a)通過(guò)編號(hào)為的引物，檢測(cè)了個(gè)個(gè)體，采用電泳方法，檢測(cè)出自交個(gè)——送驗(yàn)樣品低于5.4.2.1規(guī)定數(shù)量的；-—異常個(gè)體僅檢測(cè)自交個(gè)體的；——檢測(cè)樣品因遺傳不穩(wěn)定嚴(yán)重的位點(diǎn)(引物編號(hào))清單；——檢測(cè)采用了其他SSR引物的名稱(chēng)及序列。GB/T39914—2021(規(guī)范性附錄)濃鹽酸(36%～38%)25mL,加水定容至500mL。A.1.4CTAB提取液至1000mL,4℃貯存。定容至500mL。A.1.6NaOH提取液固體NaOH2g,加水定容至500mL。1mol/LTris-HCl5mL和0.5mol/LEDTA1mL,加HCl調(diào)pH至8.0,加水定容至500mL。固體NaCl146g,加水定容至500mL。A.2PCR擴(kuò)增A.2.1dNTP用TE緩沖液1分別配制dATP、dGTP、dCTP、dTTP終濃度100mmol/L的儲(chǔ)存液。各取20μLGB/T39914—2021A.2.2SSR引物用TE緩沖液1分別配制正向引物、反向引物終濃度均為40μmol/L的儲(chǔ)存液，等體積混合成A.2.36×加樣緩沖液丙烯酰胺190g和甲叉雙丙烯酰胺10g,加水定容至500mL。尿素450g、10×TBE緩沖液100mL和40%PAGE膠112.5mL,加水定容至1000mL。A.3.3Bind緩沖液無(wú)水乙醇49.75mL和冰醋酸250μL,加水定容至50mL。A.3.4親和硅烷工作液Bind緩沖液1mL和Bind原液5μL混合。A.3.5疏水硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。A.3.625%過(guò)硫酸銨溶液0.25g過(guò)硫酸銨溶于1mL超純水中。A.3.710×TBE緩沖液Tris堿108g、硼酸55g和0.5mol/LEDTA37mL,加水定容至1000mL。A.3.81×TBE緩沖液10×TBE緩沖液500mL,加水定容至5000mL。A.3.950×TAE緩沖液Tris堿242g、冰醋酸57.1mL和0.05mol/LEDTA100mL,加水定容至1000A.3.101×TAE緩沖液50×TAE緩沖液100mL,加水定容至5000mL。A.4銀染硝酸銀2g,加水定容至1000mL。固體NaOH30g和甲醛5mL,加水定容至1000mL。GB/T39914—2021(資料性附錄)等位基因擴(kuò)增片段信息表B.1列出了40對(duì)引物在已知玉米品種中擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度范圍、主要等位基因擴(kuò)增片段大小與頻率，以及參照樣品對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增片段信息。其中參照樣品只是列舉，考慮到在某一SSR位點(diǎn)多個(gè)品種存在相同的擴(kuò)增片段大小，確認(rèn)某一品種在該位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小與參照樣品是相同的，該品種也可替代相應(yīng)的參照樣品。表B.1已知品種主要等位基因擴(kuò)增片段信息引物等位基因擴(kuò)增片段參照樣品編號(hào)名稱(chēng)范圍/bp片段定義/bp片段頻率名稱(chēng)擴(kuò)增片段/bpPM01bnlg439wl0.007320/3500.115鄭單958322/3540.085農(nóng)大108325/3500.0040.027桂青貯1號(hào)335/3500.0090.078農(nóng)華101344/3500.034遼單527322/3460.0280.348先玉335350/3500.0350.14鄭單958322/3540.0270.023蠡玉16350/3580.014325/3620.0190.009金玉甜1號(hào)344/368PM02umc1335y5234～2540.076234/2340.074238/2380.681浚單20240/2400.161鄭單958252/2520.009254/254引物等位基因擴(kuò)增片段參照樣品編號(hào)名稱(chēng)范圍/bp片段定義/bp片段頻率名稱(chēng)擴(kuò)增片段/bpPM03umc2007y4238～2920.025正大619238/2820.085川單14246/2500.157鄭單958248/2550.094先玉335250/2550.0410.435鄭單958248/2550.0090.03238/2600.046蠡玉16255/2640.0070.002屯玉27255/2700.0210.005金玉甜1號(hào)252/2790.005正大619238/2820.032興墾10246/2840.0050.002奧玉28284/292PM04bnlg1940k70.018正大619344/3620.11346/3600.247鄭單958348/3620.0210.051成單22352/3620.0350.269先玉335360/3600.159鄭單958348/3620.0070.004奧玉28360/3660.004360/3680.0020.057352/3780.018京科968386/386表B.1(續(xù))引物等位基因擴(kuò)增片段參照樣品編號(hào)名稱(chēng)范圍/bp片段定義/bp片段頻率名稱(chēng)擴(kuò)增片段/bpPM05umc2105k30.018288/3170.376鄭單958290/3350.233292/3350.049農(nóng)華101294/3170.0020.019292/3020.044305/3230.0050.115先玉335290/3170.085浚單20323/3350.053鄭單958290/335PM06phi053k20.032333/3360.39鄭單958336/3620.053奧玉28341/3620.329浚單20343/3620.023正大619343/3570.173鄭單958336/362PM07phi072k44100.622鄭單958410/4104160.018正大619416/4214210.088正大619416/4214240.049蠡玉16424/4304270.0354300.187蠡玉16424/430PM08bnlg2291k40.314鄭單958364/3800.014金玉甜1號(hào)374/3760.009金玉甜1號(hào)374/3760.0120.175鄭單958364/3800.26農(nóng)華101382/4040.012386/4040.0020.005川單14390/4040.0214040.175農(nóng)華101382/404引物等位基因擴(kuò)增片段參照樣品編號(hào)名稱(chēng)范圍/bp片段定義/bp片段頻率名稱(chēng)擴(kuò)增片段/bpPM09umcl705wl0.035269/2750.0160.269鄭單958273/2750.14鄭單958273/2750.034川單14279/3010.0110.021273/2910.0050.004鄭加甜5039275/2970.0040.228浚單20275/3010.0050.012京科甜126273/3110.217先玉335319/319PM10bnlg2305k40.039244/2680.15鄭單958248/2520.283鄭單958248/2520.009正大619248/2540.06252/2600.141成單22252/2620.186農(nóng)華101252/2680.027262/2740.0020.104先玉335252/290PM11bnlg161k80.004成單220.064中科100.177農(nóng)華1010.0020.196鄭單9580.0180.069浚單200.0020.064遼單5270.125先玉3350.083成單190.0090.014表B.1(續(xù))引物等位基因擴(kuò)增片段參照樣品編號(hào)名稱(chēng)范圍/bp片段定義/bp片段頻率名稱(chēng)擴(kuò)增片段/bpPM11bnlg161k80.0370.0020.0120.085鄭單9580.0120.016金玉甜1號(hào)0.005雅玉青貯048890.0020.004219/219PM12bnlg1702k10.267先玉335265/2650.099成單19267/3050.0070.012雅玉青貯04889265/2710.152浚單20273/2750.147鄭單958275/2990.005正大619277/2770.046川單14273/2790.005興墾10265/2810.021金玉甜1號(hào)283/2890.0040.002金玉甜1號(hào)283/2890.065農(nóng)華101265/2910.102鄭單958275/2990.06275/3050.0020.004農(nóng)樂(lè)988275/321PM13umcl545y20.148先玉3350.226鄭單958202/2120.375先玉3350.177鄭單958202/2120.0110.064農(nóng)大108206/246引物等位基因擴(kuò)增片段參照樣品編號(hào)名稱(chēng)范圍/bp片段定義/bp片段頻率名稱(chēng)擴(kuò)增片段/bpPM14umcl125y30.027川單140.155先玉3350.253鄭單9580.168農(nóng)大1080.398鄭單958PM15bnlg240kl0.216鄭單958221/2370.069農(nóng)大108229/2330.08正大619231/2370.147農(nóng)大108229/2330.074成單22231/2350.376鄭單958221/2370.037金玉甜1號(hào)233/239PM16phi080k150.032鄭單958202/2220.0120.092中科4號(hào)212/2120.495先玉335217/2170.217鄭單958202/2220.152農(nóng)華101217/228PM17phi065k90.362鄭單958393/4134030.0054080.15先玉335408/4134130.482鄭單958393/413PM18umc1492y130.014正大619273/2840.843農(nóng)華101278/2840.143農(nóng)華101278/284PM19umcl432y60.041農(nóng)華101220/2240.726鄭單958224/2400.023220/2260.062224/2300.136鄭單958224/2400.012奧玉28224/257表B.1(續(xù))引物等位基因擴(kuò)增片段參照樣品編號(hào)名稱(chēng)范圍/bp片段定義/bp片段頻率名稱(chēng)擴(kuò)增片段/bpPM20umc1506k120.0140.092川單140.0370.164成單190.373先玉3350.12先玉335PM21umcl147y40.804先玉3350.196先玉335PM22bnlg1671y170.133中科4號(hào)0.0340.23鄭單9580.0410.322鄭單9580.0050.009金海5號(hào)0.0810.051中科10213/1230.0720.0070.016金甜678230/230PM23phi96100yl245～2770.034245/2570.373先玉335253/2660.064蠡玉16257/2660.0020.049農(nóng)華101253/2620.42先玉335253/2660.041266/2730.