質(zhì)粒DNA的提取和純化實驗報告

實驗一、質(zhì)粒DNA的提取和純化一、實驗?zāi)康模?、學(xué)習(xí)并掌握堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA的方法。2、初步了解DNA純化的原理。二、實驗原理1、細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。2、質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。3、堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。4、純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費(fèi)時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實驗室中常用。三、實驗步驟1、挑取單菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基試管內(nèi)（3.5ml/管）2、將試管放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，37℃，200r/min培養(yǎng)12-16h。3、將菌落轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中（盡量倒?jié)M）1200r/min，離心30s（沉淀菌體）4、重復(fù)一次第三步的過程5、棄掉上清液并扣干，加入預(yù)冷的Solution1100微升，劇烈震蕩打散菌體6、加入新配置的Solution2200微升，溫和顛倒試管6-7次混勻，室溫放置5min，使液體由渾濁變?yōu)橥该髡吵?、加入預(yù)冷的Solution3150微升，溫和顛倒離心管2-3次，震蕩7-8次，之后在1200r/min離心7min8、小心將含有質(zhì)粒DNA的上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中（400-500微升）9、加等體積的氯仿，輕微震蕩，1200r/min，離心2min,之后將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管10、加入2倍體積冰冷無水乙醇，輕輕顛倒離心管混勻，室溫放置2min，1200r/min下離心10min11、棄上清，加入70%乙醇洗滌沉淀，12000r/min，離心2min，棄上清12、棄上清，液體盡量倒凈，并在吸水紙上扣干，室溫靜置15min干燥13、加入1*TE40微升溶解質(zhì)粒，用于定量分析、電泳檢測等實驗二、DNA瓊脂糖凝膠電泳一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)2、掌握有關(guān)的技術(shù)和識讀電泳圖譜的方法。二、實驗原理1、關(guān)于電泳技術(shù)：電泳常用于分離和純化那些分子大小、電荷性狀或分個構(gòu)象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白質(zhì)和核酸。正因為如此，電泳已成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，其中在分子生物學(xué)實驗中最為常用的是瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖是一種海藻多糖，瓊脂糖膠分離范圍很大，但其分辨率卻相對較低。通過改變瓊脂糖凝膠的濃度，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的電泳技術(shù)可以分離200到50,000bp大小的DNA片斷。一般瓊脂糖膠濃度在0.5％到4％之間，且瓊脂糖凝膠濃度越大，凝膠就越硬。較高濃度的瓊脂糖膠有利于較小的DNA片斷分離，而較低濃度的瓊脂糖膠則可以分離較大的DNA片斷。2、瓊脂糖凝膠電泳條帶的觀察：通過觀察示蹤染料的遷移距離可以判斷DNA的遷移距離。溴酚藍(lán)染料在瓊脂糖凝膠的遷移速率大小與300和4000bp大小的雙鏈DNA片斷相同。當(dāng)遷移足夠距離后，就可以通過Gelview染色來觀察DNA片斷。Gelview是一種熒光染料。它可以在做膠時混入其中在電泳時進(jìn)行染色，也可以待電泳完成后將凝膠浸泡在稀釋的Gelview溶液中進(jìn)行染應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。3、為最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再將離心管放入離心機(jī)稍作離心，使殘留在管壁的液體集中到離心管底部，再用移液器移除液體。4.、注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要快速按出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。5、本次實驗中，原應(yīng)滅菌之前加入培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖由于操作疏忽而忘記加入，隨后按照老師指示配制100mL10%的葡萄糖溶液一起滅菌，待滅菌后再將葡萄糖溶液加入培養(yǎng)基中。6、培養(yǎng)菌體所用的14個錐形瓶有2個錐形瓶中沒有菌體生長跡象，另外有2個錐形瓶內(nèi)菌體生長較少。原因可能是接種時操作失誤，例如可能是接種環(huán)挑取菌種后離酒精燈火焰太近或者挑取菌種前沒有充分冷卻，也有可能是接種時接入的菌量過少等。7、在純化DNA加入冰乙醇的步驟中，2只離心管在加入的DNA樣品量相同的情況下，出現(xiàn)了從-20℃環(huán)境下取出后2只離心管內(nèi)液體體積相差較多的情況，分析后發(fā)現(xiàn)量較少的1只離心管內(nèi)加入的各種試劑的量是合適的?？赡艿脑颍孩僭谟靡埔浩饕迫”?/p>