無菌檢驗(yàn)基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)操作專項(xiàng)規(guī)程SOP

文件名稱無菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）頁碼：1/5文件編號(hào)YZ-Q3(z)-ZL-10-版次第三版制定審核批準(zhǔn)制訂日期審核日期同意日期頒發(fā)部門頒發(fā)數(shù)量生效日期分發(fā)單位目標(biāo)：制訂無菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)操作正確。范圍：本標(biāo)準(zhǔn)適適用于本企業(yè)大容量注射劑無菌檢驗(yàn)操作。責(zé)任者：質(zhì)管部、化驗(yàn)室主任、QC檢驗(yàn)員內(nèi)容：1、標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：《中國藥典》二部附錄XIH。2、簡述：無菌檢驗(yàn)方法系用于檢驗(yàn)藥品是否無菌一個(gè)方法。檢驗(yàn)項(xiàng)目包含需氣菌、厭氣菌及真菌檢驗(yàn)。若供試品符合該項(xiàng)檢驗(yàn)方法相關(guān)要求，僅表明了在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)覺微生物污染。3、環(huán)境要求：該項(xiàng)檢驗(yàn)應(yīng)在環(huán)境潔凈度萬級(jí)（C級(jí)）背景下局部百級(jí)（A級(jí)）單向流區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。其全過程必需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。預(yù)防微生物污染，但所采取方法不得影響供試品中微生物檢出。操作前環(huán)境潔凈度應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證。日常檢驗(yàn)需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。5、方法驗(yàn)證：進(jìn)行該項(xiàng)檢驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)《無菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證規(guī)程》確定該方法適用性。4、人員要求：無菌檢驗(yàn)人員必需含有微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌技術(shù)培訓(xùn)。6、檢驗(yàn)數(shù)量及檢驗(yàn)量：6.1、接種每種培養(yǎng)基所需最少檢驗(yàn)數(shù)量:2%或10個(gè)（取較少者），供試品無菌檢驗(yàn)若采取薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽性對(duì)照用；若采取直接過濾法，應(yīng)增加供試品無菌檢驗(yàn)時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種樣品量作陽性對(duì)照用。6.2、每支供試品接入每種培養(yǎng)基最少許:半量（100ml≤V≤200ml），采取薄膜過濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種供試品總接種量，只要供試品特征許可，應(yīng)將全部容器內(nèi)全部內(nèi)容物過濾。7、細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30～35℃，真菌培養(yǎng)溫度為23～288、儀器用具：垂直層流超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴箱、顯微鏡、離心機(jī)、雙碟、試管、三角瓶、刻度離心管、注射器（針頭）、剪刀、鑷子、注射器盒、75％酒精棉球、紫外光燈365nm、真空泵、一次性使用集菌培養(yǎng)器。9、消毒劑配制：9.1、75％乙醇溶液（配制酒精棉球用）。9.2、0.2％新潔爾滅溶液（配制消毒棉球用）。9.3、2％來蘇爾溶液（配制消毒棉球用）。10、試劑及培養(yǎng)基配制：10.1、0.1％蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微溫使溶解，濾清，調(diào)整PH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。10.2、10.4、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：按商品說明稱取培養(yǎng)基，配制，搖勻，分裝，按培養(yǎng)基說明高壓滅菌，保留備用。分裝容器應(yīng)合適，其裝量和容器高度百分比應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超出培養(yǎng)基深度1/2。供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層高度不得超出培養(yǎng)基深度1/5，不然須經(jīng)100℃10.5、改良馬丁培養(yǎng)基：取商品干燥培養(yǎng)基28.5g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121℃10.6、選擇性培養(yǎng)基：按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適量中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法驗(yàn)證試驗(yàn)10.7、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：按商品說明稱取培養(yǎng)基，配制，加熱，溶解，分裝，按培養(yǎng)基說明高壓滅菌，保留備用。10.8、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：取商品干燥培養(yǎng)基3.4g，加蒸餾水1000ml，加熱溶解分裝，121℃10.9、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：取商品干燥培養(yǎng)基制備或按改良馬丁培養(yǎng)基處方及制法，加入14.0g瓊脂，調(diào)整PH值使滅菌后PH值為6.4±0.2，分裝，121℃10.10、制備好培養(yǎng)基應(yīng)保留在2～25℃11、試驗(yàn)前準(zhǔn)備工作11.1、用具洗刷11.1.1、玻璃器皿：如試管、量筒、移液管、刻度吸管、離心管、三角瓶、雙碟等用清潔液浸泡，用流水洗滌，再用蒸餾水洗滌411.1.11.1.3、剪刀、鑷子用水及去污粉洗滌，用水沖洗潔凈，再用蒸餾水洗滌11.1.11.1.5、潔凈服、褲、帽子、口罩等用水洗滌潔凈后，晾干。11.2、用具包扎及滅菌11.2.1、移液管、刻度吸管在管口上端內(nèi)，松松塞入少許脫脂藥品，然后每支管用白紙嚴(yán)密卷好，再用兩層牛皮紙一起包扎。11.2.2、洗滌潔凈注射器及適配針頭各部件和剪刀、鑷子一并入墊有紗布鋁盒內(nèi)，一層層放好，蓋上紗布，將鋁盒蓋好，用牛皮紙包扎。11.2.3、試管、三角瓶等在管（瓶）口塞上紗布棉紗用牛皮紙包裝嚴(yán)密。11.2.6、將潔凈服、等用布口袋配套裝入，扎緊口袋，用牛皮紙包扎好。11.2.7、將以上包扎好用具在121℃蒸汽滅菌20分鐘?；虿扇∵m宜滅菌方法。（適宜高溫滅菌器皿可采取16011.2.8、物品滅菌完成，勿立即置冷處，以免急速冷卻造成染菌，應(yīng)置恒溫培養(yǎng)箱中干燥。11.3、潔凈室清潔和滅菌11.3.1、潔凈室及超凈臺(tái)，每七天用高錳酸鉀加甲醛薰蒸滅菌。11.3.2、在每次操作前，應(yīng)作好清潔工作，并用0.2%12、操作12.1、開啟傳輸窗外側(cè)門，將物品表面消毒后置傳輸窗內(nèi)，關(guān)閉窗門。12.2、操作人員按《進(jìn)入潔凈室更衣程序》洗手、更衣?lián)Q工作鞋，換無菌衣、褲、口罩。進(jìn)入潔凈室內(nèi)，開啟內(nèi)側(cè)門，取出物品，關(guān)閉內(nèi)側(cè)門，經(jīng)緩沖間帶入潔凈室內(nèi)，物品放置于試驗(yàn)臺(tái)上，關(guān)閉潔凈室門，人員離開潔凈室，繼續(xù)用紫外燈照射半小時(shí)，關(guān)燈，再將用具放入超凈臺(tái)內(nèi)。12.3、培養(yǎng)基適用性檢驗(yàn)：無菌檢驗(yàn)用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合無菌性檢驗(yàn)及靈敏度檢驗(yàn)要求。本檢驗(yàn)可在供試品檢驗(yàn)前或和供試品檢驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。12.3.1、無菌效果檢驗(yàn)：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶）培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。12.3.2、靈敏度檢驗(yàn)：12.3.2.1、菌種及菌液制備：12.3.2.1.1、檢驗(yàn)用菌種包含：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]銅綠假單胞菌（Pstudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]生孢梭菌（Clostridiumsporgenes）[CMCC(B)64941]白色念珠菌（Candidaalbicaus）[CMCC(F)98001]黑曲菌（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]12.3.2.1.2、菌液制備方法：銅綠假單胞菌菌懸液制備方法同金黃色葡萄球菌菌懸液制備方法。12.3.2.2、培養(yǎng)基接種：取每管裝量為12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100CFU金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另一支不接種，作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3天；每管裝量為9ml改良馬丁培養(yǎng)基5支分別接種小于100CFU白色念珠菌、黑曲菌各2支，另一支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。12.3.2.3、結(jié)果判定：空白對(duì)照管應(yīng)無菌生長，若加菌培養(yǎng)基管均生長良好，判定該培養(yǎng)基靈敏度符合要求。12.4、配制培養(yǎng)基應(yīng)在涼暗處保留，通常不得超出2周。臨用前細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)基分別經(jīng)30～35℃和20～2512.5、陽性對(duì)照試驗(yàn)：12.5.1、應(yīng)依據(jù)供試品特征選擇陽性對(duì)照菌，無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌供試品以生孢梭菌為對(duì)照品；抗真菌供試品以白色念珠菌為對(duì)照品。12.5.2、陽性對(duì)照試驗(yàn)菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。12.5.3、取各陽性對(duì)照菌懸液（含菌量小于100CFU）及供試品（用量同供試品無菌檢驗(yàn)每份培養(yǎng)基接種樣品量），以無菌操作加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48～72小時(shí)，檢驗(yàn)應(yīng)生長良好。（陽性對(duì)照試驗(yàn)操作應(yīng)和微生物程度檢驗(yàn)操作隔離進(jìn)行，預(yù)防交叉污染）。12.6、陰性對(duì)照試驗(yàn)：取供試品對(duì)應(yīng)溶劑或稀釋劑沖洗液同法操作，培養(yǎng)14日應(yīng)無菌生長。12.7、供試品檢驗(yàn)：12.7.1、供試品外部消毒：包裝瓶外壁用75％乙醇擦拭，待干。12.7.2、供試品制備：用滅菌鑷子取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管并安上針頭，注射器針頭應(yīng)快速經(jīng)過火焰數(shù)次，用注射器以無菌操作直接吸收供試液?；虺橹烈褱缇Ａ萜髦?，用稀釋劑稀釋為供試液，如為可溶于水固體供試品，應(yīng)取要求量，加入適宜滅菌稀釋液溶解做為供試液。12.7.3、直接接種法：取供試品，按上述操作進(jìn)行外部消毒和制備后，用滅菌注射器以無菌操作自每管中吸收供試品，在近火焰旁以左手持培養(yǎng)基，右手半握拳，以小指和無名指拔開培養(yǎng)基管棉塞，管口經(jīng)過火焰，移至火焰下側(cè)，分別將各供試品1ml（或要求量，除另有要求外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基用量應(yīng)符合接種供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積10%）沿培養(yǎng)基管壁加入各培養(yǎng)基管內(nèi)，每個(gè)供試品均分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基各5管，另取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管一支，同法操作，操作結(jié)束后，接種對(duì)照菌液1ml（小于100CFU）作為供試品陽性對(duì)照。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基不少于10ml。注入供試液時(shí)，切勿向液面直射，以免將空氣中氧帶入培養(yǎng)基中，并在火焰旁將塞子塞嚴(yán)。接種后輕輕振動(dòng)使均勻。12.7.4、薄膜過濾法12.4.1水溶性供試液過濾前應(yīng)先將少許沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充足干燥。為發(fā)揮濾膜最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量通常為100ml，且總沖洗量不得超出1000ml，以避免濾膜上微生物受損傷。12.7.4、2硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基在30～35℃培養(yǎng)14天，改良馬丁培養(yǎng)基在23～28℃12.8結(jié)果判定：陽性對(duì)照管應(yīng)生長良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長。不然，試驗(yàn)無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合要求;若供試品管中任何顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合要求，除非能充足證實(shí)