轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)

關(guān)于轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)第一節(jié)轉(zhuǎn)基因育種的概念一、植物遺傳轉(zhuǎn)化（植物基因工程）

以植物為對(duì)象，采用重組DNA技術(shù)，將外源目的基因?qū)胧荏w植物基因組，最后獲得外源目的基因正確表達(dá)和穩(wěn)定遺傳的新植物類型。

核心技術(shù)是重組DNA技術(shù)

第2頁,共90頁，星期六，2024年，5月

重組DNA（recombinantDNA）：是指人工創(chuàng)造的自然界中不存在的DNA分子。主要指利用不同生物來源的DNA分子拼接的雜種DNA分子。

其過程包括如下幾個(gè)步驟：

從細(xì)胞或組織獲得DNA并純化用限制酶切割DNA將獲得的限制片段連接到載體上，外源DNA片段與載體連接后形成的雜種DNA分子稱為重組DNA分子重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)重組DNA分子復(fù)制，產(chǎn)生大量相同拷貝的重組DNA分子，稱為克隆克隆的DNA分子可以從宿主細(xì)胞中回收，純化克隆的DNA可以轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)品可以被分離出來用于研究或商業(yè)開發(fā)第3頁,共90頁，星期六，2024年，5月二、轉(zhuǎn)基因育種將植物遺傳轉(zhuǎn)化和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，培育具有特定目標(biāo)性狀的植物新品種。

第4頁,共90頁，星期六，2024年，5月轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的一般實(shí)驗(yàn)流程目的基因的克隆與鑒定轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建E.Coli轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒抽提與鑒定農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與活化外植體制備浸染選擇培養(yǎng)共培養(yǎng)移栽繼代繁殖分子檢測生理檢測純化第5頁,共90頁，星期六，2024年，5月轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)的關(guān)系

二者本質(zhì)都是通過獲得優(yōu)良基因進(jìn)行遺傳改良。

在基因轉(zhuǎn)移的范圍和效率上有兩點(diǎn)重要區(qū)別：第一，傳統(tǒng)技術(shù)一般只能在生物種內(nèi)個(gè)體間實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)所轉(zhuǎn)移的基因則不受生物體間親緣關(guān)系的限制。

第6頁,共90頁，星期六，2024年，5月第二，傳統(tǒng)技術(shù)是在生物個(gè)體水平上進(jìn)行，操作對(duì)象是整個(gè)基因組，所轉(zhuǎn)移的是大量的基因，不可能準(zhǔn)確地對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行操作和選擇，對(duì)后代的表現(xiàn)預(yù)見性較差。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移的是經(jīng)過明確定義的基因，功能清楚，后代表現(xiàn)可準(zhǔn)確預(yù)期，因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)的發(fā)展和補(bǔ)充。第7頁,共90頁，星期六，2024年，5月將兩者緊密結(jié)合，可相得益彰，提高作物品種遺傳改良的效率。

第8頁,共90頁，星期六，2024年，5月9

第二節(jié)目的基因的獲得

根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)行基因克?。粡幕蚪MDNA或mRNA序列克隆基因。

根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)行基因克隆主要步驟如下：利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產(chǎn)物分離蛋白質(zhì)明確氨基酸序列推導(dǎo)核苷酸序列人工合成第9頁,共90頁，星期六，2024年，5月第三節(jié)植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)受體:是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。受體系統(tǒng):是指用于基因轉(zhuǎn)化的外植體通過細(xì)胞或其

他組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性

系，并能接受外源DNA整合、轉(zhuǎn)化選擇對(duì)抗

生素敏感的再生系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化的主要目的:外源DNA穩(wěn)定地插入植物細(xì)胞的染

色體組中，并再生出完整的植株。

第10頁,共90頁，星期六，2024年，5月11良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：1、必須具有脫分化和再生能力，能夠形成新的植物體。高

效穩(wěn)定的再生能力；2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3、外植體來源方便，如胚和其它器官等；4、對(duì)篩選劑敏感；5、能夠接受外源基因，并通過基因重組或其它途徑使外源

基因穩(wěn)定地插入植物染色體組,轉(zhuǎn)化率高第11頁,共90頁，星期六，2024年，5月12常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體，因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)第12頁,共90頁，星期六，2024年，5月132.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。

現(xiàn)已建立了一些植物幼芽、胚軸、莖尖分生組織等外植體誘導(dǎo)形成直接分化芽再生體系。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。第13頁,共90頁，星期六，2024年，5月3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得

基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合

體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。第14頁,共90頁，星期六，2024年，5月154.胚狀體再生系統(tǒng)是指經(jīng)體細(xì)胞培養(yǎng)形成的在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)，又稱體細(xì)胞胚。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力

強(qiáng)，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。第15頁,共90頁，星期六，2024年，5月5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法、花粉粒浸泡法、子房微針注射法等。第16頁,共90頁，星期六，2024年，5月優(yōu)點(diǎn)：生殖細(xì)胞不僅具有全能性，而且接受外源遺傳

物質(zhì)的能力強(qiáng)，導(dǎo)入外源基因成功率高，更易

獲得轉(zhuǎn)基因植株。又因生殖細(xì)胞是單細(xì)胞，轉(zhuǎn)

化的基因五顯隱性影響，外源目的基因充分表

達(dá)。因此利用生殖細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因受體與單倍

體育種技術(shù)相結(jié)合，可簡化和縮短育種純化過

程。缺點(diǎn)：獲得單細(xì)胞只能在開花期，常受到季節(jié)及生長

條件的限制。第17頁,共90頁，星期六，2024年，5月

第四節(jié)植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一、載體的概念

載體（vector）:將外源基因送入受體細(xì)胞的工具

本質(zhì)是一段DNA分子,是指能在連接酶作用下和外源DNA片段或基因連接，并運(yùn)送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子。二、載體的功能

作為植物基因轉(zhuǎn)化的載體，必須具有兩種功能：

一是它能作為媒介將外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞中去，并且整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA上

二是它能提供被寄主細(xì)胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所識(shí)別的DNA序列，即啟動(dòng)子和復(fù)制子起始位點(diǎn)，以保證轉(zhuǎn)化的外源基因能在植物細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。第18頁,共90頁，星期六，2024年，5月四、植物基因工程常用載體質(zhì)粒(plasmid)；病毒載體(virusvector)；噬菌體(phage)；酵母載體(yeastvector)；以病毒載體和質(zhì)粒載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化比較多。

第19頁,共90頁，星期六，2024年，5月五、Ti質(zhì)粒有一種土壤細(xì)菌,稱為農(nóng)桿菌，它能誘導(dǎo)植物傷口形成冠癭瘤，細(xì)菌的致瘤能力來源于細(xì)菌內(nèi)的一個(gè)額外染色體即質(zhì)粒(plasmid)，稱Ti質(zhì)粒。還有一種細(xì)菌稱發(fā)根農(nóng)桿菌,決定毛根癥的質(zhì)粒為Ri質(zhì)粒，即誘發(fā)寄主植物產(chǎn)生毛根

.Ti和Ri質(zhì)粒是理想的基因克隆載體，通過它們可以將外源的DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并再生出能夠表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。第20頁,共90頁，星期六，2024年，5月Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，約有150-200kb大小。在病原菌致病過程中，其中的一段DNA分子（T-DNA）能夠插入到植物基因組中并能夠穩(wěn)定表達(dá)。

第21頁,共90頁，星期六，2024年，5月根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型胭脂堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素堿型（或稱琥珀堿型）第22頁,共90頁，星期六，2024年，5月不同類型的Ti質(zhì)粒都具有:（1）T－DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）：該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，合起來約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。第23頁,共90頁，星期六，2024年，5月（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）：該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）：該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制起始。第24頁,共90頁，星期六，2024年，5月第五節(jié)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（植物細(xì)胞）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法第25頁,共90頁，星期六，2024年，5月

遺傳轉(zhuǎn)化分為兩種：一種是生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化；一種是非生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。就非載體轉(zhuǎn)化而言，該系統(tǒng)又可以分為兩種類型：種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞，如花粉粒通道法。直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：不用任何載體，采用物理化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，如基因槍法、脂質(zhì)體法、超聲波法等。第26頁,共90頁，星期六，2024年，5月1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的寄主范圍

根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的寄主范圍很廣，目前已知有90多科、600余種植物可以感染。如煙草、大豆、棉花、馬鈴薯、油菜、花生、番茄、蘋果、楊樹等用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化都先后獲得成功。遺憾的是大部分單子葉植物很少或完全不能產(chǎn)生激活Ti質(zhì)粒Vir區(qū)基因的信號(hào)分子。為了克服根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的障礙，許多研究者對(duì)感染的合適部位和轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了探討，并發(fā)現(xiàn)乙酰丁香酮和其它酚類化合物可促進(jìn)大麥、小麥等很多單子葉植物的轉(zhuǎn)化。經(jīng)過不懈努力，科學(xué)家用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化重要的單子葉植物如水稻、玉米、小麥等都取得了成功。一、載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法是目前研究最多、機(jī)理最清楚、技術(shù)方法最成熟的轉(zhuǎn)基因方法。第一批表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物就是用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的。迄今所獲得的200多種轉(zhuǎn)基因植物中，80%以上是利用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生的。第27頁,共90頁，星期六，2024年，5月農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化首先要求植物外植體能夠產(chǎn)生乙酰丁香酮或其它能夠誘導(dǎo)Vir區(qū)基因的活性物質(zhì)。

其次是農(nóng)桿菌能夠接近具有再生能力的感受態(tài)細(xì)胞。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法第28頁,共90頁，星期六，2024年，5月

可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的外植體種類很多，從單細(xì)胞（通常是原生質(zhì)體）、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和愈傷組織（未分化的胚性細(xì)胞）、薄壁細(xì)胞層、組織切片（如蘿卜韌皮部和馬鈴薯塊莖薄壁組織）到各種植物器官，如葉、根、莖和花組織的切段等。

第29頁,共90頁，星期六，2024年，5月基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的一般操作

以根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物葉片為例1.將表面消毒的葉片切成小塊2.小塊在過夜培養(yǎng)并稀釋到一定濃度的根癌農(nóng)桿菌液中浸泡幾分鐘，以便讓根癌農(nóng)桿菌感染葉片切塊的傷口。3.從菌液中撈出小塊，培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。4.在含頭孢霉素選擇培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化出芽。5.將芽轉(zhuǎn)入含有抗生素的生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根。6.將完整的轉(zhuǎn)基因植株移栽到土壤中。第30頁,共90頁，星期六，2024年，5月該方法是Marton等1979年以原生質(zhì)體為受體建立起來的，隨后經(jīng)過一系列的改進(jìn)，現(xiàn)在是植物基因工程中最常用的一種轉(zhuǎn)化方法。該方法的主要原理是將受體與供體在一起培養(yǎng)，通過接觸感染而發(fā)生轉(zhuǎn)移，供體常用農(nóng)桿菌、病毒載體等形式。

A.原生質(zhì)體共培養(yǎng)法取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長出細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。第31頁,共90頁，星期六，2024年，5月①從煙草無菌苗中分離原生質(zhì)體，并預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。②原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，原生質(zhì)體濃度l05／ml、農(nóng)桿菌l07／ml，20℃下保溫32小時(shí)。③沖洗去游離的細(xì)菌，將原生質(zhì)體培養(yǎng)在有抗生素(250mg／L萬古霉素，200mg／L羧芐青霉素，200mg／L鏈霉素)的培養(yǎng)基中，這些抗生素抑制細(xì)菌生長，而對(duì)原生質(zhì)體無毒害。④3周后，離心收集細(xì)胞團(tuán)，再培養(yǎng)在無激素培養(yǎng)基上，2周內(nèi)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)是激素非依賴性生長細(xì)胞團(tuán)，在該培養(yǎng)基中可快速生長，而非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)則生長很慢，最后變褐死亡。

煙草原生質(zhì)體與Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的共培養(yǎng)法程序?yàn)椋旱?2頁,共90頁，星期六，2024年，5月B.葉盤共培養(yǎng)法

圖該方法最早由Horsch(1985)首創(chuàng)，并已被成功地用于煙草、番茄、矮牽牛和楊樹等植物的轉(zhuǎn)化。其步驟是用打孔器取得葉圓片（直徑2-5毫米），在過夜培養(yǎng)并調(diào)整到合適濃度的農(nóng)桿菌菌液中浸泡4-5分鐘，置于培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2～3天，在轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的培養(yǎng)基上，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞直接再生植株。葉圓片法經(jīng)過改良可以用于莖段、葉柄和萌發(fā)種子等其它外植體的轉(zhuǎn)化。優(yōu)點(diǎn)：適用性廣，對(duì)于那些能被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。第33頁,共90頁，星期六，2024年，5月

把轉(zhuǎn)化外植體，如莖段、幼胚、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等農(nóng)桿菌在一起培養(yǎng)24～48h，用無菌水沖洗數(shù)次，洗去農(nóng)桿菌，將材料轉(zhuǎn)入含有抑菌劑（如cefotaxime等）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化體。C.共培養(yǎng)法原則上，該種共培養(yǎng)與原生質(zhì)體共培養(yǎng)的方法和步驟是相同的，在供體上，則必須是有侵染和感染能力的載體系統(tǒng)，如帶有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌。第34頁,共90頁，星期六，2024年，5月又稱整體植株接種轉(zhuǎn)化法，是指人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植物體內(nèi)，使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植物體內(nèi)進(jìn)行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。接種后2-3周，切下接種處部分組織培養(yǎng)4周，可產(chǎn)生愈傷組織，進(jìn)一步通過分化培養(yǎng)可獲得轉(zhuǎn)基因植株。D.直接接種法優(yōu)點(diǎn)：方法簡便，實(shí)驗(yàn)周期短，因培養(yǎng)基不與農(nóng)桿菌直接接觸，故污染較少。第35頁,共90頁，星期六，2024年，5月二、DNA直接導(dǎo)入的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)

DNA直接導(dǎo)入的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)：是指不依賴農(nóng)桿菌載體和其它生物媒體，將外源目的基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的技術(shù)，又稱為無載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。這為不易通過農(nóng)桿菌等載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的植物提供了外源基因?qū)氲挠行緩?。根?jù)DNA導(dǎo)入機(jī)理可分為：化學(xué)法：是以原生質(zhì)體為受體，借助特定的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。目前主要有PEG法和脂質(zhì)體法。物理法：是基于許多物理因素對(duì)細(xì)胞膜的影響或通過機(jī)械損傷直接將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞。原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織及器官均可作為外植體，比化學(xué)法更具廣泛性和實(shí)用性。常用的方法有基因槍法、超聲波法、電擊法等。

第36頁,共90頁，星期六，2024年，5月1、物理方法（1）基因槍法

80年代末期，由康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速?zèng)_擊細(xì)胞，把細(xì)胞擊孔，使目的基因進(jìn)入受體。

第37頁,共90頁，星期六，2024年，5月操作技術(shù)程序?yàn)椋夯驑屖疽鈭D首先將鎢、金微粒(直徑約0.4μm，重量約0.05mg)與供體DNA溶液(1～2μl)混合并保溫，使DNA吸附在金屬微粒的表面，然后將該溶液置于所謂的“基因槍”儀器中，儀器高壓放電將金屬微粒加速，直接噴射受體原生質(zhì)或細(xì)胞，細(xì)胞擊穿成孔后，在鎢粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以進(jìn)入受體細(xì)胞。

第38頁,共90頁，星期六，2024年，5月基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對(duì)植物細(xì)胞的毒害也比金粉大。（2）將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動(dòng)力系統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動(dòng)力；第三類以高壓蒸汽作為動(dòng)力?；驑尫ǖ奶攸c(diǎn)：（1）轉(zhuǎn)化效率高。（2）受體廣泛。（3）操作簡單。第39頁,共90頁，星期六，2024年，5月基因槍法缺點(diǎn)與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法比，轉(zhuǎn)化效率低形成的嵌合體多結(jié)果的重復(fù)性差遺傳穩(wěn)定性差儀器昂貴成本高若與農(nóng)桿菌法結(jié)合，可提高轉(zhuǎn)化效率第40頁,共90頁，星期六，2024年，5月（2）電激法(electroperation)又稱電穿孔發(fā)，是利用高壓電脈沖的作用對(duì)原生質(zhì)體或細(xì)胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法。

原理：細(xì)胞生物學(xué)研究證明，細(xì)胞膜的磷脂雙分子層可視為一種電容，其靜膜電位（Vm）約為l00mV，導(dǎo)電性很差。當(dāng)把細(xì)胞置于外加電場中時(shí)，會(huì)使膜電位升高，雙分子層兩端電壓形成差勢，隨著外加電場電壓升高，細(xì)胞膜被壓縮變薄，當(dāng)膜電壓升到一定數(shù)值時(shí)，膜被擊穿，形成短暫性可逆性的開閉通道，外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。

電轉(zhuǎn)儀第41頁,共90頁，星期六，2024年，5月（3）微注射法（micro-injection）

微量注射：用注射針或微針在受體細(xì)胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿刺孔進(jìn)入細(xì)胞或隨穿刺針頭—道進(jìn)入。

真正的顯微注射：利用顯微注射儀，通過機(jī)械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。

第42頁,共90頁，星期六，2024年，5月

直接注射法：是用注射針直接將大量的DNA注入植物組織或器官達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的，如子房、分蘗節(jié)、幼穗等，又稱宏量注射法。

在注射過程中，針尖往往摧毀了被注射的細(xì)胞，因此該法試圖利用與被注射細(xì)胞鄰近的組織細(xì)胞吸收外源DNA。第43頁,共90頁，星期六，2024年，5月（4）激光微束法(lasermicrobeam)（5）超聲波法

此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細(xì)胞，然后用激光光源代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細(xì)胞周圍的外源DNA分子隨之進(jìn)入細(xì)胞?；驹恚菏抢玫吐晱?qiáng)脈沖超聲波的物理作用，擊穿細(xì)胞膜造成通道，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。

利用超聲波處理可避免脈沖高壓對(duì)細(xì)胞的損傷作用，有利于原生質(zhì)體的存活，是一種有潛力的轉(zhuǎn)化途徑。（6）離子束法

離了束作用在生物表面后可引起電子濺射，離子束的濺射好象一把手術(shù)刀，對(duì)生物體進(jìn)行微細(xì)加工，使生物體表面層層剝離，原來不連通的通道在一定距離內(nèi)連通，后來的離子就可穿行較長的距離，落在預(yù)定的位置上。

第44頁,共90頁，星期六，2024年，5月（7）碳化硅纖維介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移法是簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的導(dǎo)入DNA進(jìn)入植物完整細(xì)胞的方法。應(yīng)用直徑為0.6微米、長度為10-80微米的碳化硅纖維，使附著于纖維或細(xì)胞壁上的DNA，借助與在漩渦震蕩引起的相互碰撞過程中纖維對(duì)細(xì)胞的穿刺作用進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。（8）DNA卵育法（又稱浸泡法）利用供體DNA溶液與受體的種子、幼胚、幼穗、及幼苗等器官的接觸，使外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，然后與受體細(xì)胞基因組重組，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化效果。方法：浸種、浸苗、浸胚、浸芽特點(diǎn)：簡單、快速、方便第45頁,共90頁，星期六，2024年，5月2．化學(xué)方法

（1）PEG法

是細(xì)胞融合劑，它可以使細(xì)胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連，即具有細(xì)胞粘合作用；PEG還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識(shí)別，因而能促進(jìn)原生質(zhì)體融合和改變細(xì)胞膜的通透性，從而有利于外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體，實(shí)現(xiàn)基因遺傳轉(zhuǎn)化。第46頁,共90頁，星期六，2024年，5月

脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜結(jié)構(gòu)，可將DNA包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。(2)脂質(zhì)體法第47頁,共90頁，星期六，2024年，5月3.花粉管通道法（pollen-tubepathwaysystem）

原理是授粉后使外源DNA能沿花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。花粉管通道法轉(zhuǎn)化實(shí)質(zhì)是受精過程轉(zhuǎn)化。花粉粒在柱頭上萌發(fā)形成花粉管，不斷向胚囊伸長，滴注在柱頭上的外源DNA隨著花粉管進(jìn)入胚囊。花粉管通道法是由周光宇等(1978)建立并在長期科學(xué)研究中發(fā)展起來的。第48頁,共90頁，星期六，2024年，5月通過花粉管通道常用的外源基因?qū)敕椒ˋ.柱頭滴注法

將外源DNA溶液直接滴于授粉后2-3小時(shí)的柱頭上，或?qū)⑹诜酆笾^切除一部分，在切除處花粉管孔處滴加外源DNA。B.花粉粒與外源DNA混合授粉法

將DNA溶液與適量新鮮花粉迅速混合成糊狀，立即涂在柱頭上，套袋隔離至種子成熟?；?qū)NA溶液涂在柱頭上，然后立即將采集的花粉灑落在柱頭上。C.花粉粒培養(yǎng)法

取新鮮的花粉灑落在柱頭上，待萌發(fā)時(shí)取下加入外源DNA溶液中混均后在涂在柱頭上。D.花粉粒轉(zhuǎn)化法

又稱花粉攜帶發(fā)，先用農(nóng)桿菌、基因槍、微注射等方法將外源DNA導(dǎo)入花粉粒，涂在柱頭上。第49頁,共90頁，星期六，2024年，5月50第六節(jié)轉(zhuǎn)化植株的檢測與鑒定外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低

如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體是一個(gè)重要問題。第50頁,共90頁，星期六，2024年，5月一、選擇標(biāo)記基因外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低，目的基因已被整合到核基因組并表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞更少，使用特異性選擇標(biāo)記基因（selectablemarkergenes）進(jìn)行標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細(xì)胞。表達(dá)載體的組成目的基因啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因第51頁,共90頁，星期六，2024年，5月原理：選擇標(biāo)記基因的主要功能是該基因的產(chǎn)物給予植物細(xì)胞一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞在施用選擇劑條件下不能生長、發(fā)育與分化，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)該選擇劑產(chǎn)生抗性，不影響其生長、發(fā)育，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞及植株選擇出來。第52頁,共90頁，星期六，2024年，5月必須具備以下四個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；④檢測容易，并且能定量分析。第53頁,共90頁，星期六，2024年，5月54常用選擇標(biāo)記基因：

編碼抗生素的抗性基因編碼除草劑的抗性基因?qū)⑦x擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動(dòng)子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。標(biāo)記基因在受體細(xì)胞表達(dá)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力而存活下來。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則被抑制、殺死。第54頁,共90頁，星期六，2024年，5月常用選擇標(biāo)記基因：

編碼抗生素的抗性基因:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因II（nptII），編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II（nptII），抗代謝物（選擇劑）為卡那霉素（Kanr）、新霉素（Neor）、氨基葡萄糖苷（Aphr）。

編碼除草劑的抗性基因：PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Pat），又稱bar基因，編碼PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶，抗草丁膦、雙丙氨膦。

第55頁,共90頁，星期六，2024年，5月

常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。否則，如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會(huì)出現(xiàn)成千上萬的細(xì)菌菌落，將難以確認(rèn)哪一個(gè)克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。第56頁,共90頁，星期六，2024年，5月二、報(bào)告基因：

植物基因工程中，常采用另一類標(biāo)記基因來檢測轉(zhuǎn)化的目的基因是否在受體植物細(xì)胞組織中得到表達(dá)，給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識(shí)別作用，故稱報(bào)告基因。理想的植物報(bào)告基因應(yīng)具備以下特征：A.編碼的產(chǎn)物是唯一的，并對(duì)宿主植物細(xì)胞無毒性B.表達(dá)產(chǎn)物及產(chǎn)物的類似功能在未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞

內(nèi)不存在C.產(chǎn)物表達(dá)水平穩(wěn)定D.便于檢測第57頁,共90頁，星期六，2024年，5月

冠癭堿基因（nos、ocs）Gus基因(β-葡糖苷酸酶基因)Cat(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)(GFP)綠色熒光蛋白基因第58頁,共90頁，星期六，2024年，5月報(bào)告基因:

Gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因）Gus基因是一種報(bào)告基因。報(bào)告基因系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定的一類基因，常用來檢測轉(zhuǎn)基因的瞬間表達(dá)。

Gus基因來源于細(xì)菌，其功能是編碼β–葡萄糖苷酸酶(β–glucuronidase，GUS)，該酶能催化許多β–葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。絕大多數(shù)的植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUS活性，因而Gus基因被廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物的報(bào)告基因。用于GUS檢測的常用底物有三種：5–溴–4–氯–3–吲哚–β–D葡萄糖苷酸酯(X–Gluc)4–甲基傘形酮酰–β–D–葡萄糖醛酸苷酯(4–MUG)

對(duì)硝基苯β–D–葡萄糖醛酸苷(PNPG)

第59頁,共90頁，星期六，2024年，5月β–葡萄糖苷酸酶(GUS)檢測上具有以下特點(diǎn)：①GUS與X-Gluc底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，既可以用分光光度計(jì)法測定，又可以直接觀察到植物組織中形成的藍(lán)色斑點(diǎn)。②當(dāng)加入4–MUG及PNPG，發(fā)黃色熒光，用熒光光譜法測定（λ=465nm）。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測極為靈敏。第60頁,共90頁，星期六，2024年，5月β–葡萄糖苷酸酶(GUS)檢測上具有以下特點(diǎn)：③檢測容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時(shí)間內(nèi)測定完畢。④價(jià)格便宜。第61頁,共90頁，星期六，2024年，5月GFP（綠色熒光蛋白基因）

LUC（螢火蟲熒光素酶基因）報(bào)告基因:第62頁,共90頁，星期六，2024年，5月三.外源基因整合的分子檢測PCR檢測利用PCR擴(kuò)增檢測外源基因整合時(shí)，要以被檢組織DNA為模板，以外源基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。若被檢植株基因組DNA中含有外源基因，則可得到擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖膠上就會(huì)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增的條帶。非轉(zhuǎn)化植株基因組DNA中不含有外源基因，則無特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。

注意：PCR擴(kuò)增可以擴(kuò)增選擇標(biāo)記基因，也可擴(kuò)增目的基因。標(biāo)記基因的存在并不能完全代表目的基因的存在第63頁,共90頁，星期六，2024年，5月

◆PCR反應(yīng)包括三個(gè)步驟：

●變性：在94-95℃使模板DNA的雙鏈變性成單鏈。

●復(fù)性：兩個(gè)引物分別與單鏈DNA互補(bǔ)復(fù)性，復(fù)性的溫度在50-60℃

●延伸：在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互補(bǔ)鏈

◆

這三個(gè)步驟稱為一個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)常有25-35個(gè)循環(huán)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是體外快速擴(kuò)增DNA的方法第64頁,共90頁，星期六，2024年，5月

PCR產(chǎn)物可以通過電泳檢測瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳第65頁,共90頁，星期六，2024年，5月66特異性PCR檢測外源基因整合到受體第66頁,共90頁，星期六，2024年，5月轉(zhuǎn)基因棉花選擇標(biāo)記基因NPTII編碼區(qū)段的PCR擴(kuò)增結(jié)果（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，C為非轉(zhuǎn)基因植株，P為質(zhì)粒對(duì)照，1-20為轉(zhuǎn)基因植株）第67頁,共90頁，星期六，2024年，5月Southern雜交Northern雜交細(xì)胞原位雜交常用的轉(zhuǎn)基因生物分子檢測手段有四、核酸分子雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因第68頁,共90頁，星期六，2024年，5月轉(zhuǎn)基因植物鑒定所涉及的核酸分子雜交有:Southern雜交是以已知DNA或RNA為探針，檢測目標(biāo)DNA的存在，用于外源目的基因整合的鑒定及分析。Northern雜交是以已知DNA或RNA為探針，檢測特異的mRNA分子的存在，用于外源目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）的檢測。細(xì)胞原位雜交是一項(xiàng)組織化學(xué)與分子雜交相結(jié)合的技術(shù)，用來檢測組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)DNA或RNA分子存在位置，采用這一技術(shù)可以確定整合有外源基因的染色體及外源基因在染色體上的位置。另一類似的技術(shù)是Western蛋白質(zhì)雜交，它是利用抗原與抗體特異結(jié)合的原理檢測外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異蛋白的生成。第69頁,共90頁，星期六，2024年，5月70核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交：是指一條單鏈核酸分子（DNA或RNA）通過堿基互補(bǔ)與另一條單鏈核酸分子形成穩(wěn)定雙鏈的過程。

基本原理：堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性

DNA與DNA雜交：A=T、G≡C;DNA與RNA雜交:A=U、G≡C;

變性：

升高溫度至94℃左右，使核酸雙鏈解開為兩條單鏈；

復(fù)性：

緩慢降低溫度（52℃左右），變性的兩條單鏈重新形成

互補(bǔ)雙鏈。

堿基互補(bǔ):第70頁,共90頁，星期六，2024年，5月1.Southern雜交(Southernblotting)◆將DNA用限制性酶酶切→酶切DNA電泳→變性→轉(zhuǎn)移到膜上→經(jīng)過標(biāo)記的DNA探針與膜上的DNA片段雜交→洗去膜上非特異性結(jié)合的探針→檢測雜交信號(hào)?！羧绻D(zhuǎn)移的膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，就會(huì)檢測到雜交帶信號(hào)。

此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測對(duì)象為DNA。第71頁,共90頁，星期六，2024年，5月帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程第72頁,共90頁，星期六，2024年，5月73Southern雜交進(jìn)行基因診斷第73頁,共90頁，星期六，2024年，5月M123456789kb23.1-9.4-6.6-4.4-2.3-2.0-轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為陽性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，3-8為轉(zhuǎn)基因植株）第74頁,共90