T-SHAAV 022-2024 飼料添加劑 蛋清溶菌酶寡聚體T-SHAAV 022-2024 飼料添加劑 蛋清溶菌酶寡聚體

ICS65.120CCSB20T/SHAAV團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SHAAV022—2024飼料添加劑蛋清溶菌酶寡聚體FeedadditivesEggwhitelysozymeoligomer2024-04-10發(fā)布2024-04-10實(shí)施上海市畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布T/SHAAV0222024前言本文件按照GB/T1.12020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由上海市畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位:上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、上海艾魁英生物科技有限公司、上海新農(nóng)科技股份有限公司。本文件主要起草人:顧欣、張好、商軍、姜芹、孫冰清、張亦菲、黃士新、曹瑩、吳雨珊、張浩然、張文剛、嚴(yán)鳳、黃家鶯、吳劍平、張婧、徐汀、陶玉潔、華賢輝、田愷、方雅紅、黃易明、黃潤超、劉翠、尹翠鳳、王聽蕾、陳英杰。本文件首批承諾執(zhí)行單位名單:上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、上海艾魁英生物科技有限公司、成都禮頓農(nóng)牧科技有限公司、上海華易動(dòng)物保健品有限公司、佛山市正典生物技術(shù)有限公司、上海新農(nóng)科技股份有限公司。lT/SHAAV0222024飼料添加劑蛋清溶菌酶寡聚體本文件規(guī)定了飼料添加劑蛋清溶菌酶寡聚體的技術(shù)要求、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)簽、包裝、運(yùn)輸、貯藏和保質(zhì)期,描述了試驗(yàn)方法。本文件適用于以蛋清溶菌酶為原料,經(jīng)聚合反應(yīng)而得的飼料添加劑蛋清溶菌酶寡聚體。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6435飼料中水分的測(cè)定GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB10648飼料標(biāo)簽GB/T13079飼料中總砷的測(cè)定GBT13080飼料中鉛的測(cè)定原子吸收光譜法GB/T13082飼料中鎘的測(cè)定GB/T13091飼料中沙門氏菌的測(cè)定GB/T14699飼料采樣GB/T17480飼料中黃曲霉毒素B,的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。蛋清溶菌酶寡聚體eggwhitelysozymEOligoMEr以蛋清溶菌酶單體為原料,使用蛋白質(zhì)交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)后產(chǎn)生寡聚體,其含有蛋清溶菌酶二聚體、三聚體、四聚體和蛋清溶菌酶單體。3.2酶活力單位theactiveunit在25℃和PH6.2的條件下,使藤黃微球菌懸濁液在450nm處每分鐘引起吸光度下降0.001所需蛋清溶菌酶的量為一個(gè)蛋清溶菌酶活力單位(U)。T/SHAAV02220244技術(shù)要求4.1外觀與性狀微黃色顆粒狀物,流散性好,無發(fā)霉,無變質(zhì),無異味,無異嗅。4.2技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合表1的要求。表1技術(shù)指標(biāo)項(xiàng)日指標(biāo)蛋溶酶寡聚體酶活力/(u/mg)≥500蛋清溶菌酶二聚體(占比)/(%)≥30蛋清溶菌酶二聚體(占比)/(%)≥20蛋清溶菌酶聚體(占比)/(%)≥蛋清溶菌酶單體(占比)/(%)≤水分/(%)≤總砷/(mg/kg)≤鉛(以pb計(jì))/(mg/kg)≤鎘(以cd計(jì))/(mg/kg)≤黃曲毒素B1/(ug/kg)≤沙門氏菌/(25g樣品中)不檢出注:占比指各組分占蛋清溶菌酶寡聚體總蛋白質(zhì)量的百分比。5采樣按GB/T14699的規(guī)定執(zhí)行。6試驗(yàn)方法6.1外觀與性狀取適量試樣置于清潔干燥的白色瓷盤中,在自然光下觀察其色澤和性狀。6.2蛋清溶菌酶寡聚體酶活力按附錄A的規(guī)定執(zhí)行。6.3蛋清溶菌酶二聚體、三聚體、四聚體和單體占比按附錄B的規(guī)定執(zhí)行。6.4水分按GB,/T6435的規(guī)定執(zhí)行。2T/SHAAV02220246.5總砷按GB/T13079的規(guī)定執(zhí)行。6.6鉛按GB/Tl3080的規(guī)定執(zhí)行。6.7鎘按GB,/T13082的規(guī)定執(zhí)行。6.8黃曲霉毒素B1按GB,/T17480的規(guī)定執(zhí)行。6.9沙門氏菌按GB,/'T13091的規(guī)定執(zhí)行。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1組批以相同材料、相同生產(chǎn)工藝、連續(xù)生產(chǎn)或同一班次生產(chǎn)的同一規(guī)格的產(chǎn)品為一批,每批產(chǎn)品不得超過1000kg。7.2出廠檢驗(yàn)出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目為外觀與性狀、水分、蛋清溶菌酶寡聚體酶活力、蛋清溶菌酶二聚體、三聚體、四聚體和蛋清溶菌酶單體占比,每批出廠產(chǎn)品應(yīng)附有質(zhì)量檢驗(yàn)合格證(章)和使用說明。型式檢驗(yàn)項(xiàng)目為第4章的全部要求。產(chǎn)品正常生產(chǎn)時(shí),每半年至少進(jìn)行1次型式檢驗(yàn)。但有下列情況之一時(shí),亦應(yīng)進(jìn)行型式檢驗(yàn):a)產(chǎn)品定型投產(chǎn)時(shí);b)生產(chǎn)工藝、配方或主要原料來源有較大改變,可能影響產(chǎn)品質(zhì)量時(shí);C)停產(chǎn)3個(gè)月以上,重新恢復(fù)生產(chǎn)時(shí);d)出廠檢驗(yàn)結(jié)果與上次型式檢驗(yàn)結(jié)果有較大差異時(shí);e)飼料行政管理部門提出檢驗(yàn)要求時(shí)。7.4判定規(guī)則7.4.1所檢項(xiàng)目全部合格,則判定該批次產(chǎn)品合格。7.4.2檢驗(yàn)結(jié)果中有任意一項(xiàng)指標(biāo)不符合規(guī)定時(shí),可自同批次產(chǎn)品中重新加倍取樣復(fù)檢,若復(fù)檢有一項(xiàng)結(jié)果不符合規(guī)定,則判定該批次產(chǎn)品不合格。微生物指標(biāo)不得復(fù)檢。3T/SHAAV02220247.4.3數(shù)值修約按GB/T8170規(guī)定執(zhí)行。8標(biāo)簽、包裝、運(yùn)輸、貯存和保質(zhì)期按GB10648的規(guī)定執(zhí)行。8.2包裝包裝材料應(yīng)采用無毒、無害,對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量無影響的材料。運(yùn)輸過程應(yīng)防止包裝破損、日曬、雨淋,禁止與有毒有害物質(zhì)或強(qiáng)堿性、含碘物質(zhì)混裝混運(yùn)。8.4貯存貯存時(shí)倉庫應(yīng)通風(fēng)、干燥、能防暴曬、防雨淋,有防蟲、防鼠設(shè)施,不得與有毒有害的物質(zhì)混儲(chǔ)。8.5保質(zhì)期未開啟包裝的產(chǎn)品,在規(guī)定的運(yùn)輸、貯存條件下,自生產(chǎn)之日起保質(zhì)期為12個(gè)月。4T/SHAAV0222024附錄A(規(guī)范性)蛋清溶菌酶寡聚體酶活力測(cè)定方法A.1方法原理蛋清溶菌酶寡聚體可水解細(xì)菌的細(xì)胞壁,引起藤黃微球菌懸濁液的吸光值下降,根據(jù)25℃和PH6.2條件下,450nm處藤黃微球菌懸濁液下降的吸光值,從而計(jì)算出蛋清溶菌酶寡聚體酶活力。A.2儀器和設(shè)備A.2.1天平:精度為0.00018精度為0.1goA.2.2磁力攪拌器:攪拌轉(zhuǎn)速50r/Min1500r/MinoA.2.3細(xì)胞研磨器:5mL。A.2.4可見分光光度計(jì):精確度±0.001。A.2.5恒溫培養(yǎng)箱:37℃±1℃。A.2.6PH計(jì):精確度40.1。A.3試劑和材料本方法所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中二級(jí)水的要求。A.3.2.1檸檬酸一水合物(CH807·H20).A.3.2.2檸檬酸三鈉二水合物(C6H5Na307·2H20)。A.3.2.3磷酸二氫鈉二水合物(NaH2P04·2H20)。A.3.2.4磷酸氫二鈉十二水合物(Na2HPO,:12H20)。A.3.2.5乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)。A.3.2.6藤黃微球菌粉:ATCC4698aA.3.3溶液配制A.3.3.1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1mol/L,PH6.6):稱取4.20g檸檬酸一水合物,加水定容至200ML,制成檸檬酸溶液;稱取5.88g檸檬酸三鈉二水合物,加水定容至200mL,制成的檸檬酸鈉溶液。取14mL檸檬酸溶液與186mL檸檬酸鈉溶液混合,混勻。5T/SHAAV0222024A.3.3.2磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L,PH6.2):稱取11.70g磷酸二氫鈉二水合物、7.86g磷酸氫二鈉十二水合物及0.372g乙二胺四乙酸二鈉,加水定容至1000mL。緩沖溶液PH為6.2±0.1。A.3.3.3底物溶液:藤黃微球菌用細(xì)胞研磨器研磨,用磷酸鹽緩沖液制備50mL藤黃微球菌懸濁液,使用前,將菌懸液于37℃培養(yǎng)30min,2h內(nèi)使用。以磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)分光光度計(jì)零點(diǎn),調(diào)節(jié)底物濃度,使其450nm處的讀數(shù)為0.70±0.10A.4試樣制備及測(cè)定A.4.1試樣溶液制備平行做兩份試驗(yàn)。稱取樣品120Mg(精密至1Mg),置于250ML燒杯中,加入100ML檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液,磁力攪拌約4h溶解,即得。A.4.2試樣測(cè)定于(25±1)℃室溫下,以磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)分光光度計(jì)零點(diǎn)。精確量取2.9mL底物溶液(450nm處吸光度為0.70so.10)于1cm比色皿,3min之內(nèi)吸光度值變化≤0.003時(shí),開始測(cè)定。精確量取0.1mL試樣溶液加入底物溶液,充分混合,記錄3min內(nèi)吸光度值的變化,每1Min記錄一次吸光度值。每分鐘吸光度值變化應(yīng)在0.030~0.080。如不在要求范圍,需調(diào)整試樣溶液的濃度,重復(fù)操作測(cè)定試樣溶液。A.5結(jié)果計(jì)算試樣中蛋清溶菌酶寡聚體酶活力X以活力單位每毫克(U/mg)表示,按公式(A.1)計(jì)算:式中:Ai試樣在450nM處反應(yīng)第1Min時(shí)的吸光值;A2試樣在450nm處反應(yīng)第3min時(shí)的吸光值;t數(shù)值為2,即獲得第1Min和第3min吸光度讀數(shù)所用的時(shí)間,單位為分鐘(min);m0.1mL試樣溶液中含有的蛋清溶菌酶寡聚體質(zhì)量,單位為毫克(mg);0.o0l由單位蛋清溶菌酶寡聚體每分鐘引起吸光度降低的值。所得結(jié)果表示至小數(shù)點(diǎn)后一位。A.6精密度在重復(fù)條件下,兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。T/SHAAV0222024附錄B(規(guī)范性)蛋清溶菌酶寡聚體測(cè)定方法使用SDS法(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳),試樣經(jīng)電泳后,用全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋清溶菌酶寡聚體進(jìn)行組分分析,從而計(jì)算出蛋清溶菌酶寡聚體中各組分占總蛋白質(zhì)量的百分比。B.2儀器設(shè)備B.2.1全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)。B.2.2天平:精度為0.0001g、精度為0.1g。B.2.3磁力攪拌器:攪拌轉(zhuǎn)速50r/min1500r/min.B.2.4離心機(jī):不低于18000r/minoB.2.6電泳槽:73mmx83mm。B.2.7移液器:1000u1;1001;20uL。B.3試劑和材料除另有說明。本方法所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中二級(jí)水的要求,SDS蛋白凝膠按表B.1配制,凝膠染色、脫色試劑按B3.3配制或用商品化產(chǎn)品。B3.2.1檸檬酸一水合物(CH807·H20)。B3.2.2檸檬酸三鈉二水合物(C6H5Na307·2H20)。B3.2.3氯化鈉(Nacl)。B3.2.4氫氧化鈉(NaoH)。B3.2.5三氯乙酸(C2HC302)。B3.2.6乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)。B3.2.7鹽酸(HC1)。7T/SHAAV0222024B3.2.8丙酮(C3H:0)B3.2.9冰醋酸(C2H,02H)。B3.2.10磷酸(H3P04)。B3.2.11硫酸銨{(NH1)2SO]。B3.2.12過硫酸銨{(NH4)2S208}。B3.2.13甲醇(CH30H)。B3.2.14乙醇(C:H50H)。B3.2.15丙三醇(C3H803)。B3.2.16甘氨酸(C2H5NO3)。B3.2.17三羥甲基氨基甲烷(C4HiiNO3):生化級(jí)。B3.2.18β-硫基乙醇(C2H:0S):生化級(jí)。B3.2.19丙烯酰胺(C3H5NO)。B3.2.20N-N'-亞甲基雙丙烯酰胺(C7HioN202):生化級(jí)。B3.2.21十二烷基磺酸鈉(C2H25S03Na):生化級(jí)。B3.2.22N,N,N,N'-四甲基乙二胺(CHiN2):生化級(jí)。B3.2.23溴酚藍(lán)(CHOBr105S)。B3.2.24考馬斯亮藍(lán)R-250。B3.2.25蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物:14.4KDa~97.4KDaoB.3.3溶液配制B3.3.1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1mo1/L,PH6.6):稱取4.20g檸檬酸一水合物,加水定容至200ML,制成檸檬酸溶液;稱取5.88g檸檬酸三鈉二水合物,加水定容至200ML,制成檸檬酸鈉溶液。取14mL檸檬酸溶液與186ML檸檬酸鈉溶液混合,混勻。B3.3.2氯化鈉溶液(3mo1/L):稱取17.55g氯化鈉,加水定容至100mL,搖勻。B3.3.3氫氧化鈉溶液(10Mol/L):稱取40g氫氧化鈉,溶解于少量水中,轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中,加水定容至刻度,搖勻。B3.3.4三氯乙酸溶液(PH4.0):稱取500g三氯乙酸,加227Ml水,充分溶解,取30ml,加水定容至100ML,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至4.0。B3.3.5乙二胺四乙酸二鈉溶液(0.5mo1/L):稱取18.61g乙二胺四乙酸二鈉,加80mL水,充分?jǐn)嚢?加熱溶解,待冷卻至室溫,加水定容至100mL。8T/SHAAV0222024B3.3.6鹽酸溶液(4MO1/L):取36mL濃鹽酸注入50mL水中,轉(zhuǎn)移至100ML容量瓶中,加水定容至刻度,混勻。B3.3.7丙烯酰胺單體貯備液:稱取14.55g丙烯酰胺、0.45gN-N'-亞甲基雙丙烯酰胺,加40ML水溶解,攪拌,直至溶液變澄清透明,加水稀釋至50mL,過濾。該貯備液在4℃下棕色瓶中可保存一個(gè)月。B3.3.8濃縮膠緩沖液貯備液(1MO1/L,PH6.8):稱取6.06g三羥甲基氨基甲烷,加40Ml水溶解,用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH至6.8,加水定容至50ML。B3.3.9分離膠緩沖液貯備液(1.5mol/L,PH8.8):稱取9.08g三羥甲基氨基甲烷,加40mL水溶解,用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH至8.8,加水定容至50ML。B3.3.10過硫酸銨溶液(100g/L):稱取100Mg過硫酸銨,加lmL水溶解,臨用現(xiàn)配。B3.3.11十二烷基磺酸鈉溶液(100g/L):稱取1.00g十二烷基磺酸鈉,加10mL水溶解。B3.3.12樣品緩沖液(0.08mol/L):精確稱取20ng溴酚藍(lán),加25ml水溶解。分別量取8ml濃縮膠緩沖液貯備液、20mL十二烷基磺酸鈉溶液、6mLβ-巰基乙醇、11ML丙三醇,混勻。加水定容至l0omL。B3.3.135x電極緩沖液:稱取15.10g三羥甲基氨基甲烷、94.00g甘氨酸和5.00g十二烷基磺酸鈉,加水定容至1000mL,臨用前用水稀釋5倍使用。B3.3.14考馬斯亮藍(lán)染色液(2.5g/L):稱取0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250和10.00g硫酸銨,加入20ML乙醇、10ML磷酸,溶解混勻,加水定容至100ML。B3.3.15脫色液:分別量取50ml冰醋酸、250mL甲醇、200mL水,混勻。B.4分析步驟B.4.1試樣制備稱取樣品120mg(精密至1mg),加30ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(PH6.6)及3mLEDTA-2Na溶液,磁力攪拌4h至完全溶解。加15ml氯化鈉溶液,磁力攪拌30min,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至11.8。離心60min(>18000r/Min),棄清液,加1mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(PH6.6)溶解沉淀30min,充分振蕩,轉(zhuǎn)移至2ML離心管,加1mL三氯乙酸(PH4.0),充分振蕩,離心10min(>18000r/min),棄清液,加1ML丙酮洗滌,離心5min(>18000r/min),棄清液。重復(fù)丙酮洗滌一次,置通風(fēng)柜內(nèi)自然揮發(fā)至干。加入100L樣品緩沖液,充分吹洗溶解,沸水煮1min,5000r/min離心1Min,備用。B.4.2分離膠制備按表B.1配制15%分離膠20ml,混勻后加入長、短玻璃板間的縫隙內(nèi),約60mm~