優(yōu)良食味半糯粳稻品質(zhì)

優(yōu)良食味半糯粳稻品質(zhì)范圍本文件規(guī)定了優(yōu)良食味半糯粳稻品質(zhì)的術(shù)語(yǔ)和定義、質(zhì)量要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則及判定規(guī)則。本文件適用于半糯粳稻品種的選育、鑒定、評(píng)價(jià)和推廣，適用于商品半糯粳稻的收購(gòu)、加工和銷售。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB1350稻谷GB/T1354大米GB/T5490糧食檢驗(yàn)一般規(guī)則GB/T5491糧食、油料檢驗(yàn)扦樣、分樣法GB/T15682糧油檢驗(yàn)稻谷、大米蒸煮食用品質(zhì)感官評(píng)價(jià)方法GB/T17891—2017優(yōu)質(zhì)稻谷GB/T21719稻谷整精米率檢驗(yàn)法GB/T22294糧油檢驗(yàn)大米膠稠度的測(cè)定NY/T83米質(zhì)測(cè)定方法NY/T593食用稻品種品質(zhì)NY/T2639稻米直鏈淀粉的測(cè)定分光光度法術(shù)語(yǔ)和定義GB1350、GB/T1354、GB/T17891和NY/T593界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1半糯粳稻semi-glutinousjaponicarice稻米直鏈淀粉含量在2%~13%之間，含有低直鏈淀粉含量的Wx等位基因（如Wxmp、Wxmq、Wxmw等）的粳稻。3.2優(yōu)良食味半糯粳稻semi-glutinousjaponicaricewithgoodtaste品質(zhì)達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)4規(guī)定的質(zhì)量要求、品質(zhì)等級(jí)三級(jí)及以上的半糯粳稻。3.3鑒別標(biāo)記identificationmolecularmarker用于鑒別低直鏈淀粉含量基因（如Wxmp、Wxmq、Wxmw等）、經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的特征性條帶或序列，詳見附錄A。4質(zhì)量要求4.1基本質(zhì)量要求雜質(zhì)含量、水分含量、黃粒米含量、谷外糙米含量、色澤氣味等基本質(zhì)量指標(biāo)應(yīng)符合GB1350粳稻谷要求，不完善粒含量應(yīng)≤3%，異品種率應(yīng)≤2%。4.2定等質(zhì)量指標(biāo)在符合GB1350的基礎(chǔ)上，優(yōu)良食味半糯粳稻的定等質(zhì)量指標(biāo)見表1。表1優(yōu)良食味半糯粳稻品質(zhì)等級(jí)指標(biāo)等級(jí)一二三整精米率/%≥67.061.055.0透明度/級(jí)≤123直鏈淀粉（干基）含量/%8.0~13.0膠稠度/mm≥908070食味值/分≥908580注1：等級(jí)評(píng)定須在相同的水分條件下進(jìn)行。5檢驗(yàn)方法5.1低直鏈淀粉含量基因Wxmp、Wxmq、Wxmw的檢驗(yàn)按照附錄A執(zhí)行。5.2不完善粒含量檢驗(yàn)：按GB/T17891—2017，6.5執(zhí)行。5.3異品種率檢驗(yàn)：按照GB/T17891—2017，附錄B執(zhí)行。5.4整精米率檢驗(yàn)：按照GB/T21719執(zhí)行。5.5透明度檢驗(yàn)：按照NY/T83執(zhí)行。5.6直鏈淀粉（干基）含量檢驗(yàn)：按照NY/T2639執(zhí)行。5.7膠稠度檢驗(yàn)：按照GB/T22294執(zhí)行。5.8食味值檢驗(yàn)：按照GB/T15682執(zhí)行。6檢驗(yàn)規(guī)則6.1扦樣、分樣按照GB/T5491執(zhí)行。6.2檢驗(yàn)的一般規(guī)則按照GB/T5490執(zhí)行。7判定規(guī)則7.1類型判定含有低直鏈淀粉含量基因（如Wxmp、Wxmq、Wxmw等）的，判定為半糯粳稻。7.2等級(jí)判定達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)4.1規(guī)定的基本質(zhì)量要求，表1中5項(xiàng)定級(jí)指標(biāo)全部達(dá)到該等級(jí)要求的，則判定為該等級(jí)半糯粳稻。5項(xiàng)定級(jí)指標(biāo)中有1項(xiàng)達(dá)不到該等級(jí)質(zhì)量要求的，逐級(jí)降至符合的等級(jí)；不符合最低等級(jí)指標(biāo)要求的，為非等級(jí)產(chǎn)品?；举|(zhì)量要求有1項(xiàng)及以上不符合的，為非等級(jí)產(chǎn)品。7.3等級(jí)分類品質(zhì)等級(jí)達(dá)三級(jí)及以上的判定為優(yōu)良食味半糯粳稻，低于三級(jí)的判定為普通半糯粳稻。附錄A（規(guī)范性）低直鏈淀粉含量基因Wxmp、Wxmq和Wxmw分子標(biāo)記檢測(cè)方法A.1原理低直鏈淀粉含量突變基因Wxmp、Wxmq和Wxmw是在Wxb基因的第4、第5和第6外顯子發(fā)生了單堿基突變（圖A.1）。僅在第4外顯子第53位堿基發(fā)生G-A突變的為Wxmp基因，同時(shí)在第4外顯子第53位堿基發(fā)生G-A突變和第5外顯子第52位堿基發(fā)生T-C突變的為Wxmq基因，僅在第6外顯子第62位堿基發(fā)生A/C突變的為Wxmw基因。利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)可針對(duì)第4和第6外顯子的變異位點(diǎn)進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)；利用成對(duì)引物可針對(duì)第5外顯子的變異位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，根據(jù)突變位點(diǎn)的有無(wú)和類型，來(lái)判斷是否含有突變基因Wxmp、Wxmq和Wxmw。圖A.1Wx基因的結(jié)構(gòu)及Wxmp、Wxmq和Wxmp基因突變位點(diǎn)示意圖A.2儀器設(shè)備高速冷凍離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、超純水系統(tǒng)、組織研磨儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)及制膠附件、凝膠成像系統(tǒng)、微量可調(diào)移液器（2uL、10uL、100uL、1000uL）。A.3試劑與溶液A.3.1DNA提取試劑十六烷基三甲基溴化銨、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉。A.3.2PCR擴(kuò)增試劑DNA、引物、dNTP、Taq酶、10×PCR緩沖液、超純水。A.3.3電泳試劑6×上樣緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、1×TAE電泳緩沖液、核酸染料。A.3.4DNA回收試劑凝膠回收試劑盒。A.4DNA提取稻谷出苗后在三葉期按單株取水稻葉片，提取基因組DNA。DNA提取方法及試劑配制方法按NT/T1433執(zhí)行。A.5分子標(biāo)記序列A.5.1用于鑒定Wxmq或Wxmp的分子標(biāo)記序列利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)可對(duì)Wxmq或Wxmp第4外顯子第53位堿基發(fā)生的G-A突變進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，四引物序列為：正向外引物（Wxmq/Wxmp-O-F）序列為5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'，反向外引物（Wxmq/Wxmp-O-R）序列為5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'，正向內(nèi)引物（Wxmq/Wxmp-I-F）序列為5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'，反向內(nèi)引物（Wxmq/Wxmp-I-R）序列為5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'。利用成對(duì)引物PCR擴(kuò)增法可對(duì)Wxmq第5外顯子第52位堿基發(fā)生的T-C突變進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，成對(duì)引物序列為：正向引物（Wxmq-F）序列為5'-GGCTTCACGCAACGGCGCTACAAATAG-3'，反向引物（Wxmq-R）序列為5'-CCATTCGCCTGCAAAGAACACAAGAAC-3'。A.5.2用于鑒定Wxmw的分子標(biāo)記序列利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)可對(duì)Wxmw第6外顯子第62位堿基發(fā)生的A/C突變進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，四引物序列為：正向外引物（Wxmw-O-F）序列為5'-GCTTAGCTTCCACTGGTGATTTCA-3'，反向外引物（Wxmw-O-R）序列為5'-GTAGATGCCATTGGGCTGGTAGT-3'，正向內(nèi)引物（Wxmw-I-F）序列為5'-AACAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3'，反向內(nèi)引物（Wxmw-I-R）序列為5'-TCTTGAGATCAATTGTAACTCCCCAT-3'。A.6PCR反應(yīng)體系20μLPCR反應(yīng)體系，包括2.0μL樣品DNA(10ng/μL)，2.0μL引物等摩爾混合液(4pmol/μL/每條)，2.0μL10×PCR緩沖液(含MgCl2)，0.4μLdNTP(2.5mmol/L)，0.5μLTaq酶(5U/μL)，13.1μL超純水。A.7PCR反應(yīng)程序A.7.1Wxmq或Wxmp第4外顯子分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序95℃下預(yù)變性3min；95℃下變性30s，65℃退火30s，72℃下延伸1min，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（熱循環(huán)儀）上進(jìn)行。A.7.2Wxmq第5外顯子分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序95℃下預(yù)變性3min；95℃下變性30s，58℃退火30s，72℃下延伸2min，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（熱循環(huán)儀）上進(jìn)行。A.7.3Wxmw分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序95℃下預(yù)變性3min；95℃下變性30s，55℃退火30s，72℃下延伸1min，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（熱循環(huán)儀）上進(jìn)行。A.8PCR產(chǎn)物檢測(cè)A.8.1瓊脂糖凝膠制備在三角瓶中將瓊脂糖與1×TAE緩沖液按1.5%質(zhì)量比混合，煮沸至瓊脂糖顆粒完全溶解，按1：10000（體積比）加入核酸染料，搖勻后倒入制膠槽托盤板上，插上樣品梳，冷卻凝固后拔出樣品梳，備用。A.8.2上樣樣品制備在20uL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4uL6×上樣緩沖液，混勻。A.8.3電泳將瓊脂糖凝膠放入電泳槽，加入1×TAE緩沖液至剛沒(méi)過(guò)凝膠，每個(gè)樣品孔加入5uL上樣樣品，以20V/cm的電壓進(jìn)行電泳，電泳20min。A.8.4凝膠成像將電泳后的瓊脂糖凝膠放于凝膠成像系統(tǒng)的紫外光源下進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物觀察，拍照備用。用成對(duì)引物Wxmq-F/R擴(kuò)增得到的PCR條帶需割膠回收、回收試劑盒純化后，送測(cè)序公司進(jìn)行序列分析。A.9結(jié)果分析A.9.1分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果分析利用四引物Wxmq/Wxmp-O-F/O-R/I-F/I-R分子標(biāo)記可擴(kuò)增得到三種類型的DNA特征條帶（圖A.2），擴(kuò)增得到439bp和292bpDNA條帶的樣品，證明含第4外顯子突變位點(diǎn)；擴(kuò)增得到439bp和200bpDNA條帶的樣品，證明不含此突變位點(diǎn)，同時(shí)擴(kuò)增得到439bp、292bp和200bpDNA條帶的樣品，證明此突變位點(diǎn)為雜合位點(diǎn)。利用成對(duì)引物Wxmq-F/R分別作為測(cè)序引物，可獲得DNA條帶的核苷酸序列（圖A.3），如第5外顯子第52位為C堿基，證明含此突變位點(diǎn)，如為T堿基，證明不含此突變位點(diǎn)，如為T/C堿基疊加，證明此突變位點(diǎn)為雜合位點(diǎn)。利用四引物Wxmw-O-F/O-R/I-F/I-R可擴(kuò)增得到三種類型的DNA特征條帶（圖A.4）：擴(kuò)增得到459bp和301bpDNA條帶的樣品，證明含Wxmw突變位點(diǎn)；擴(kuò)增得到459bp和209bpDNA條帶的樣品，證明不含此突變位點(diǎn)，同時(shí)擴(kuò)增得到459bp、301bp和209bpDNA條帶的樣品，證明此突變位點(diǎn)為雜合位點(diǎn)。（M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1,7-10為含第4外顯子突變位點(diǎn)的特征條帶，2-6為不含第4外顯子突變位點(diǎn)的特征條帶，11-12為雜合位點(diǎn)的特征條帶）圖A.2Wxmp或Wxmq第4外顯子突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記檢測(cè)電泳圖譜（2,4為含第5外顯子突變位點(diǎn)的特征序列，1,3,5-10為不含第5外顯子突變位點(diǎn)的特征序列，11-12為雜合位點(diǎn)的特征序列）圖A.3Wxmq第5外顯子突變位點(diǎn)的核苷酸序列分析（M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1,4,8,9為含第5外顯子突變位點(diǎn)的特征條帶，2,6-7為不含第5外顯子突變位點(diǎn)的特征條帶，3,5為雜合位點(diǎn)的特征條帶）圖A.4Wxmw第6外顯子分子標(biāo)記檢測(cè)的電泳圖譜A.9.2判定原則用A.5.1中所述兩種分子標(biāo)記Wxmq/Wxmp-O-F/O-R/I-F/I-R和Wxmq-F/R分別對(duì)第4和第5外顯子突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅可