食源性致病菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件

食源性致病菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

福建省疾病預(yù)防控制中心

二0一二年十一月

一、生物樣本檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

（一）糞便樣本的保存、運(yùn)送和檢測

表1糞便樣本的保存、運(yùn)送和檢測培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基目標(biāo)病原體溫度

細(xì)菌標(biāo)本保1

Cary-Blair所有食源性致病菌室溫

存和運(yùn)送

增菌液1改良磷酸鹽緩沖液小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌4℃

2mEC增菌肉湯EHECO157:H7/STEC37℃

3Preston肉湯彎曲菌微需氧42℃

4SBG增菌液沙門氏菌37℃

53%氯化鈉堿性蛋白陳水弧菌37℃

選擇性分離1Mac平板EPECxSTECxETECx日EC、37℃

平板EAEC、志賀氏菌

2XLD平板志賀氏菌37℃

3mCCD平板彎曲菌微需氧42℃

4耶爾森氏菌選擇性平板小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌25℃

5科瑪嘉O157:H7顯色平板EHECO157:H737℃

6科瑪嘉沙門氏菌顯色平板沙門氏菌37℃

7科瑪嘉弧菌顯色平板弧菌37℃

TCBS平板

病毒標(biāo)本1采便盒輪狀病毒、諾如病毒、札如-20℃以下

病毒、星狀病毒、腺病毒

(二)檢驗(yàn)方法與流程

糞便樣本

塑料盒裝

Cary-blair棉拭子

糞便樣本

?1支1支1支1支1支棉拭子蘸1支棉拭子蘸1支棉拭子蘸

C-B棉拭子C-B棉拭子C-B棉拭子百棉拭「C-B棉拭子3SW取少量樣本取少量樣本取少量樣本

-20℃保存子蘸取少子蘸取少一:

量樣本量樣本

SBG3%氯化鈉mEC肉湯

送省疾控耶爾森

Mac和XLDCIN改良mCCDPreston

檢驗(yàn)Mac分離選擇培養(yǎng)改良PBS

分離分離肉湯增菌V■V

基分離冷增菌

科瑪嘉顯色科瑪嘉顯色培科瑪嘉顯色

培養(yǎng)基養(yǎng)基或TCBS培養(yǎng)基

輪狀病毒

VV

諾如病毒V

札如病毒志賀致瀉耶爾森彎曲菌沙門副溶O157:H7

星狀病毒

腺病毒

(RT-PCR)

鑒定

結(jié)果報告結(jié)果報告，菌株報送省疾控復(fù)核、分型、藥敏

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（三）沙門氏菌和志賀氏菌檢測操作程序

1范圍

本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中沙門氏菌｛Salmonella）和志賀氏菌（Shigella）的檢驗(yàn)方

法。

2檢驗(yàn)程序

沙門氏菌和志賀氏菌檢驗(yàn)程序見圖1。

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圖1沙門氏菌和志賀氏菌檢驗(yàn)程序

3操作步驟

3.1標(biāo)本收集

標(biāo)本包括新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至

Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時采用。

肛拭子收集后應(yīng)當(dāng)目測，需要在拭子上明顯見到糞便。

所采集的標(biāo)本盡快檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)

送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于清潔、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h

內(nèi)送檢。

3.2分離培養(yǎng)

3.2.1直接分離培養(yǎng)

新鮮糞便：無菌拭子采集少量糞便，盡量從可見血或黏液的部位收集；新鮮拭子在XLD

和MAC一區(qū)劃線；以1pL無菌接種環(huán)或接種針劃線分離。在標(biāo)本中再插入一個清潔的無

菌拭子，將拭子放入SBG增菌液。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不可將過

量的標(biāo)本放入SBG增菌液。

肛拭子：操作程序同新鮮糞便。

轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子：輕攪混合標(biāo)本；拭子在XLD和MAC一區(qū)

劃線；以1"無菌接種環(huán)或接種針劃線分離；在標(biāo)本中再插入一個清潔的無菌拭子，將拭

子放入SBG增菌液。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不可將過量的標(biāo)本放入

SBG增菌液。

平板36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h?

3.2.2增菌培養(yǎng)

增菌液于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h,采用上述方法于科瑪嘉沙門氏菌顯色平板上劃

線分離，36七±1℃培養(yǎng)18h?24h。

3.3菌落特征

3.3.1選擇性平板上可疑菌落的特征見表1?

表1沙門氏菌屬和志賀氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊沙門氏菌傷寒沙門氏菌志賀氏菌屬

脂平板（大多數(shù)）

MAC瓊菌落光滑、無色，直

脂徑2mm?3mm

XLD瓊脂菌落呈紅色，直徑2

mm?4mm

科瑪嘉顯紫色或酒紅色紫色或酒紅色

色培養(yǎng)基

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3.4純培養(yǎng)

挑取3個或以上可疑菌落，劃線接種5%羊血瓊脂平板，36匕±1℃培養(yǎng)18h?24h。

3.5初步鑒定

可疑菌落接種TSI瓊脂，賴氨酸脫陵酶培養(yǎng)基、動力-靛基質(zhì)-鳥氨酸瓊脂（M。）、西蒙

氏檸檬酸鹽瓊脂和尿素瓊脂。沙門氏菌屬和志賀氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別見表2。

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表2沙門氏菌屬和志賀氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表

項(xiàng)目沙門氏菌傷寒甲型副傷寒志賀氏菌屬

（大多數(shù)）沙門氏菌沙門氏菌

TSI（斜面）KKKK

TSI（底層）AAAA

TSI（產(chǎn)氣）+-+十

TSI（硫化氫）+少量--

賴氨酸+4---

MIO（動力）+++-

MIO（靛基質(zhì)）---可變

MIO（鳥氨酸）+++痢疾志賀氏菌、福氏志賀

氏菌、鮑氏志賀氏菌：-

宋內(nèi)志賀氏菌：+

檸檬酸鹽（西蒙氏）+——-

尿素----

3.6血清學(xué)鑒定

挑取5%羊血瓊脂平板上的菌落，進(jìn)行沙門氏菌和志賀氏菌的血清學(xué)鑒定，設(shè)鹽水對照。

3.7確定鑒定

刮取5%羊血瓊脂平板上的單個菌落，進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。

4結(jié)果與報告

報告糞便標(biāo)本中檢出沙門氏菌或志賀氏菌。

5菌株的保存和上送

培養(yǎng)物穿刺接種半固體培養(yǎng)基，輕擰管蓋，36℃±1℃培養(yǎng)24h,蓋緊管蓋。如果

需要長期保存菌株，將0.7mL腦心浸液肉湯6h?12h培養(yǎng)物和0.3mL滅菌甘油加入滅

菌菌種管，立即放置-70°C保存。按照方案要求定期上送。

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（四）致瀉大腸埃希氏菌檢測操作程序

1范圍

本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中致瀉大腸埃希氏菌（Diarrheagenic詼的檢

驗(yàn)方法。

2操作步驟

2.1標(biāo)本收集

標(biāo)本包括新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至

Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時采用。

肛拭子收集后應(yīng)當(dāng)目測，需要在拭子上明顯見到糞便。

所采集的標(biāo)本盡快檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)

送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于清潔、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h

內(nèi)送檢。

2.2直接分離培養(yǎng)

新鮮糞便：無菌拭子采集少量糞便，盡量從可見血或黏液的部位收集；新鮮拭子在MAC

一區(qū)劃線；以1PL無菌接種環(huán)或接種針劃線分離。

肛拭子：操作程序同新鮮糞便。

轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子：輕攪混合標(biāo)本；拭子在MAC一區(qū)劃線；

以1PL無菌接種環(huán)或接種針劃線分離。

平板36℃+1℃培養(yǎng)18h?24h。

2.3菌落特征

挑取5個可疑大腸埃希氏菌菌落（粉紅色、突起、光滑、濕潤）直接保存半固體菌種

管；采用PCR檢測特異毒力基因方法鑒別5種致瀉大腸埃希氏菌。

3多重PCR鑒定

3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株一覽表見表3O

表3標(biāo)準(zhǔn)菌株一覽表

菌株名稱標(biāo)準(zhǔn)號來源

EPECCMCC44155中國食品藥品檢定研究院

STEC具有stxl、5加2毒力基因中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所

ETECCMCC44815中國食品藥品檢定研究院

EIECCMCC44825中國食品藥品檢定研究院

EAEC042血清型中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所

大腸埃希氏菌ATCC25922WHO

3.2引物合成

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多重PCR引物序列見表4。

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表4五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因引物序列

片段大小

目標(biāo)菌目標(biāo)基因引物序列

(bp)

EPECsSTECescV-F5'-ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3'544

escV-R5Z-CGTCCCCnTTACAAACTTCATCGC-3Z

EPECbfpB-V5'-GACACCTCAnGCTGAAGTCG-3,910

bfpB-R5'-CCAGAACACCTCCGTTATGC-3'

STEC5'-CGATGTTAGGGTTTGTTACTGTGACAG

stxlA-F244

C?3'

stxlA-R5Z-AATGCCACGCnCCCAGAATTG-3/

stx2A-?5'-GTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAG-3'324

sfx2A-R5Z-AGCGTAAGGCnCTGCTGTGAC-3,

ETEC日t-F5'-GAACAGGAGGHTCTGCGTTAGGTG-3'655

Elt-R5'-CTTTGAATGGCTIIIIII1GGGAGTC-3'

5'-CCTCTTTTAGYCAGACARCTGAATCAS

estla-F157

TTG-3,

5'-CAGGCAGGATTACAACAAAGTTCA

estta-R

CAG3

esttb-F5'-TGTCTTECACCTTTCGCTC-3'171

esttb-R5'-CGGTACAAGCAGGATTACAACAC-3f

ElEC5'-CGATCAAGAATCCCTAACAGAAGAATC

invE-F766

AC-3'

5,-CGATAGATGGCGAGAAATTATATC

invE-R

CCG3

EAECastA-V5'-TGCCATCAACACAGTATATCCG-3Z102

QSM-R5'-ACGGCTHGTAGTCCTTCCAT-3"

aggR-F5'-ACGCAGAGTTGCCTGATAAAG-3'400

aggR-R5'-AATACAGAATCGTCAGCATCAGC-3'

Pic-F5'-AAATGTCAGTGAACCGACGATTGG-3"1111

Pic-R5Z-AGCCGTnCCGCAGAAGCC-3Z

通用5'-AAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAA

uidA-F1487

GTG-3z

uidA-R5'-ATGCCAGTCCAGCGTETGCS

3.3標(biāo)本處理

刮取營養(yǎng)平板上的過夜新鮮培養(yǎng)物1環(huán)?2環(huán)，至裝有1mL0.85%滅菌生理鹽水的

Eppendorf管內(nèi)，混勻。4℃~8℃,12000r/min離心15min,棄去上清。沉淀加入

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100pL滅菌去離子水中，混勻。100℃煮沸12min,12000r/min離心5min,上清即為

PCR擴(kuò)增模板，可直接用于PCR反應(yīng)。

3.4多重PCR

五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重PCR擴(kuò)增加樣體系見表5。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變

性94℃5min。變性94℃30s,復(fù)性63℃30s,延伸72℃1.5min,30個循環(huán)。

最后72℃延伸5min。

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表5五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重PCR擴(kuò)增加樣體系

試劑加樣體積(PL)

dH2O8.3

lOxPCRBuffer2.5

25mMMgCI22.5

2.5mMdNTPs3.0

25pMescV-F0.4

25pMescV-R0.4

25pMbfpB-F0.1

25pMbfpB-R0.1

25pMstxlA-F0.2

25pMstxlA-R0.2

25pMstx2A-F0.4

25pMstx2A-R0.4

25pMe/t-F0.1

25pMe/t-R0.1

25pMestla-F0.4

25pMestla-R0.4

25pMesttb-F0.2

25pMestlb-R0.2

25|JMinvE-F0.2

25|jMinvE-R0.2

25pMastA-F0.4

25pMastA-R0.4

25pMaggR-F0.2

25pMaggR-R0.2

25pMpic-F0.2

25pMpic-R0.2

25pMuidA-F0.2

25pMuidA-R0.2

3U/|jLTaq酶0.7

DNA模板2.0

3.5檢測結(jié)果的判定

取5pLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳。根據(jù)特異性核酸條帶大小和數(shù)目判斷

致瀉大腸埃希氏菌的種類。見圖2。

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EPECEHECETECEIECEAECNIXMarker

圖2種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重PCR擴(kuò)增片段

注：圖中標(biāo)示EPEC、EHEC(STEC)、ETEC、EIEC、EAEC的泳道為反應(yīng)體系中僅存在

相應(yīng)的一種模板和12對引物同時擴(kuò)增后出現(xiàn)的片段，而MIX泳道為將五種致瀉大腸埃希

氏菌混合后與12對引物同時擴(kuò)增后出現(xiàn)的片段。

4血清學(xué)鑒定

4.1挑取PCR擴(kuò)增陽性菌種，營養(yǎng)平板分離，36七±1°C培養(yǎng)過夜。

4.2根據(jù)PCR鑒定結(jié)果，用相應(yīng)致病大腸血清。多價、單價、K、H診斷血清進(jìn)行血清

玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行診斷。見表6。

表6常見致瀉大腸埃希氏菌的。血清群及血清型

嬰幼兒腹瀉成人和兒童腹瀉

EPECETECEIECSTECEAEC

。28。

。20。26。44。6：將5舊16。8火40小9O157.H/O9K99

C

086O：H：H-0112

。55Gm。8K25舊9847。26及2舊11。101居9

O]140)190125O|1舊27O|5'H|10124O111

012601270128O：H-0136

20。25：心舊420103

014201580143

。25收8舊一O27：H70145

027*H20。63舊1201440104

。73此5。78舊110152

O]64

。78舊12O85：H7

。114舊21。“5：舊5丁)

O127.H12O128.H/

。】28舊21?！?9舊28

。148舊28。149舊4

。159舊4Oi59-H20

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。159舊34O166：H27

O,69：H-

注：1:無動力的變異

4.3報告血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5生化鑒定

5.1對PCR陽性、血清學(xué)可分型及不可分型菌株進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。

5.2報告最終鑒定結(jié)果。

6菌株保存和上送

4℃或室溫保存的半固體培養(yǎng)基保菌菌種至少2套（穿刺接種后36℃培養(yǎng)過夜即可）

或30%甘油肉湯凍存管-70°C保存菌株至少2套。按照要求定期上送。

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(五)大腸埃希氏菌O157:H7檢測操作程序

1范圍

本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中大腸埃希氏菌O157:H7(Aa?e〃c/?/b8〃657:H7)的檢驗(yàn)

方法。

2檢驗(yàn)程序

大腸埃希氏菌657:H7檢驗(yàn)程序見圖3。

圖3大腸埃希氏菌。157舊7檢驗(yàn)程序

3操作步驟

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3.1標(biāo)本收集

標(biāo)本包括新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至

Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時采用。

肛拭子收集后應(yīng)當(dāng)目測，需要在拭子上明顯見到糞便。

所采集的標(biāo)本盡快檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)

送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于清潔、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h

內(nèi)送檢。

3.2增菌培養(yǎng)

增菌液采用添加20mg/L新生霉素的改良EC肉湯（mEC）。將采集的一支便拭子

1:10接種于6mLmEC肉湯，36七±1℃恒溫?fù)u床增菌培養(yǎng)6h（如無搖床，36℃±1℃

恒溫增菌培養(yǎng)9h?12h）。

3.3大腸埃希氏菌O157：H7膠體金試紙快速篩查

3.3.1將膠體金試紙從袋中取出，平放于潔凈、干燥的工作臺上，編號；

3.3.2用加樣器吸取樣品增菌液150pL,加入檢測卡一端的加樣孔；

3.3.32min?20min內(nèi)讀取結(jié)果。陰性樣品在視窗上部出現(xiàn)一條單一的紅色對照線，這

表明試劑已正確流動且檢測過程已發(fā)生。陽性樣品將顯示兩條紅色帶，這表明檢出0157

抗原。如果紅色條帶出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)考慮重做。

3.4免疫磁珠集菌

將0157膠體金試紙呈陽性的mEC增菌肉湯，進(jìn)行免疫磁珠集菌。

3.4.1取下磁鐵板,將編好號的1.5mL的Eppendorf離心管,置入DynalMPC-M架上。

3.4.2輕柔混勻抗0157免疫磁珠（反復(fù)顛倒，直到管底沉淀完全消失），吸取抗0157

免疫磁珠，置入每只編號的Eppendorf離心管中20口1_。

3.4.3取膠體金試紙陽性增菌培養(yǎng)物1mL,加入上述對應(yīng)的Eppendorf離心管中。蓋緊

蓋子。輕輕顛倒混勻。

3.4.4置于DynalMX3旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上，室溫下，旋轉(zhuǎn)30min（如果沒有旋轉(zhuǎn)器，可人工

旋轉(zhuǎn)）。

3.4.5將磁鐵板插入DynalMPC-M管架中，反復(fù)顛倒數(shù)次，將抗0157免疫磁珠吸附沉

淀在Eppendorf離心管壁上。吸去上清（包括殘留在管蓋上的液體），并棄掉。

3.4.6將磁鐵板從DynalMPC-M架抽出。每只Eppendorf離心管中加入1mL

PBS-Tween20（PH7.4）,輕輕顛倒混勻，重新懸浮免疫磁珠。

3.4.7重復(fù)3.4.5?3.4.6步驟

3.4.8重復(fù)3.4.5步驟。

3.4.9用50pLPBS-Tween20重新懸浮免疫磁珠細(xì)菌混合物。

3.5接種選擇性平板

將50pL免疫磁珠細(xì)菌混合物用接種環(huán)劃線或L棒涂布分別接種于O157：H7科瑪嘉顯

色平板或山梨醇麥康凱平板（SMAC）各一塊，36七±1°C培養(yǎng)18h?24h;

在SMAC平板上O157:H7菌落應(yīng)為扁平、透明或半透明、表面光滑濕潤、不發(fā)酵山

梨醇乳白色菌落，極少部分遲緩發(fā)酵山梨醇，呈紅色。邊緣光滑，直徑約2mm。在0157:

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H7科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上呈淡紫色或紫紅色菌落。

3.6初步鑒定

對疑似菌落染色為革蘭陰性桿菌者，在上述平板挑取疑似菌落10?20個，轉(zhuǎn)種克氏雙

糖（KIA）培養(yǎng)基，36℃±1匕培養(yǎng)16h-20ho如其生長性狀為葡萄糖（+）、乳糖（+）、

產(chǎn)氣（+）、硫化氫（-）者。

3.7診斷血清凝集試驗(yàn)

可疑菌株可用大腸埃希氏菌0157抗血清和0157單克隆抗體進(jìn)行玻片凝集，凝集強(qiáng)

度達(dá)（+++）,再用H7抗血清凝集鑒定。同時設(shè)鹽水做對照。上述，冷凍，真空抽干，并

于真空狀態(tài)下封口保存。若患者不能自然排除O157:H7與腸桿菌科的某些菌種存在抗原交

叉現(xiàn)象，例如：弗勞地檸檬酸桿菌、赫爾曼埃希氏菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌

等，一般可通過單克隆抗體解決，但弗勞地枸椽酸桿菌與O157:H7的O抗原交叉反應(yīng)用

單克隆抗體也無法辨別，只可通過檢測O抗原編碼基因鑒別。

3.8API20E生化鑒定試劑盒

采用API20E生化鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定，生化反應(yīng)編碼:大多為5144172,極少數(shù)為

1144172或5144162。

4菌株保存和定期上送

4℃或室溫保存的半固體培養(yǎng)基保菌菌種至少2套（穿刺接種后36℃培養(yǎng)過夜即可）

或30%甘油肉湯凍存管-7?！姹４婢曛辽?套。按照方案要求定期上送。

5多重PCR毒力基因鑒定

PCR擴(kuò)增0157、H7編碼基因，并且檢測s次/、stx2、h/y.eae毒力基因。典型的

造成人類感染的大腸埃希氏菌O157：H7為。157+、H7+,并且攜帶志賀毒素、溶血素與粘

附抹平因子：stxl+.$嶼、/?＞、eae^,我國大部分657:H7菌株不攜帶以/,為stxl-.

stx3、heae+0

多重PCR各對引物序列見表7。

表7多重PCR毒力基因鑒定的引物

目標(biāo)基因引物序列片段大小（bp）

stx}F5-ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC-3'180

R5'-AGAACGCCCACTGAGATCATC-3'

stx2F5'-GGCACTGTCTGAAACTGCTCC-3'255

R5-TCGCCAGTTATCTGACATTCT-3,

eaeAF5'-GACCCGGCACAAGCATAAGC-31384

R5-CCACCTGCAGCAACAAGAGG-3'

hlyAF5-GCATCATCAAGCGTACGTTCC-3,534

R5'-AATGAGCCAAGCTGGTTAAGC

T-31

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rfbo\57F5'-CGGACATCCATGTGATATGG-3'259

R5-TTGCCTATGTACAGCTAATCC-3'

5.1模板DNA提取：用熱裂解法，將純化的可疑菌株接種5mL營養(yǎng)肉湯，36℃±1℃

培養(yǎng)6卜或過夜，10000「/^1小離心5^1小，棄上清；加入1mL生理鹽水，震蕩分散細(xì)菌,

】0000「/|71心離心5|^5棄上清；沉淀加】00pL無菌蒸播水，重新震蕩懸浮后置100℃

水浴10min;10000「/171心離心5171小，上清用于PCR擴(kuò)增。陽性和陰性對照分別為我們

保存的產(chǎn)志賀氏毒素1和2的大腸埃希氏菌O157:H7和不具備上述6種基因的大腸埃希氏

菌，同法制備。

5.2多重PCR反應(yīng)體系：模板DNA提取液5pL,10XPCR緩沖液5pL,分別加終濃度

1.5mMMgCI2,0.2mMdNTP,每種引物500nM,TaqDNA聚合酶1.5pL,最后加無菌

蒸僧水至總體積50IJLO

5.3多重PCR反應(yīng)條件：除變性溫度由95℃改為94℃和增加最后72℃延伸外，均按

Paton法。1?10循環(huán)，94℃1min變性；65℃2min退火；72℃1.5min延伸?！?

25循環(huán)，94℃1min;60℃2min;72℃1.5min。26?35循環(huán)，94℃1min;65℃

2min;72℃2.5mino最后72℃10mino

5.4擴(kuò)增產(chǎn)物用含EB(0.5|jg/mL)的2%瓊脂糖電泳，陽陰性對照正常，紫外燈下觀察

結(jié)果，照相記錄。

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(六)副溶血性弧菌檢驗(yàn)操作程序

1范圍

本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中副溶血性弧菌(Vibrioparahaemo/yticus)的檢驗(yàn)方法。

2檢驗(yàn)程序

副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序見圖4。

圖4副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序

3操作步驟

3.1標(biāo)本收集

標(biāo)本包括新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至

Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時采用。

肛拭子收集后應(yīng)當(dāng)目測，需要在拭子上明顯見到糞便。

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所采集的標(biāo)本盡快檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在室溫條件下24h內(nèi)

送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于清潔、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，室溫條件下8h

內(nèi)送檢。

3.2分離培養(yǎng)

新鮮糞便：無菌拭子采集少量糞便，將拭子放入3%氯化鈉堿性蛋白陳水。輕擰管蓋。

注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不可將過量的標(biāo)本放入堿性蛋白月東水。

肛拭子：操作程序同新鮮糞便。

轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子：輕攪混合標(biāo)本；將拭子放入3%氯化鈉堿性

蛋白月東水。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不可將過量的標(biāo)本放入堿性蛋白

陳水。

堿性蛋白月東水于36℃±1匕培養(yǎng)12h?16h,于TCBS平板或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基

平板上劃線分離，36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h。

3.3菌落特征

典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸,

有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm?3mm。從培養(yǎng)箱取出TCBS平板后，應(yīng)盡快（不超過

1h）挑取菌落或標(biāo)記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上呈圓

形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2mm?3mm。

3.4純培養(yǎng)

挑取3個或以上可疑菌落，劃線接種3%氯化鈉胰蛋白月東大豆瓊脂平板，36℃±1℃

培養(yǎng)18h~24h。

3.5初步鑒定

3.5.1氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。

3.5.2挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，轉(zhuǎn)種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃

±1七培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不

變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動力。

3.5.3嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不同氯

化鈉濃度的胰月東水，36°C±1°C培養(yǎng)24h,觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化

鈉和10%氮化鈉的胰陳水中不生長或微弱生長，在6%氯化鈉和8%氯化鈉的胰陳水中生長

旺盛。

3.6確定鑒定

刮取3%氯化鈉胰蛋白月東大豆瓊脂平板上的單個菌落，進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定試劑盒鑒定。

4血清學(xué)分型

4.1制備:接種兩管3%氯化鈉胰蛋白月東大豆瓊脂試管斜面,36七±1匕培養(yǎng)18h?24h。

用含3%氯化鈉的5%甘油溶液沖洗3%氯化鈉胰蛋白月東大豆瓊脂斜面培養(yǎng)物，獲得濃厚的菌

懸液。

4.2K抗原的鑒定：取一管上述制備好的菌懸液，首先用多價K抗血清進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝

集反應(yīng)時再用單個的抗血清進(jìn)行檢測。用蠟筆在一張玻片上劃出適當(dāng)數(shù)量的間隔和一個對

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照間隔。在每個間隔內(nèi)各滴加一滴菌懸液，并對應(yīng)加入一滴K抗血清。在對照間隔內(nèi)加一

滴3%氯化鈉溶液。輕微傾斜玻片，使各成分相混合，再前后傾動玻片1min。陽性凝集反

應(yīng)應(yīng)可以立即觀察到。

4.3?？乖蔫b定：將另外一管的菌懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，121℃高壓1h。高壓后4000

r/min離心15min,棄去上層液體，沉淀用生理鹽水洗三次，每次4000r/min離心15min,

最后一次離心后留少許上層液體，混勻制成菌懸液。用蠟筆將玻片劃分成相等的間隔。在

每個間隔內(nèi)加入一滴菌懸液，將。群血清分別加一滴到間隔內(nèi)，最后一個間隔加一滴生理

鹽水作為自凝對照。輕微傾斜玻片，使各成分相混合，再前后傾動玻片1min。陽性凝集反

應(yīng)應(yīng)可以立即觀察到。如果未見到與。群血清的凝集反應(yīng)，將菌懸液】21七再次高壓】h

后，重新檢測。如果仍舊為陰性，則培養(yǎng)物的。抗原屬于未知。根據(jù)表8報告血清學(xué)分型

結(jié)果。

表8副溶血性弧菌的抗原

。群K型

11,5,20,25,26,32,38,41,56,58,60,64,69

23,28

4,5,6,7,25,29,30,31,33,37,43,45,48,54,56,57,58,

3

59,72,75

44,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67,68,73

515,17,30,47,60,61,68

618,46

719

820,21,22,39,41,70,74

923,44

1024,71

1119,36,40,46,50,51,61

1219,52,61,66

1365

5PCR毒力基因鑒定

PCR法檢測/仍（耐熱直接溶血素基因）和trh（TDH相關(guān)溶血素基因）毒力基因，引

物序列見表9。

5.1模板DNA提取：自TCBS或科瑪嘉弧菌顯色平板上挑取3個可疑菌落，劃線含3%氮

化鈉的胰蛋白月東大豆瓊脂平板。純化菌株在含3%氯化鈉的腦心浸液肉湯中36℃±1七過

夜生長，10000xg離心10min。沉淀用無菌生理鹽水洗滌2次，重新懸浮于雙蒸水中，

煮沸10min。細(xì)菌裂解物立即用于PCR或-20均保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2PCR反應(yīng)體系中包括含DNA的細(xì)菌裂解物2pL,20pmol/L的引物貯存液各1ML,

dNTP貯存液（各種dNTP的濃度為2.5mmol/l）1pL,Taq聚合酶0.3pL（TaKaRa）,

10XPCR緩沖液5pL,總體積50pL。

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5.3反應(yīng)體系94℃預(yù)變性5minePCR的循環(huán)條件見表9。反應(yīng)體系72℃再延伸5min。

所有反應(yīng)均設(shè)立陽性對照和陰性DNA對照。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂凝膠中120V電泳，EB

染色，照相。

5.4PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂凝膠中120V電泳，EB染色，照相。

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表9鑒定致病性副溶血性弧菌的引物

目標(biāo)基因引物序列片段大小PCR條件循環(huán)

(bp)次數(shù)

七77基因TDH-L5'-AGCHCCATCTGTCCCTTn-3z43494℃1min30

TDH-2:5'-ATTACCACTACCACTCTC55℃1min

ATA-3'72℃1min

仍基因R2:5'-GGCTCAAAATGGTTAAGCG-3Z25094℃1min30

R6:5Z-CATnCCGCTCTCATATGC-3,55℃1min

72℃1min

6結(jié)果與報告

當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表10要求時，報告糞便標(biāo)本中檢出副溶血性弧菌。副

溶血性弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別見表11。

7菌株的保存和上送

培養(yǎng)物穿刺接種3%氯化鈉半固體培養(yǎng)基，輕擰管蓋，36℃±1七培養(yǎng)24h,蓋緊管

蓋。也可以在動力試驗(yàn)培養(yǎng)基24h培養(yǎng)物上加入一層滅菌礦物油。室溫貯存培養(yǎng)物，不要

冷藏。如果需要長期保存菌株,將0.7mL3%氯化鈉腦心浸液肉湯6h?12h培養(yǎng)物和0.3

mL滅菌甘油加入滅菌菌種管，立即放置-7?！鉉保存。按照方案要求定期上送。

表10副溶血性弧菌的生化性狀

試驗(yàn)項(xiàng)目