BD流式原理及應(yīng)用

TOHELPALLPEOPLELIVEHEALTHYLIVES成立于1897年位居財富周刊500強的大型跨國公司產(chǎn)品涵蓋諸多醫(yī)療領(lǐng)域BDBiosciences生物科學(xué)系統(tǒng)(全球最大的流式細(xì)胞儀生產(chǎn)商/供應(yīng)商)注射器產(chǎn)品系列：疫苗注射器臨床標(biāo)本采集系統(tǒng)感染性疾病診斷系統(tǒng)在中國各大城市設(shè)有代表處第1頁/共153頁市場情況1973年世界第一臺商品化的流式細(xì)胞儀FACSI由BD公司和美國斯坦福大學(xué)共同研制成功1980年北京師范大學(xué)引進(jìn)了中國的第一臺流式細(xì)胞儀FACSIIBD是全球最大的流式細(xì)胞儀生產(chǎn)商和供應(yīng)商，在全球的占有率為75%，在中國75%在全國各大醫(yī)院和科研院所，大部分為BD公司的儀器，總計數(shù)量已超過700臺，如:清華，北大，中科院，軍科院等等第2頁/共153頁BD公司流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSAria第3頁/共153頁流式細(xì)胞術(shù)概述第4頁/共153頁流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項特性，并加以定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量第5頁/共153頁流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點細(xì)胞受體第6頁/共153頁流式細(xì)胞儀的原理第7頁/共153頁第8頁/共153頁散射光信號FALSSensorLaser第9頁/共153頁散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

細(xì)胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性第10頁/共153頁外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細(xì)胞溶解后）GranulocytesMonocytesLymphocytes第11頁/共153頁流式細(xì)胞儀的檢測信號熒光信號使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量第12頁/共153頁熒光信號雙色直接染色第13頁/共153頁數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)存儲:LISTMODE數(shù)據(jù)顯示: 直方圖(Histogram)

二維點圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

密度圖(Density)

三維圖（3DPlot）等第14頁/共153頁單參數(shù)直方圖分析第15頁/共153頁數(shù)據(jù)分析直方圖分析第16頁/共153頁多參數(shù)散點圖分析第17頁/共153頁數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析第18頁/共153頁數(shù)據(jù)分析三維圖分析第19頁/共153頁第20頁/共153頁流式細(xì)胞儀的應(yīng)用第21頁/共153頁流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)淋巴細(xì)胞亞群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞計數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病第22頁/共153頁流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用免疫功能研究血小板分析（心腦血管疾?。┘?xì)胞周期和倍體分析細(xì)胞凋亡干細(xì)胞研究樹突細(xì)胞研究腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究抗腫瘤藥物作用機(jī)制以及多藥耐藥性的研究放療/化療療效的研究第23頁/共153頁流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（免疫）淋巴細(xì)胞免疫分型淋巴細(xì)胞亞群分析CD4絕對計數(shù)HIV與SARS的診斷與研究淋巴細(xì)胞CD4/CD8分析CD4絕對計數(shù)T細(xì)胞活化免疫功能和免疫調(diào)控的研究淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化細(xì)胞因子的研究淋巴細(xì)胞的增殖樹突狀細(xì)胞的研究第24頁/共153頁淋巴細(xì)胞亞群分析使用經(jīng)熒光素標(biāo)記的特異單克隆抗體，進(jìn)行多色染色，同時分析淋巴細(xì)胞膜上多種白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的表達(dá)，可以將淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開，進(jìn)行定性分析各淋巴細(xì)胞亞群的百分含量淋巴細(xì)胞亞群的絕對計數(shù)，進(jìn)行定量分析第25頁/共153頁淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān)總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能，

能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。第26頁/共153頁淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)CD4、CD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+）T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）Th/Ts評價那些自身免疫失調(diào)、被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)第27頁/共153頁診斷原發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ缦忍煨詿or球蛋白血癥）或繼發(fā)性免疫缺陷病（如AIDS）造血干細(xì)胞移植后免疫重建（6個月NK；9個月T、B）Th/Ts

：機(jī)體免疫功能亢進(jìn)：自身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等（治療有效恢復(fù)正常）Th/Ts

：機(jī)體免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活動性肝炎和活動性肝硬化、再障、結(jié)核、腫瘤等移植后動態(tài)免疫監(jiān)測：急排臨床癥狀出現(xiàn)前1-5天，活化T和Th/Ts持續(xù)，>1.2預(yù)示急排；Th/Ts持續(xù)表明可能感染，比值<1.08，可能性大，<0.2應(yīng)停用免疫抑制劑；實體腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀察治療前常伴T

、Th/Ts

，放/化療有效可恢復(fù)；淋巴細(xì)胞免疫表型正?；蛑委熀竽芑謴?fù)正常者預(yù)后常較好；探索疾病發(fā)病機(jī)理、進(jìn)程和預(yù)后（炎癥、腫瘤）臨床意義——判斷病人的機(jī)體免疫狀態(tài)第28頁/共153頁淋巴細(xì)胞亞群雙色分析12%76%49%26%11%第29頁/共153頁AIDS病人T亞群分析27-51%15-44%50-84%第30頁/共153頁先天性無r球蛋白血癥5-18%第31頁/共153頁乳腺癌患者T淋巴細(xì)胞亞群變化第32頁/共153頁TriTEST/MultiTest與T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)使用三色試劑或四色免洗試劑樣本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL免洗操作，減少細(xì)胞丟失絕對計數(shù)TruCOUNT管預(yù)先加有已知數(shù)量微球，在流式細(xì)胞儀上直接得到T淋巴細(xì)胞亞群的絕對含量，提高工作效率和計數(shù)的精確度——單平臺計數(shù)報告T淋巴細(xì)胞及TH、TS百分含量、絕對含量和H/S比值第33頁/共153頁TriTESTCD4/CD8/CD3分析

與T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)%TLymph CD3+AbsCntCD3+CD4+%TLymph CD3+CD4+AbsCntCD3+CD8+%TLymph CD3+CD8+AbsCntTH/SRatio第34頁/共153頁MultiTESTCD3/CD8/CD45/CD4MultiTESTCD3/CD15+56/CD45/CD19第35頁/共153頁淋巴細(xì)胞

活化功能研究第36頁/共153頁T淋巴細(xì)胞活化細(xì)胞數(shù)目增殖細(xì)胞表面表達(dá)活化標(biāo)記分泌細(xì)胞因子第37頁/共153頁CFSE失蹤原理羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時，CFsE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個子代細(xì)胞中，因此其熒光強度是親代細(xì)胞的一半。這樣，在一個增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進(jìn)行分析。體內(nèi)、體外實驗均可以應(yīng)用第38頁/共153頁DilutionofCFSEwithcelldivisionLyonsandParish,1994JIM,171;131Divisions:3210CFSEFL-1(Log)Divisions:

3210第39頁/共153頁葡萄球菌腸毒素刺激牛時間變化示意圖，第40頁/共153頁T淋巴細(xì)胞活化細(xì)胞數(shù)目增殖細(xì)胞表面表達(dá)活化標(biāo)記分泌細(xì)胞因子第41頁/共153頁T細(xì)胞激活抗原表達(dá)的動力學(xué)曲線第42頁/共153頁

FastImmuneAssaySystem

快速全面檢測淋巴細(xì)胞功能第43頁/共153頁BDFastImmuneActivationSystem

快速免疫活化檢測系統(tǒng)lymphocyte

Activation4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulus第44頁/共153頁優(yōu)點快速全程<5h簡便全血分析（肝素鈉抗凝血）無需分離PBMCs無需組織培養(yǎng)免洗試劑，無需洗滌離心高效多參數(shù)分析加速研究進(jìn)程功能活性檢測同時報告單個細(xì)胞亞型可外延T細(xì)胞分析可進(jìn)行亞群分析可外延于B、NK、單核細(xì)胞接近生物體自身分析條件應(yīng)用全血保留了細(xì)胞與生化微環(huán)境更能代表體內(nèi)狀態(tài)BDFastImmuneActivationSystem

快速免疫活化檢測系統(tǒng)第45頁/共153頁應(yīng)用實例：HIV病例T細(xì)胞活化檢測第46頁/共153頁淋巴細(xì)胞活化功能檢測的廣泛應(yīng)用結(jié)合淋巴細(xì)胞亞群分析——免疫調(diào)節(jié):病因?qū)W研究:AIDS、感染、腫瘤、自身免疫性疾病藥物篩選/疫苗療效評價各種狀態(tài)下免疫狀態(tài)評價：移植、寄生蟲、營養(yǎng)失調(diào)、創(chuàng)傷、手術(shù)、燒傷、放/化療等第47頁/共153頁T細(xì)胞的細(xì)胞因子分型Ⅰ型介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)引起遲發(fā)過敏反應(yīng)、巨噬細(xì)胞活化、2型反應(yīng)下調(diào)刺激來源：病毒、某些細(xì)菌Ⅱ型介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)引起B(yǎng)細(xì)胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反應(yīng)下調(diào)刺激來源：多細(xì)胞寄生蟲、過敏源第48頁/共153頁活化的淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子第49頁/共153頁BDFastImmuneCytokineSystem

快速免疫細(xì)胞因子檢測系統(tǒng)

Anti–IFN–gCD69

Activation37℃IncubationIntracellularStainLyse/FixAcqusitionPermeabilizelymphocyteerythrocytestimulusSurfaceStainWashcytokineWashWashproteinblocking基于細(xì)胞水平的研究胞內(nèi)因子胞外因子第50頁/共153頁優(yōu)點快速一天內(nèi)完成，實驗流程需6-8小時簡便全血分析（肝素鈉抗凝血）無需分離PBMCs無需組織培養(yǎng)高效可在同一個細(xì)胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細(xì)胞因子也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞亞型，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析接近生物體自身分析條件應(yīng)用全血保留了細(xì)胞與生化微環(huán)境更能代表體內(nèi)狀態(tài)注意

質(zhì)控：用CD69做刺激和破膜效果的判定BDFastImmuneCytokineSystem

快速免疫細(xì)胞因子檢測系統(tǒng)第51頁/共153頁應(yīng)用實例：分析1型與2型免疫反應(yīng)第52頁/共153頁CytometricBeadsArray(CBA)系統(tǒng)

胞外細(xì)胞因子檢測系統(tǒng)第53頁/共153頁簡介CBA是一系列熒光強度不同、包被有捕獲抗體的微球，類似于ELISA的捕獲孔板，可以捕獲相應(yīng)的抗原，再結(jié)合第二種熒光檢測抗體，形成一種雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，能結(jié)合上，就能發(fā)出熒光來，從而檢測到相應(yīng)的抗原。簡而言之，將包被有不同抗體的微球混合在一個樣本中即可進(jìn)行多參數(shù)檢測。應(yīng)用領(lǐng)域：主要用于血清、血漿、培養(yǎng)細(xì)胞上清、眼淚或房水等各種液相中可溶性細(xì)胞因子的濃度檢測細(xì)胞凋亡等信號傳導(dǎo)研究，磷酸化蛋白定量分析第54頁/共153頁HowtoanalyzesolubleproteinsinFCM?++待分析的可溶性抗原熒光標(biāo)記的檢測抗體

捕獲微球

捕獲抗體Bead微球體標(biāo)記技術(shù)&FCM技術(shù)基本原理CBA捕獲微球＋可溶性抗原＋檢測抗體

三明治復(fù)合物第55頁/共153頁CytometricBeadArray－

multiplexedbeads123不同強度紅色熒光的捕獲微球，在FCMFL3檢測不同的目標(biāo)蛋白PE標(biāo)記的檢測抗體，在FCMFL2檢測。

熒光強度即為靶蛋白量4756第56頁/共153頁HumanTh1/Th2CytokineCBAKitNosampleaddedinDetectorantibodiesonly第57頁/共153頁

Chemokine-ICBAAssayStandard0pg/mlCBAAssayStandard第58頁/共153頁10pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第59頁/共153頁20pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第60頁/共153頁80pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第61頁/共153頁156pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第62頁/共153頁312pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第63頁/共153頁625pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第64頁/共153頁1250pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第65頁/共153頁2500pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第66頁/共153頁HumanTh1/Th2LymphokineCBA

–標(biāo)準(zhǔn)曲線5000pg/ml2500pg/ml1250pg/ml625pg/ml312pg/ml80pg/ml20pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-

IFN-IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-

IFN-第67頁/共153頁操作步驟檢測物與捕獲微球共孵育。洗滌。標(biāo)記熒光探測試劑（FITC或PE標(biāo)記）。洗滌。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。CBA分析軟件批量數(shù)據(jù)分析。第68頁/共153頁與傳統(tǒng)的ELISAs檢測相比能夠同時對單一樣本進(jìn)行多種目的蛋白檢測較傳統(tǒng)檢測節(jié)省樣本量（50μl）與ELISAs相比靈敏度高（2.8pg/ml）、重復(fù)性好檢測的線性范圍寬（0-5000pg/ml）所有分析只需一組標(biāo)準(zhǔn)曲線避免酶聯(lián)反應(yīng)所致人工假象強大的CBA分析軟件節(jié)省操作時間、檢測時間和分析時間。。第69頁/共153頁使用Prostate-specificantigen（PSA-3）及其突變體PSA-3A對前列腺癌患者T細(xì)胞免疫，通過HumanTh1/Th2CytokineCBAKit檢測免疫T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌水平A，B，C為稀釋標(biāo)準(zhǔn)，D為無處理對照組，E為PSA-3A處理組，F(xiàn)為PSA-3處理組摘自TerasawaH,etal.ClinicalCancerResearch.Vol.8,41-53,January2002上述研究發(fā)現(xiàn)PSA-3A比PSA-3能更有效的殺傷前列腺腫瘤，與PSA-3A能刺激T細(xì)胞分泌更高水平的IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ有關(guān)，為后續(xù)藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)第70頁/共153頁BDCBA新產(chǎn)品系列

BDCBAFlexSet-New基本原理與CBAKit相似檢測原理不同：

FlexSet微球種熒光，分別在流式細(xì)胞儀的FL3（近紅外熒光）和FL4（紅色熒光）通道檢測，通帶有近紅外和紅色兩過這個二維矩陣（對應(yīng)于微球上的特定序號）識別捕獲微球，從而定性目的蛋白，PE標(biāo)記的檢測抗體在FL2通道來對目的蛋白定量。第71頁/共153頁CBAKit與CBAFlexSetCBAKit同時檢測5或者6個全部試劑CBAAnalysisSoftware檢測指標(biāo)組合固定CBAFlexSet最多達(dá)75個需另購BufferkitFCAPArraySoftware檢測指標(biāo)可自由組合第72頁/共153頁CBA/CBAFlexset的應(yīng)用領(lǐng)域血清、血漿或培養(yǎng)液上清等各種液相中細(xì)胞因子的濃度檢測細(xì)胞凋亡等信號傳導(dǎo)研究，磷酸化蛋白定量分析免疫細(xì)胞功能性研究免疫疾病的監(jiān)控疫苗研發(fā)，藥效評價，總體免疫功能分析傳染性疾病腫瘤研究第73頁/共153頁調(diào)節(jié)性T細(xì)胞研究進(jìn)展第74頁/共153頁免疫耐受機(jī)制以往研究認(rèn)為：（“被動”方式）胸腺細(xì)胞及前B（pre-B）細(xì)胞在中樞免疫器官中的克隆清除進(jìn)入外周的成熟淋巴細(xì)胞表達(dá)針對自身抗原的識別受體被誘導(dǎo)進(jìn)入免疫無能狀態(tài)而不表現(xiàn)任何自身反應(yīng)性部分淋巴細(xì)胞對自身抗原的免疫忽視第75頁/共153頁免疫耐受機(jī)制近年研究表明：（“主動”方式）調(diào)節(jié)性T（Tr）細(xì)胞以“主動”的方式維持自身免疫耐受

這一發(fā)現(xiàn)將改變我們對自身免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識，并將對免疫學(xué)基本理論的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。

第76頁/共153頁調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志FOXP3（ForkheadboxproteinP3）是一個50kD的轉(zhuǎn)錄因子，也稱為Scurfin、JM2、IPEX。它是一個主要調(diào)節(jié)基因。CD4+/CD25-細(xì)胞上FOXP3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可以誘導(dǎo)GITR、CD103和CTLA4的表達(dá)，并且促使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型形成。FOXP3在X連鎖自身免疫－過敏失調(diào)綜合征（XLAAD或IPEX）患者中發(fā)生突變。FOXP3過度表達(dá)會引起機(jī)體的免疫應(yīng)答下降，表明它是一個調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的主要轉(zhuǎn)錄因子。FOXP3表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)第77頁/共153頁調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分類根據(jù)來源、特異性及效應(yīng)機(jī)制可分為天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和獲得性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞天然性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織的CD4+T細(xì)胞中約有5～10％的細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)CD25分子，該群細(xì)胞從胸腺中發(fā)育，組成性表達(dá)foxp3，在體內(nèi)外發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能獲得性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：是由外周T細(xì)胞在特定的條件下分化出來，通過分泌高水平的IL-10和

TGF-β而發(fā)揮其抑制功能.第78頁/共153頁RegulatoryTCellsBackground:

itsDevelopmentThymusPeripheryTcellprecursorTr1Th3FoxP3-??iDCand/orinthePresenceofIL-10And/orTGFbConventionalTcellNa?veTcellNaturallyoccurringTregcellAdaptiveTregcellCD25GITRCTLA-4FoxP3+CD4CD127CD25GITRCTLA-4FoxP3+CD4CD127FoxP3-第79頁/共153頁人Tr細(xì)胞表達(dá)特征：CD127+CD127是非二聚體IL-7受體CD127表達(dá)于胸腺細(xì)胞，T、B祖細(xì)胞，成熟T細(xì)胞，單核細(xì)胞及其它淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞T細(xì)胞活化后CD127表達(dá)下調(diào)CD127表達(dá)下調(diào)發(fā)生在Tr細(xì)胞CD127下調(diào)同時CD25高表達(dá)、FoxP3+為Tr細(xì)胞CD127優(yōu)于傳統(tǒng)的FoxP3+－－保證了細(xì)胞的活性第80頁/共153頁從HumanPBMC’s中分離Tr細(xì)胞第81頁/共153頁FoxP3染色確認(rèn)Tr細(xì)胞第82頁/共153頁FoxP3染色確認(rèn)Tr細(xì)胞第83頁/共153頁小結(jié)CD127弱表達(dá)FoxP3+CD127loCD25hi-intCD127和FoxP3聯(lián)合應(yīng)用于Tr細(xì)胞的功能性研究（體內(nèi)體外）第84頁/共153頁樹突狀細(xì)胞

（dendriticcell，DC）第85頁/共153頁DC的生物學(xué)特點DC因其具有膜樣或樹突樣突起而得名DC包括郎罕氏細(xì)胞、間隙DC、濾泡DC（FDC）、并指DC（IDC）等等。其在體內(nèi)含量甚微，僅占外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的1％以下，但分布非常廣泛，在血液、肝、脾、淋巴結(jié)及非免疫器官組織中都有存在。第86頁/共153頁DC的分化和成熟DC可分為前體DC，未成熟DC，成熟DCDC起源于骨髓CD34+多能細(xì)胞，在GM-CSF作用下，進(jìn)一步分化為DC前體細(xì)胞，包括髓系前體和淋巴系前體，并離開骨髓進(jìn)入外周血。在外周血中至少有兩種DC前體被鑒定出來：PlasmacytoidDC——PDC——漿細(xì)胞樣的樹突細(xì)胞MyeloidDC——MDC——髓樣的樹突細(xì)胞血液中的前體DC隨血液遷移到皮膚、胃腸道、心、肝、肺等非淋巴器官發(fā)育為未成熟DC未成熟DC攝取外來抗原后，可自發(fā)成熟，由外周向次級淋巴器官歸巢在成熟過程中，DC攝取和加工處理外來抗原的能力逐漸減弱，而遞呈抗原的功能逐漸增強第87頁/共153頁AreviewofJacquesBanchereau第88頁/共153頁樹突狀細(xì)胞的可塑性DC在不同細(xì)胞因子和生長因子的作用下可以向著不同的方向分化DC分化過程中的不同刺激引導(dǎo)它們向多種組織和器官移動，在這些組織中擔(dān)當(dāng)起對抗入侵感染因素的哨兵第89頁/共153頁DC的生物學(xué)功能DC是一類抗原呈遞細(xì)胞（APC），在捕獲和處理抗原后，將抗原遞呈給特殊的初始T淋巴細(xì)胞，引發(fā)初次免疫反應(yīng)，在誘導(dǎo)免疫耐受和調(diào)控免疫活性方面扮演著重要角色，DC是機(jī)體內(nèi)惟一能激活初始T細(xì)胞的APC。DC還可以通過激活巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞，NK樣T細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞引發(fā)機(jī)體對入侵感染因素的反應(yīng)，從而連接天然免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)DC受細(xì)胞因子調(diào)控的同時,本身也可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,如IFN-α,IL-12,GM-CSF,IL-1,IL-6和TNF-α等第90頁/共153頁DC將Ag提呈給初始T細(xì)胞第91頁/共153頁DC的表面標(biāo)志人DC的主要特征性表面標(biāo)志為CD1a和CD83，CD83還是DC充分成熟的標(biāo)志。成熟DC高表達(dá)CD80（B7-1），CD86，CD40和CD54等共刺激分子，而未成熟DC不表達(dá)或低表達(dá)這些分子未成熟DC具有強大的內(nèi)吞作用，并高表達(dá)大多數(shù)趨化因子受體所有DC共同的突出特點是能高水平表達(dá)MHC-II類分子如HLA-DR，DC成熟過程突出的標(biāo)志是MHC-II類分子的重分布，從主要在細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕诩?xì)胞膜表面。第92頁/共153頁人DC成熟過程中的特點改變IL-10第93頁/共153頁人外周血DC亞群的鑒定PDC：linnegCD11cnegCD123high；MDC：linnegCD11chighCD123low

二者還都高表達(dá)MHC-Ⅱ（HLA-DR），但都不表達(dá)lin（CD3，CD14，CD16，CD19，CD20，CD56）注：CD11c：整合素αx鏈

CD123：IL-3受體α鏈第94頁/共153頁體外人DC制備前體DC來源外周血單個核細(xì)胞/單核細(xì)胞密度梯度離心BD?IMagCellSeparationSystem骨髓、新生兒臍帶血的CD34+細(xì)胞在細(xì)胞因子（如GM-CSF，IL-4和TNF-α）的作用下誘導(dǎo)DC體外分化第95頁/共153頁DC體外誘導(dǎo)分化第96頁/共153頁監(jiān)控DC成熟度的監(jiān)控BD?MulticolorMDDCphenotypingreagentCD209(DC-SIGN)：DC獨有標(biāo)志CD83：充分成熟標(biāo)志CD86：DC成熟過程中表達(dá)增加第97頁/共153頁小鼠DC小鼠DC的標(biāo)志是CD11c，成熟DC也有MHC-Ⅱ和CD80，CD86的表達(dá)小鼠DC前體主要分為兩類：功能上等同于人MDC和PDC小鼠DC制備：小鼠骨髓BD?IMagMouseDendriticCellEnrichmentSet大鼠DC：常用標(biāo)志OX62，OX6（MHC-Ⅱ），CD80，CD86等第98頁/共153頁DC功能分析刺激T細(xì)胞，誘導(dǎo)其增殖（BrdU溴脫氧尿苷的摻入）和細(xì)胞因子的分泌DC細(xì)胞因子的分泌第99頁/共153頁樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子DC分泌的細(xì)胞因子有很多種，但各種細(xì)胞因子與DC功能的相關(guān)性尚在探討中第100頁/共153頁DC臨床和科研應(yīng)用1腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探討DC瘤苗研發(fā)將經(jīng)腫瘤抗原（如腫瘤抗原多肽、腫瘤細(xì)胞或裂解成分、腫瘤和DC融合的雜交細(xì)胞、腫瘤特異表達(dá)的mRNA）在體外沖擊致敏的DC回輸體內(nèi)，再與自體T細(xì)胞共育，有利于打破免疫耐受，有效誘導(dǎo)CTL介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。已用于黑色素瘤，前列腺癌，腎癌，多發(fā)性骨髓瘤，淋巴瘤，肝癌，婦科腫瘤，惡性腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的臨床治療實驗病毒感染移植物抗宿主反應(yīng)過敏和超敏反應(yīng)自身免疫性疾病第101頁/共153頁ControlPBMCSSclogCD3,14,19ECDCD4PC7HLADRPC5CD11cFITCCD123PEAscitesLN28%65%75%13%68%24%FScSSclogPDCMDCPDCandMDCinOvarianCancerHealthyControlPBMCSSClogCD3,14,19ECDCD4PC7HLADRPC5CD11cFITCCD123PEPatient’AscitesPatient’peritoneallymphnode(LN)28%65%75%13%68%24%FSCSSClogPDCMDCPDCandMDCinOvarianCancer(5-color)PDC(red);MDC(blue)DifferentpercentageandratioofPDCandMDC↓in3samples—MDC’roleincancerandcellimmunityscatterpropertiesofMDCin3samples:largerinascitesandundergoingapoptosisinLN第102頁/共153頁DC與HIVTheJournalofImmunology,2002,168:4796–4801.PDC↓↓MDC--第103頁/共153頁PhosFlow

---Phospho-proteinsDetection

byFlowCytometry

流式蛋白磷酸化檢測第104頁/共153頁細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號調(diào)節(jié)細(xì)胞信號胞間信號 胞內(nèi)信號細(xì)胞因子、趨化因子、

細(xì)胞因子受體、趨化因子受體和生長生長因子等 因子受體等的下游信號第105頁/共153頁磷酸化/去磷酸化——分子調(diào)控點在細(xì)胞的多重信號傳導(dǎo)路中，許多蛋白和酶的活性都受控于酪氨酸t(yī)yrosine、絲氨酸serine和蘇氨酸t(yī)hreonine的磷酸化蛋白的磷酸化/去磷酸化是一個可逆的過程：即在蛋白激酶的催化作用下向上述氨基酸位點添加磷酸集團(tuán)，而在蛋白磷酸酶的水解作用下移除磷酸集團(tuán)磷酸化/去磷酸化參與增殖、分化、發(fā)育、凋亡、壓力反應(yīng)等的調(diào)控異常調(diào)控見于：如糖尿病（II型，胰島素受體Ser/Thr磷酸化）、炎癥（P38Kinase）、血管新生（Tie-2受體和VEGF受體Tyr磷酸化）、腫瘤、心血管疾病、高血壓、中風(fēng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等ProteinKinasesProteinPhosphatasesATPADPH20PiPPKinaseCascadeGrowthfactorCellularResponsesMediategrowth,differentiationanddevelopmentPi第106頁/共153頁JAK/STATSignalingPathway:

STATPhosphorylationandTranslocationJAK3JAK3NUCLEUSPPIL-4STAT6STAT6STAT6PSTAT6PSTAT6PSTAT6PPPPPIL-4R細(xì)胞膜膜外膜內(nèi)第107頁/共153頁磷酸化蛋白的檢測Method:Immunohistochemistry（免疫組化）WesternblotFlowcytometry——BDPhosFlowCells:IntracellularstainingofphosphorylatedproteinsIncombinationwithsurfacemarkersUsingPhospho-Specificantibody第108頁/共153頁PPYYYYNonphosphorylation“specific”antibodies?Detectthetotalprotein:unphosphorylated+phosphorylatedisoforms?Antigen:recombinantproteinfragmentsPhospho-Specificantibodies

?Detectdefinedphospho-epitopesofphosphorylatedisoform?Antigen:Syntheticphospho-peptidesY磷酸化和非磷酸化抗體的區(qū)別YSTAT6STAT6YYSTAT6PSTAT6

PYYYY第109頁/共153頁BDPhosFlow和Westernblot的比較P.O.Krutziketal./ClinicalImmunology110(2004)206–221

Westernblot群體細(xì)胞分析需要同源性樣本單參數(shù)分析檢測需要大量的細(xì)胞106需批量檢測，耗時耗力BDPhosFlow單細(xì)胞水平進(jìn)行分析可以檢測異源性樣本

（結(jié)合細(xì)胞表面抗體）在單細(xì)胞水平同時進(jìn)行多參數(shù)分析（多色抗體）只需要很少的細(xì)胞103-104快速，省時省力，而且可以在96孔板中完成實驗（配備96孔板自動上樣裝置）第110頁/共153頁AtheoreticalexperimentcomparingWesternblotandflowcytometrywiththreesamplesandaproteinofinterestat1,10,or50copiespercell.Sample2and3lookthesameviaWesternblot,butwhenstainedwithfluorescentlylabeledantibodies,thedifferencesbetweenthesamplesbecomemorerelevant.BDPhosFlow和Westernblot的比較P.O.Krutziketal./ClinicalImmunology110(2004)206–221第111頁/共153頁流式檢測蛋白活性結(jié)果與WesternBlot比較第112頁/共153頁

不僅可以研究某個傳導(dǎo)路中的某個特定磷酸化蛋白的活化

還可同時研究多個傳導(dǎo)路中的多個磷酸化事件BDPhosFlow第113頁/共153頁磷酸化蛋白胞內(nèi)染色流程刺激Stimulatecytokine、LPS脂多糖或內(nèi)毒素、PMA佛波酯、etc（option）溶血——全血或?qū)嶓w組織固定FixParaformaldehyde多聚甲醛破膜Permeabilizemethanolordetergent-based甲醇/去垢劑

染色Stainsimultaneouslystainedforsurfacemarkerandphospho-proteinsusingphospho-specificAbs

分析AnalyzePermeabilizeStainFixStimulateAnalyze第114頁/共153頁ApplicationSampleshowUsingPhospho-SpecificantibodyincellsIn

humanlysedwholeblood減少樣本處理的操作步驟，同時減少人為處理導(dǎo)致的細(xì)胞活化，更復(fù)合體內(nèi)環(huán)境InhumanPBMCsInactivatedcelllinesInanimaltissuecellsIndiseasesUsingPhospho-CBA/CBAFlexsetincelllysates第115頁/共153頁IntracellularStainingOfSTAT3/STAT6

InIL-4+IL-6StimulatedWholeBloodHumanwholebloodwaseitheruntreated(A)orstimulatedwithIL-6+IL-4(B),100ng/mleachfor15minutesat37℃.ThecellswerethenfixedusingPatentedBDPhosflowLyse/FixBufferfor10minutesat37℃,andfollowedbyPermBufferIIIfor30minutesonice.Thencellswerestainedwithintracellularphospho-proteins&SurfacemarkerAbs.第116頁/共153頁腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究第117頁/共153頁腫瘤基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測惡性腫瘤是一種多基因異常疾病。由于原癌基因的激活或抑癌基因的突變、失活或缺失，導(dǎo)致某些細(xì)胞分化不良和增殖失控而形成腫瘤。FCM利用特異性的抗癌基因/抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物（特異性蛋白質(zhì)）的單克隆抗體對癌基因的表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測，監(jiān)測癌基因與抗癌基因表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，從分子水平推動了惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制及調(diào)控因素的研究進(jìn)程。第118頁/共153頁腫瘤基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測癌基因與抑癌基因：

myc基因族（C-myc,N-myc,L-myc）：癌基因，高表達(dá)促使轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性繁殖進(jìn)入腫瘤臨床期

ras基因族（N-ras,K-ras,H-ras）：癌基因，編碼蛋白為P21，在乳腺癌、胃癌中表現(xiàn)為P21蛋白過度表達(dá)

P53：抑癌基因，可抑制ras基因和myc基因協(xié)同作用引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，許多惡性腫瘤都有P53基因的缺失或點突變

c-erbB2基因：又稱neu基因，在癌細(xì)胞表面常有表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為HER-2/neu，其過量表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)第119頁/共153頁120結(jié)腸癌患者不同組織中突變型P53表達(dá)外周血（3.2%）轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（71.91%）原發(fā)灶（88.45%）第120頁/共153頁121Bcl-2與病理分級結(jié)腸癌高分化（18.11%）結(jié)腸癌中分化（73.49%）結(jié)腸癌低分化（79.33%）第121頁/共153頁122CD44V6與腫瘤轉(zhuǎn)移胃癌原發(fā)灶（14.52%）胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（28.51%）胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（94.28%）第122頁/共153頁細(xì)胞凋亡第123頁/共153頁細(xì)胞凋亡的分析細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是兩個不同的過程細(xì)胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學(xué)檢查DNALadders實驗流式細(xì)胞儀檢查與凋亡相關(guān)的病理過程（HIV、自身免疫性疾病、腫瘤）研究凋亡調(diào)控因素如癌基因、細(xì)胞因子及藥物等對凋亡的影響第124頁/共153頁凋亡檢測-每一步都有檢測試劑盒第125頁/共153頁細(xì)胞凋亡檢測凋亡相關(guān)細(xì)胞膜變化的檢測凋亡相關(guān)線粒體變化的檢測凋亡相關(guān)酶活性的檢測凋亡相關(guān)DNA片段的檢測凋亡相關(guān)基因蛋白的檢測第126頁/共153頁細(xì)胞膜變化的檢測—早期凋亡磷脂酰絲氨酸（PS）外翻，DNA不斷裂線粒體膜電位變化的檢測細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測第127頁/共153頁細(xì)胞膜變化的檢測磷脂酰絲氨酸（PS）的檢測—早期凋亡第128頁/共153頁早期凋亡PS檢測及結(jié)果判斷早期凋亡特征磷脂膜（PS）外翻，但是細(xì)胞膜保持完整性，因此PI染色為陰性DNA沒有發(fā)生斷裂

結(jié)果判定早期凋亡：AnnexinV+/PI-死亡或者晚期凋亡：AnnexinV+/PI+正常的活細(xì)胞：AnnexinV-/PI-第129頁/共153頁ANNEXIN-V/PI檢測第130頁/共153頁131ANNEXIN-V/PI檢測control處理16h后處理24h后第131頁/共153頁線粒體水平檢測相關(guān)產(chǎn)品線粒體膜電位的檢測