高三二輪復習專題二課題一微生物的實驗室培養(yǎng)

專題2微生物的培養(yǎng)與應用課題1微生物的實驗室培養(yǎng)1、微生物（1）特點：形體微小，結構簡單，一般肉眼看不見的低等生物的總稱，通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到一、基礎知識（2）微生物的分類原生生物界原核生物界真菌界變形蟲、草履蟲、衣藻酵母菌、毛霉菌細菌放線菌藍藻支原體衣原體病毒無細胞結構立克次氏體芽孢

有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌。單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌落。

因為細菌的菌落特征(形態(tài)、大小、隆起程度等）因種而異，所以菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落1.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機鹽無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-葡萄糖、淀粉、牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。2、培養(yǎng)基凡能為微生物代謝提供碳元素的物質。①為細胞的生命活動提供能量

②為其他物質的合成提供原料⑴.概念：⑶.作用：⑵.來源：(2)碳源選修一測試一第7、9題凡能為微生物代謝提供氮元素的物質。主要用于合成蛋白質、核酸及含N的代謝產物。⑴.概念：⑵.來源：⑶.作用：(3)水：是生命活動所必需的，生物體內含量最多的化合物(4)無機鹽：為微生物提供除碳、氮以外的元素無機氮源：有機氮源：NH4＋、N2、NO3-（硝化細菌、圓褐固氮菌）牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、氨基酸等(2)氮源選修一測試一第9題⑶.常見的生長因子：⑴.概念：⑵.作用：微生物生長不可缺少的微量有機物。酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、堿基等。有時會加一定量的氯化鈉以維持一定的滲透壓2.特殊營養(yǎng)（生長因子）：3.pH、氧氣、滲透壓的需求：注意：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麥芽汁等天然營養(yǎng)物質中既含有碳源又同時含有氮源、生長因子等營養(yǎng)要素真菌的pH偏酸，細菌的pH偏堿關于微生物營養(yǎng)物質的敘述中，正確的是()A.是碳源的物質不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽D.無機氮源也能提供能量D如蛋白胨如二氧化碳如NaHCO3如NH3提供能量一般是指能參與生物體內的化學反應，一般的物質被氧化可以提供能量。NH3作為還原性物質，可以在生命過程中被氧化從而釋放能量。CO2不是還原性物質，因此不可以在生命過程中被氧化釋放能量。固體培養(yǎng)基（分離鑒定）液體培養(yǎng)基（工業(yè)生產）半固體培養(yǎng)基（觀察運動）（1）按物理性質分類：根據(jù)加入瓊脂的量決定天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基（2）按化學成分分類：根據(jù)成分是否明確eg：牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基（）

葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基（）

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（）天然合成半合成選擇培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入（缺少）某種化學物質,以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長。用以菌種的分離。鑒別培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品。用以菌種的鑒別。例：大腸桿菌伊紅-美藍培養(yǎng)基菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤（3）按功能不同分類：基礎培養(yǎng)基:纖維素分解菌產生透明圈剛果紅染色法含有微生物生長所需的基本物質。選擇培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入（缺少）某種化學物質,以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長。用以菌種的分離。鑒別培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品。用以菌種的鑒別。例：大腸桿菌伊紅-美藍培養(yǎng)基菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤（3）按功能不同分類：基礎培養(yǎng)基:纖維素分解菌產生透明圈剛果紅染色法含有微生物生長所需的基本物質。培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落選擇出沒有抗氨芐青霉素能力的細菌選擇培養(yǎng)基B培養(yǎng)基+氨芐青霉素A培養(yǎng)基

沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出沒有抗氨芐青霉素能力的細菌※幾種選擇培養(yǎng)基①加入青霉素的培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌②不加氮源的無氮培養(yǎng)基分離固氮菌③不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物④加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基

分離金黃色葡萄球菌標準培養(yǎng)基類型配制特點主要應用物理性質固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多微生物的分離、計數(shù)等半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少觀察微生物運動、鑒定菌種、保藏菌種等液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產，連續(xù)培養(yǎng)化學組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，培養(yǎng)基成分明確菌種分類、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學藥品鑒別不同種類的微生物選擇培養(yǎng)基添加（或缺少）某種化學物質

培養(yǎng)、分離出特定的微生物無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。目的：①防止培養(yǎng)物被雜菌污染

②避免感染操作者

③防止污染環(huán)境防止外來雜菌的入侵關鍵：3、無菌技術÷①實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。②用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

（1）無菌的范圍（1）消毒定義：（2）消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別（2）滅菌的定義：是指使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內部的部分微生物（一般不包括芽孢和孢子）。是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物（包括芽胞和孢子）。消毒和滅菌技術的原理是使微生物的蛋白質變性，借此殺死微生物。比較項理化因素的作用強度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分微生物一般不能滅菌強烈全部微生物能消毒與滅菌的比較無菌技術措施的選擇原則①考慮效果：滅菌的效果比消毒要好。②考慮操作對象的承受能力：活體生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用滅菌的方法。（3）常用的消毒方法a、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min（日常用品）b、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（不耐高溫的液體）c、化學藥劑消毒法:用70%酒精進行皮膚消毒;氯氣消毒水源d、紫外線消毒：紫外線能破壞DNA結構，將DNA相鄰的嘧啶相連形成嘧啶二聚體，適量噴灑消毒液可以加強消毒效果（無菌室）選修一測試一第8題（18年全國卷）優(yōu)點：在達到消毒目的的同時，營養(yǎng)物質損失較少a.灼燒滅菌：常用于接種環(huán)、接種針、試管口等的滅菌。（4）常用的滅菌方法酒精燈b.干熱滅菌：p85160-170℃下加熱1-2h。常用于一些耐高溫且需要保持干燥的玻璃器皿和金屬器具。c.高壓蒸汽滅菌：

p85100kPa、121℃下維持15-30min.常用于培養(yǎng)基、無菌水等的滅菌。干熱滅菌箱高壓滅菌鍋請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手思考酒精擦拭消毒干熱滅菌高壓蒸汽滅菌制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1倒平板操作2接種大腸桿菌3大腸桿菌分離后保存4二、實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g將上述物質溶解后，添加水，定容至1000mL配制培養(yǎng)基的操作步驟為:計算→稱量→溶化并調pH→滅菌→倒平板→無菌檢查1.計算：2.稱量：依配方計算100mL培養(yǎng)基所需各成分的用量玻棒挑取牛肉膏于稱量紙上稱取。牛肉膏：0.5g蛋白胨：1.0g、NaCl：0.5g瓊脂：2.0g電子天平注意：稱取牛肉膏和蛋白胨時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋防止吸收空氣中水分

3.溶化并調PH：

牛肉膏、稱量紙、少量水加入燒杯→加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→攪拌溶解→瓊脂→攪拌熔化→補水至100mL后調pH牛肉膏黏稠，保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也溶于水中，減少誤差作為凝固劑防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂使蛋白胨和氯化鈉溶解先定容后調pH

培養(yǎng)基裝入錐形瓶，加棉塞，包牛皮紙扎緊，高壓蒸汽滅菌；防止污染和揮發(fā)滅菌時避免水蒸氣浸濕棉塞，取出培養(yǎng)基時，也起到隔絕空氣中雜菌的作用培養(yǎng)皿5～8套作一包，放于干熱滅菌箱內滅菌。4.滅菌：1）2）3）4）2）右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。3）用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上皿蓋。4）等待平板冷卻凝固（約需5～10min）。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。1）將培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。倒平板注意事項：①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置①防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染②使培養(yǎng)基表面的水分更好揮發(fā)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基6.無菌檢查：37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h

，無雜菌污染才可用來接種.

培養(yǎng)基滅菌后，需冷卻到什么時候，才能用來倒平板？約50℃為什么這樣操作？為什么平板需倒置？5.倒平板：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？用手觸摸，剛剛不燙手時2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？灼燒滅菌，防止瓶口的微生物的污染培養(yǎng)基既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好的揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染。3.為什么將平板倒置？4.在倒平板的過程中，不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。5.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？未接種的培養(yǎng)基（空白培養(yǎng)基）在恒溫箱中保溫一段時間后，如果無菌落生長，說明培養(yǎng)基制備成功、合格，未受到污染。設計空白培養(yǎng)基的目的就是檢查培養(yǎng)基是否滅菌徹底。單個細胞單個菌落微生物群分散或稀釋（二）純化大腸桿菌

原理：

方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法（1）平板劃線法

通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體稱菌落。分區(qū)劃線法（每次都要灼燒）連續(xù)劃線法（不用多次灼燒）聚集的菌群連續(xù)劃線稀釋分散單個細胞單個菌落生長繁殖取決于接種環(huán)上的菌數(shù)1.灼燒接種環(huán)，直至將接種環(huán)燒紅2.在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞3.試管口通過火焰4.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液6.將皿蓋打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內，劃三至五條條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。5.試管通過火焰，并塞上棉塞火焰冷卻7.灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開始往第二區(qū)域內劃線。重復以上操作，在三、四區(qū)域內劃線。末端8.將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置1）一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；2）存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。劃3個平板（重復實驗）1個不劃線（空白對照）微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)注意：平板劃線法的要點：2、接種前，每次劃線前及接種后都要灼燒接種環(huán)3、接種環(huán)灼燒后等其冷卻后再進行劃線4、第二次及其之后的劃線操作，總是從上一次劃線的末端開始劃線1、接種環(huán)只蘸一次菌液問題討論①操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物。②殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，保證使下一次劃線時，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。③及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。四、純化大腸桿菌1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。問題討論四、純化大腸桿菌平板劃線操作區(qū)域一區(qū)域二區(qū)域三區(qū)域四區(qū)域五菌種多菌種少菌種減少菌種減少菌種減少菌種最少思考：平板劃線操作的整個過程，是如何實現(xiàn)純化大腸桿菌的？兩區(qū)不可相連接最后一次劃線已經將細菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次劃線相連則增加了細菌的數(shù)目，得不到純化的效果。注意：若用記號筆標記培養(yǎng)皿中菌落時，應標記在皿底上。3個劃線平板1個不劃線平板（重復實驗：避免偶然因素對實驗結果的影響）（空白對照：排除非測試因素對實驗結果的影響。）p22培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)（在培養(yǎng)基皿底標注菌種及接種日期等信息）放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h設計空白培養(yǎng)基的目的就是檢查培養(yǎng)基是否滅菌徹底。①系列稀釋操作：②涂布平板操作：聚集的微生物單個細胞單個菌落操作：稀釋涂布平板法涂布器1、將分別盛有9ml無菌水的6支試管滅菌，并按101～106順序編號。2、用移液管吸取1ml菌液，注入101倍稀釋的試管中，吹吸三次，使菌液與水充分混勻。依次類推，直至完成最后一支試管的稀釋P19頁。注意：移液管需要經過滅菌。操作時，試管口和移液管應在離火焰1∽2cm處。①系列梯度稀釋操作