基因工程制藥復(fù)習(xí)

名詞解釋雜交核酸分子雜交技術(shù)：具一定同源性的兩條（DNA或RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強度等條件下，可按堿基互補配對原則特異性地復(fù)性，形成雙鏈。探針：一段序列已知的單鏈核酸片段，通過互補的方式檢測單鏈核苷酸序列。粘粒粘粒載體（cos質(zhì)粒載體）：Cos質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的具有λ-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體。同尾酶：辨認的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等。同裂酶：來源不同的內(nèi)切酶，辨認和切割的是同樣的核苷酸靶序列的酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別，用來研究甲基化作用。cDNA文庫：某生物mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA片段分別與合適的克隆載體相連，通過轉(zhuǎn)化貯存在一種受體菌的群體之中，把這種包含某生物基因組所有基因cDNA的受體菌群體，稱為該生物cDNA文庫?；蚬こ趟幬铮褐高\用基因工程技術(shù)研制和生產(chǎn)的藥物，重要涉及重組蛋白（多肽）藥物、反義核酸藥物、DNA藥物和基因工程抗體等。鹽析鹽析一般是指溶液中加入無機鹽類而使某種物質(zhì)溶解度減少而析出的過程。星活性星號（*）活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的辨認和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“星活性”現(xiàn)象。EcoRI*代表EcoRI的星號活力。星活性的特點：限制酶辨認序列特異性減少例如：EcoRI（高pH值或低鹽離子強度）5’GAATTC3’變成5’NAATTN3’，另有一種情況是對AATT中的A、T分辨不嚴(yán)格。簡答題如何克隆微生物的纖溶酶基因？PCR法分離目的基因：根據(jù)核酸序列的相關(guān)信息，設(shè)計簡并引物，通過對mRNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，然后將目的基因通過PCR方法擴增，或者直接從基因組DNA擴增的方法。根據(jù)已知探針克隆基因：一方面將探針作放射性或非放射性標(biāo)記，再將其與用不同內(nèi)切酶解決的基因組DNA雜交，最后將所辨認的片段從膠中切下來，克隆到特定的載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒）中作序列測定或功能分析。這種方法不僅可以將基因克隆出來，還能同時觀測該基因在基因組中的拷貝數(shù)。但在探針雜交后，要注意高強度漂洗，以避免干擾信號，即保證克隆的特異性，同時節(jié)省時間。用特異抗體克隆基因：在獲取抱負的抗體后，可以用這些抗體篩選表達型基因組文庫或cDNA

文庫，從文庫中將編碼某一特異蛋白質(zhì)的基因克隆出來。若控制該性狀的目的蛋白質(zhì)不容易分離純化，則PCR方法比較適宜，若蛋白質(zhì)分離純化容易，且有現(xiàn)成的基因文庫，則后兩種方法較為簡樸。獲得目的基因的途徑有哪些？一、化學(xué)合成法（一）化學(xué)合成法的單元操作從反映機理上分為：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、自動化合成法操作過程：液相合成、固相合成化學(xué)合成一般由專門的公司完畢，也可以通過基因合成儀自己完畢。（二）基因組裝戰(zhàn)略1、小片段粘接法：根據(jù)目的基因全序列，分別合成12~15堿基長的單鏈DNA小片段。預(yù)先設(shè)計合成的片段之間都有互補區(qū)域，不同片段之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。2、補丁延長法：根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12~15堿基長的單鏈DNA小片段以及20~30堿基長的單鏈DNA中片段。預(yù)先設(shè)計合成的短片段與長片段的某段序列互補。3、大片段酶促法：根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40~50堿基長的單鏈DNA片段。預(yù)先設(shè)計的片段之間有局部互補區(qū)，可以互相作為另一個片段延長的引物。（三）DNA化學(xué)合成的用途合整天然基因：胰島素基因、干擾素等有些基因比較短，化學(xué)合成費用較低。修飾改造基因，設(shè)計新型基因“人造兒”2023，5.20，美國64歲科學(xué)家2023耗資4000萬美元用電腦進行基因設(shè)計改造后，用化學(xué)方法合成基因后導(dǎo)入到支原體細菌，DNA象正常細菌的基因同樣進行復(fù)制——人造生命誕生。制備探針、引物、接頭定點突變合成：合成帶有定點突變的基因片段二、PCR技術(shù)（多聚酶鏈?zhǔn)椒从常┇@得目的基因缺陷：DNA聚合酶不能耐受高溫，每個循環(huán)需額外添加DNA聚合酶。1、已知序列基因的分離（1）已知序列是DNA片段根據(jù)研究的目的，通過已知DNA序列設(shè)計相應(yīng)引物，直接運用PCR方法進行分離。根據(jù)已知序列克隆基因?qū)σ阎蛄械幕蚩寺∈腔蚩寺》椒ㄖ凶顬楹啽愕囊环N。目前，世界上重要的基因庫有：EMBL，為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實驗室的基因庫Genbank，為設(shè)在美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫Swissport和TREMBL，Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫，其所含序列的準(zhǔn)確度比較高，而TREMBL只具有從EMBL庫中翻譯過來的序列（2）若已知基因的mRNA序列，如何克隆該基因？一方面要分離（或純化）mRNAA：根據(jù)mRNA序列直接設(shè)計引物B：根據(jù)mRNA序列設(shè)計一條引物和OligoT/A引物進行PCR擴增C：逆轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板，進行PCR擴增……2、未知序列基因的分離（1）序列在其他物種上已有報道具體做法：一方面找出上述幾個物種的PDS基因序列，進行比對尋找出其保守序列，根據(jù)保守序列設(shè)計引物（或簡并引物）PCR擴增（DNA或RNA為模板）如何根據(jù)蛋白序列克隆基因？（2）已知部分序列，但不完全可采用RACE技術(shù)cDNA末端快速擴增技術(shù)是基于PCR技術(shù)由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法。3’RACE原理運用mRNA的3’末端的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。然后用一個基因特異引物GSP1作為上游引物，用一個具有部分接頭序列的通用引物UPM作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因3’末端的DNA片段擴增出來。5’RACE原理先運用mRNA的3’末端的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以O(shè)ligo（dT）30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。運用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達成第一鏈的5’末端時自動加上3~5個（dC）殘基，退火后（dC）殘基與具有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭。然后用一個具有部分接頭序列的通用引物UPM作為上游引物，用一個基因特異引物2（GSP2）作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因5’末端的cDNA片段擴增出來。最終，從2個有互相重疊序列的3’/5’-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過度析RACE產(chǎn)物的3’和5’端序列，合成相應(yīng)引物擴增出全長cDNA。（2）序列未報道反向PCR：根據(jù)已知DNA區(qū)的序列設(shè)計引物，以包含已知區(qū)和未知區(qū)的環(huán)化DNA分子為模板來擴增未知DNA區(qū)序列的PCR技術(shù)。TAIL-PCR，即交錯式熱不對稱PCR，是一種染色體步移技術(shù)。根據(jù)已知DNA序列，分別設(shè)計三條同向且退火溫度較高的特異性引物，與通過獨特設(shè)計的退火溫度較低的兼并引物（可以設(shè)計多條），進行熱不對稱PCR。通常情況下，其中至少有一種兼并引物可以與特異性引物之間運用退火溫度的差異進行熱不對稱PCR反映，一般通過三次巢式PCR反映即可獲取已知序列的側(cè)翼序列。假如一次實驗獲取的長度不能滿足實驗規(guī)定期，還可以根據(jù)第一次步移獲取的序列信息，繼續(xù)進行側(cè)翼序列獲取。隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，以PCR途徑獲得目的基因的重要性更加突出！三、基因文庫法獲得目的基因基因庫：特定生物體全基因組的集合（天然存在）。每個種群都具有其獨特的基因庫。基因文庫：通過克隆的方法將某一基因組DNA或mRNA保存于適當(dāng)宿主菌中形成的轉(zhuǎn)化子群。所有重組DNA組合代表該基因組的全序列。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫和cDNA文庫（一）基因文庫的容量和完備性在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表達：N=ln（1-P）/ln（1-f）P=任一基因被克隆（存在于基因文庫中）的概率F=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小影響因素：基因組大小、目的基因在基因組中的拷貝數(shù)、克隆載體的容量及目的基因的大小基因文庫的完備性：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率。完備性越高，文庫容量越大。例：人的單倍體DNA總長為2.9×109bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克隆；而當(dāng)完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆。（二）抱負基因文庫條件1、完備性高，篩選任一基因的概率均應(yīng)為99%2、重組克隆的總數(shù)不宜過大3、載體的裝載量最佳大于基因的長度4、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域5、克隆片段易于從載體分子上完整卸下6、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選（三）基因組文庫及其構(gòu)建程序基因組文庫：包含某種生物基因組所有遺傳信息的一系列DNA片段，通過克隆載體貯存在一種受體菌的群體中，這個群體稱為這種生物的基因組文庫。文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋該生物的整個基因組?；蚪M文庫的構(gòu)建程序1、基因組DNA的制備和切割（保證DNA片段之間存在部分重疊；DNA片段大小均一）超聲波解決；限制性內(nèi)切酶部分酶切2、載體和受體的選擇載體：λ-DNA或cosmid質(zhì)粒，大型基因組使用YAC或BAC受體：大腸桿菌或酵母菌3、DNA片段和載體的相連直接連接、人工接頭或同聚物加尾4、重組體轉(zhuǎn)化宿主細胞，構(gòu)建形成了基因組文庫的初庫5、初庫擴增形成終庫把培養(yǎng)皿上的細菌所有洗下加以保存（四）cDNA文庫定義：某生物mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA片段分別與合適的克隆載體相連，通過轉(zhuǎn)化貯存在一種受體菌的群體之中，把這種包含某生物基因組所有基因cDNA的受體菌群體，稱為該生物cDNA文庫。cDNA文庫的特點是什么？（1）不含內(nèi)含子序列；（2）可以在細菌中直接表達；（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因；（4）比DNA文庫小，容易構(gòu)建（五）從文庫中篩選目的基因探針法：雜交；陽性克??；質(zhì)粒提取純化；酶切或測序驗證PCR法：設(shè)計引物；PCR；電泳檢測；質(zhì)粒提取純化；酶切或測序驗證其他方法四、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法獲得目的基因轉(zhuǎn)座子：指位于染色體上可以從基因組的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置的DNA片段或基因。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法獲得目的基因流程五、圖位克隆獲得目的基因圖位克隆：又叫定位克隆根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行分離基因，無需預(yù)先知道基因的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達產(chǎn)物的有關(guān)信息。可通過染色體步移技術(shù)逐步逼近目的基因。六、mRNA差別顯示技術(shù)獲得差異表達的基因mRNA差別顯示技術(shù)：對組織特異性或誘導(dǎo)專一性表達基因進行分離的有效方法之一。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)互相結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，也稱為DDRT-PCR。七、酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因酵母雙雜交系統(tǒng)：將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子（如GAL4等）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建成融合表達載體，從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)互相作用的系統(tǒng)。功能：有效地分離能與一種已知的誘餌蛋白互相作用的蛋白質(zhì)。八、生物信息技術(shù)分離和鑒定目的基因電子克隆電子克隆技術(shù)以數(shù)學(xué)為核心，以計算機和互聯(lián)網(wǎng)為工具，運用現(xiàn)有的表達序列標(biāo)簽（EST）和生物信息數(shù)據(jù)庫，可以加速對人類基因組未知功能新基因的發(fā)掘，為人類功能基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供新的線索和基礎(chǔ)。運用電子克隆并結(jié)合實驗驗證可以糾正或避免現(xiàn)有的人類基因組編碼序列錯誤。限制性內(nèi)切酶的特點（掌握如何從給出的序列中尋找酶切位點）。核酸限制性內(nèi)切酶的類型及重要特性Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性在DNA雙鏈的特異性辨認序列部位切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂；兩個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的；因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補的單鏈延伸末端。限制酶的其它特性限制酶辨認靶序列同DNA的來源無關(guān)；限制酶辨認靶序列是唯一的（對某種限制酶只具一個限制性切割位點）。在三個限制與修飾系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相稱高的核苷酸辨認特異性，因而被廣泛用于基因工程中。Ⅱ型在限制與修飾系統(tǒng)所占的比例達成93%。它們辨認回文對稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶3’-羥基和5’-磷酸基團的DNA產(chǎn)物，需Mg2+的存在才干發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。辨認序列一般為4-6bp，切割位置因酶而異。II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點1、辨認位點的特異性：每種酶都有其特定的DNA辨認。位點，通常是由4~8個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。2、辨認序列的對稱性：靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點的規(guī)范性：交錯切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性辨認序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都可以辨認由4~8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其辨認序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些辨認序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點或靶序列。辨認序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的（如GANTC）兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)?；匚慕Y(jié)構(gòu)：雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝兩個方向讀序列是完全同樣的。序列正讀和反讀是同樣的。什么是回文序列？雙鏈DNA中的一段倒置反復(fù)序列，當(dāng)該序列的雙鏈被打開后，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這段序列被稱為回文序列。切割方式Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3’位酯鍵產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是5’-P和3’-OH，產(chǎn)生3種不同的切口。補：位點偏愛某些限制酶對不同位置的同一個辨認序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點偏愛。λ噬菌體DNA全長48502bp，有5個EcoRⅠ酶切位點。切割時并非在5個位點隨機進行，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快10倍。導(dǎo)致位點偏愛現(xiàn)象的因素限制酶在切割DNA之前需要同時與兩個辨認位點作用；限制酶對規(guī)定作用的DNA序列有兩個明顯不同的結(jié)合位點，其中一個是為DNA切割時激活另一個的變構(gòu)位點。PCR的類型及其應(yīng)用（舉例介紹）。PCR的類型及應(yīng)用一、PCR的類型重組PCR不對稱PCR反向PCR多重PCR原位PCRRT－PCR巢式PCR遞減PCR熱啟動PCR實時定量PCR1、巢式PCR用第2對引物來驗證用第1對引物所擴增的PCR產(chǎn)物3、熱啟動PCR（HotStartPCR）熱啟動重要是通過克制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達成變性溫度；現(xiàn)在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，該酶具有熱啟動的性能，使用簡樸方便，適合于高通量應(yīng)用；熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。4、RT-PCR逆（反）轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成第1條cDNA鏈，然后通過PCR反映擴增出許多cDNA分子拷貝。RT-PCR是擴增mRNA的快速及靈敏的方法。檢測某一基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達克隆特異的cDNA5、qRT-PCR，RealTimeQuantitativePCR在PCR反映體系中加入熒光報告基團，運用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR反映進程，對擴增的PCR產(chǎn)物進行定量分析的方法?！ぞ哂懈叨让舾行裕河糜跈z測微量的DNA或RNA樣品；·檢測每一次PCR循環(huán)中產(chǎn)物的積累；·擴增反映結(jié)束后不需要對PCR產(chǎn)物進行電泳。二、PCR的應(yīng)用研究：基因克隆，DNA測序，分析突變診斷：細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程：遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達圖譜法醫(yī)：犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析腫瘤：各種腫瘤檢測其他……電泳上樣緩沖液的作用有哪些？上樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。三個作用：1）增長樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程3）指示劑（染料）在電場中的遷移可認為預(yù)測樣品的遷移位置作參考如何估算引物的Tm值？Tm值：就是DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。或者：DNA在加熱變性過程中，紫外吸取值達成最大值的50%時的溫度稱為核酸的變性溫度或解鏈溫度，用Tm表達。不同序列的DNA，Tm值不同DNA中G/C含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系Tm值與溶劑性質(zhì)有關(guān)：離子強度低，Tm值低Tm值的計算：1)長度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：Tm=