基因工程制藥復(fù)習(xí)

名詞解釋雜交核酸分子雜交技術(shù)：具一定同源性的兩條（DNA或RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性地復(fù)性，形成雙鏈。探針：一段序列已知的單鏈核酸片段，通過互補(bǔ)的方式檢測(cè)單鏈核苷酸序列。粘粒粘粒載體（cos質(zhì)粒載體）：Cos質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的具有λ-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體。同尾酶：辨認(rèn)的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等。同裂酶：來源不同的內(nèi)切酶，辨認(rèn)和切割的是同樣的核苷酸靶序列的酶。不同同裂酶對(duì)位點(diǎn)的甲基化敏感性有差別，用來研究甲基化作用。cDNA文庫：某生物mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA片段分別與合適的克隆載體相連，通過轉(zhuǎn)化貯存在一種受體菌的群體之中，把這種包含某生物基因組所有基因cDNA的受體菌群體，稱為該生物cDNA文庫?；蚬こ趟幬铮褐高\(yùn)用基因工程技術(shù)研制和生產(chǎn)的藥物，重要涉及重組蛋白（多肽）藥物、反義核酸藥物、DNA藥物和基因工程抗體等。鹽析鹽析一般是指溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度減少而析出的過程。星活性星號(hào)（*）活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的辨認(rèn)和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“星活性”現(xiàn)象。EcoRI*代表EcoRI的星號(hào)活力。星活性的特點(diǎn)：限制酶辨認(rèn)序列特異性減少例如：EcoRI（高pH值或低鹽離子強(qiáng)度）5’GAATTC3’變成5’NAATTN3’，另有一種情況是對(duì)AATT中的A、T分辨不嚴(yán)格。簡(jiǎn)答題如何克隆微生物的纖溶酶基因？PCR法分離目的基因：根據(jù)核酸序列的相關(guān)信息，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，然后將目的基因通過PCR方法擴(kuò)增，或者直接從基因組DNA擴(kuò)增的方法。根據(jù)已知探針克隆基因：一方面將探針作放射性或非放射性標(biāo)記，再將其與用不同內(nèi)切酶解決的基因組DNA雜交，最后將所辨認(rèn)的片段從膠中切下來，克隆到特定的載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒）中作序列測(cè)定或功能分析。這種方法不僅可以將基因克隆出來，還能同時(shí)觀測(cè)該基因在基因組中的拷貝數(shù)。但在探針雜交后，要注意高強(qiáng)度漂洗，以避免干擾信號(hào)，即保證克隆的特異性，同時(shí)節(jié)省時(shí)間。用特異抗體克隆基因：在獲取抱負(fù)的抗體后，可以用這些抗體篩選表達(dá)型基因組文庫或cDNA

文庫，從文庫中將編碼某一特異蛋白質(zhì)的基因克隆出來。若控制該性狀的目的蛋白質(zhì)不容易分離純化，則PCR方法比較適宜，若蛋白質(zhì)分離純化容易，且有現(xiàn)成的基因文庫，則后兩種方法較為簡(jiǎn)樸。獲得目的基因的途徑有哪些？一、化學(xué)合成法（一）化學(xué)合成法的單元操作從反映機(jī)理上分為：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、自動(dòng)化合成法操作過程：液相合成、固相合成化學(xué)合成一般由專門的公司完畢，也可以通過基因合成儀自己完畢。（二）基因組裝戰(zhàn)略1、小片段粘接法：根據(jù)目的基因全序列，分別合成12~15堿基長的單鏈DNA小片段。預(yù)先設(shè)計(jì)合成的片段之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不同片段之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)的完整雙鏈。2、補(bǔ)丁延長法：根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成12~15堿基長的單鏈DNA小片段以及20~30堿基長的單鏈DNA中片段。預(yù)先設(shè)計(jì)合成的短片段與長片段的某段序列互補(bǔ)。3、大片段酶促法：根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40~50堿基長的單鏈DNA片段。預(yù)先設(shè)計(jì)的片段之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可以互相作為另一個(gè)片段延長的引物。（三）DNA化學(xué)合成的用途合整天然基因：胰島素基因、干擾素等有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低。修飾改造基因，設(shè)計(jì)新型基因“人造兒”2023，5.20，美國64歲科學(xué)家2023耗資4000萬美元用電腦進(jìn)行基因設(shè)計(jì)改造后，用化學(xué)方法合成基因后導(dǎo)入到支原體細(xì)菌，DNA象正常細(xì)菌的基因同樣進(jìn)行復(fù)制——人造生命誕生。制備探針、引物、接頭定點(diǎn)突變合成：合成帶有定點(diǎn)突變的基因片段二、PCR技術(shù)（多聚酶鏈?zhǔn)椒从常┇@得目的基因缺陷：DNA聚合酶不能耐受高溫，每個(gè)循環(huán)需額外添加DNA聚合酶。1、已知序列基因的分離（1）已知序列是DNA片段根據(jù)研究的目的，通過已知DNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，直接運(yùn)用PCR方法進(jìn)行分離。根據(jù)已知序列克隆基因?qū)σ阎蛄械幕蚩寺∈腔蚩寺》椒ㄖ凶顬楹?jiǎn)便的一種。目前，世界上重要的基因庫有：EMBL，為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基因庫Genbank，為設(shè)在美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫Swissport和TREMBL，Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫，其所含序列的準(zhǔn)確度比較高，而TREMBL只具有從EMBL庫中翻譯過來的序列（2）若已知基因的mRNA序列，如何克隆該基因？一方面要分離（或純化）mRNAA：根據(jù)mRNA序列直接設(shè)計(jì)引物B：根據(jù)mRNA序列設(shè)計(jì)一條引物和OligoT/A引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增C：逆轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增……2、未知序列基因的分離（1）序列在其他物種上已有報(bào)道具體做法：一方面找出上述幾個(gè)物種的PDS基因序列，進(jìn)行比對(duì)尋找出其保守序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物（或簡(jiǎn)并引物）PCR擴(kuò)增（DNA或RNA為模板）如何根據(jù)蛋白序列克隆基因？（2）已知部分序列，但不完全可采用RACE技術(shù)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)是基于PCR技術(shù)由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法。3’RACE原理運(yùn)用mRNA的3’末端的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。然后用一個(gè)基因特異引物GSP1作為上游引物，用一個(gè)具有部分接頭序列的通用引物UPM作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3’末端的DNA片段擴(kuò)增出來。5’RACE原理先運(yùn)用mRNA的3’末端的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以O(shè)ligo（dT）30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。運(yùn)用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)成第一鏈的5’末端時(shí)自動(dòng)加上3~5個(gè)（dC）殘基，退火后（dC）殘基與具有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對(duì)后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭。然后用一個(gè)具有部分接頭序列的通用引物UPM作為上游引物，用一個(gè)基因特異引物2（GSP2）作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因5’末端的cDNA片段擴(kuò)增出來。最終，從2個(gè)有互相重疊序列的3’/5’-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過度析RACE產(chǎn)物的3’和5’端序列，合成相應(yīng)引物擴(kuò)增出全長cDNA。（2）序列未報(bào)道反向PCR：根據(jù)已知DNA區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，以包含已知區(qū)和未知區(qū)的環(huán)化DNA分子為模板來擴(kuò)增未知DNA區(qū)序列的PCR技術(shù)。TAIL-PCR，即交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR，是一種染色體步移技術(shù)。根據(jù)已知DNA序列，分別設(shè)計(jì)三條同向且退火溫度較高的特異性引物，與通過獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低的兼并引物（可以設(shè)計(jì)多條），進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR。通常情況下，其中至少有一種兼并引物可以與特異性引物之間運(yùn)用退火溫度的差異進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反映，一般通過三次巢式PCR反映即可獲取已知序列的側(cè)翼序列。假如一次實(shí)驗(yàn)獲取的長度不能滿足實(shí)驗(yàn)規(guī)定期，還可以根據(jù)第一次步移獲取的序列信息，繼續(xù)進(jìn)行側(cè)翼序列獲取。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以PCR途徑獲得目的基因的重要性更加突出！三、基因文庫法獲得目的基因基因庫：特定生物體全基因組的集合（天然存在）。每個(gè)種群都具有其獨(dú)特的基因庫?；蛭膸欤和ㄟ^克隆的方法將某一基因組DNA或mRNA保存于適當(dāng)宿主菌中形成的轉(zhuǎn)化子群。所有重組DNA組合代表該基因組的全序列。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫和cDNA文庫（一）基因文庫的容量和完備性在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表達(dá)：N=ln（1-P）/ln（1-f）P=任一基因被克隆（存在于基因文庫中）的概率F=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小影響因素：基因組大小、目的基因在基因組中的拷貝數(shù)、克隆載體的容量及目的基因的大小基因文庫的完備性：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率。完備性越高，文庫容量越大。例：人的單倍體DNA總長為2.9×109bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個(gè)克隆；而當(dāng)完備性提高到0.9999時(shí)，基因文庫至少需要180萬個(gè)克隆。（二）抱負(fù)基因文庫條件1、完備性高，篩選任一基因的概率均應(yīng)為99%2、重組克隆的總數(shù)不宜過大3、載體的裝載量最佳大于基因的長度4、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域5、克隆片段易于從載體分子上完整卸下6、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選（三）基因組文庫及其構(gòu)建程序基因組文庫：包含某種生物基因組所有遺傳信息的一系列DNA片段，通過克隆載體貯存在一種受體菌的群體中，這個(gè)群體稱為這種生物的基因組文庫。文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋該生物的整個(gè)基因組?；蚪M文庫的構(gòu)建程序1、基因組DNA的制備和切割（保證DNA片段之間存在部分重疊；DNA片段大小均一）超聲波解決；限制性內(nèi)切酶部分酶切2、載體和受體的選擇載體：λ-DNA或cosmid質(zhì)粒，大型基因組使用YAC或BAC受體：大腸桿菌或酵母菌3、DNA片段和載體的相連直接連接、人工接頭或同聚物加尾4、重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，構(gòu)建形成了基因組文庫的初庫5、初庫擴(kuò)增形成終庫把培養(yǎng)皿上的細(xì)菌所有洗下加以保存（四）cDNA文庫定義：某生物mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA片段分別與合適的克隆載體相連，通過轉(zhuǎn)化貯存在一種受體菌的群體之中，把這種包含某生物基因組所有基因cDNA的受體菌群體，稱為該生物cDNA文庫。cDNA文庫的特點(diǎn)是什么？（1）不含內(nèi)含子序列；（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)；（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因；（4）比DNA文庫小，容易構(gòu)建（五）從文庫中篩選目的基因探針法：雜交；陽性克隆；質(zhì)粒提取純化；酶切或測(cè)序驗(yàn)證PCR法：設(shè)計(jì)引物；PCR；電泳檢測(cè)；質(zhì)粒提取純化；酶切或測(cè)序驗(yàn)證其他方法四、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法獲得目的基因轉(zhuǎn)座子：指位于染色體上可以從基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置的DNA片段或基因。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法獲得目的基因流程五、圖位克隆獲得目的基因圖位克?。河纸卸ㄎ豢寺「鶕?jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行分離基因，無需預(yù)先知道基因的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息。可通過染色體步移技術(shù)逐步逼近目的基因。六、mRNA差別顯示技術(shù)獲得差異表達(dá)的基因mRNA差別顯示技術(shù)：對(duì)組織特異性或誘導(dǎo)專一性表達(dá)基因進(jìn)行分離的有效方法之一。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)互相結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，也稱為DDRT-PCR。七、酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因酵母雙雜交系統(tǒng)：將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子（如GAL4等）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)互相作用的系統(tǒng)。功能：有效地分離能與一種已知的誘餌蛋白互相作用的蛋白質(zhì)。八、生物信息技術(shù)分離和鑒定目的基因電子克隆電子克隆技術(shù)以數(shù)學(xué)為核心，以計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)為工具，運(yùn)用現(xiàn)有的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）和生物信息數(shù)據(jù)庫，可以加速對(duì)人類基因組未知功能新基因的發(fā)掘，為人類功能基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供新的線索和基礎(chǔ)。運(yùn)用電子克隆并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可以糾正或避免現(xiàn)有的人類基因組編碼序列錯(cuò)誤。限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)（掌握如何從給出的序列中尋找酶切位點(diǎn)）。核酸限制性內(nèi)切酶的類型及重要特性Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性在DNA雙鏈的特異性辨認(rèn)序列部位切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂；兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的；因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。限制酶的其它特性限制酶辨認(rèn)靶序列同DNA的來源無關(guān)；限制酶辨認(rèn)靶序列是唯一的（對(duì)某種限制酶只具一個(gè)限制性切割位點(diǎn)）。在三個(gè)限制與修飾系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相稱高的核苷酸辨認(rèn)特異性，因而被廣泛用于基因工程中。Ⅱ型在限制與修飾系統(tǒng)所占的比例達(dá)成93%。它們辨認(rèn)回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶3’-羥基和5’-磷酸基團(tuán)的DNA產(chǎn)物，需Mg2+的存在才干發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。辨認(rèn)序列一般為4-6bp，切割位置因酶而異。II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點(diǎn)1、辨認(rèn)位點(diǎn)的特異性：每種酶都有其特定的DNA辨認(rèn)。位點(diǎn)，通常是由4~8個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。2、辨認(rèn)序列的對(duì)稱性：靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性：交錯(cuò)切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性辨認(rèn)序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都可以辨認(rèn)由4~8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其辨認(rèn)序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些辨認(rèn)序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)或靶序列。辨認(rèn)序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的（如GANTC）兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)。回文結(jié)構(gòu)：雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝兩個(gè)方向讀序列是完全同樣的。序列正讀和反讀是同樣的。什么是回文序列？雙鏈DNA中的一段倒置反復(fù)序列，當(dāng)該序列的雙鏈被打開后，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這段序列被稱為回文序列。切割方式Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3’位酯鍵產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是5’-P和3’-OH，產(chǎn)生3種不同的切口。補(bǔ)：位點(diǎn)偏愛某些限制酶對(duì)不同位置的同一個(gè)辨認(rèn)序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。λ噬菌體DNA全長48502bp，有5個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。切割時(shí)并非在5個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)進(jìn)行，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍。導(dǎo)致位點(diǎn)偏愛現(xiàn)象的因素限制酶在切割DNA之前需要同時(shí)與兩個(gè)辨認(rèn)位點(diǎn)作用；限制酶對(duì)規(guī)定作用的DNA序列有兩個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)是為DNA切割時(shí)激活另一個(gè)的變構(gòu)位點(diǎn)。PCR的類型及其應(yīng)用（舉例介紹）。PCR的類型及應(yīng)用一、PCR的類型重組PCR不對(duì)稱PCR反向PCR多重PCR原位PCRRT－PCR巢式PCR遞減PCR熱啟動(dòng)PCR實(shí)時(shí)定量PCR1、巢式PCR用第2對(duì)引物來驗(yàn)證用第1對(duì)引物所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物3、熱啟動(dòng)PCR（HotStartPCR）熱啟動(dòng)重要是通過克制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)成變性溫度；現(xiàn)在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，該酶具有熱啟動(dòng)的性能，使用簡(jiǎn)樸方便，適合于高通量應(yīng)用；熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。4、RT-PCR逆（反）轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成第1條cDNA鏈，然后通過PCR反映擴(kuò)增出許多cDNA分子拷貝。RT-PCR是擴(kuò)增mRNA的快速及靈敏的方法。檢測(cè)某一基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)克隆特異的cDNA5、qRT-PCR，RealTimeQuantitativePCR在PCR反映體系中加入熒光報(bào)告基團(tuán)，運(yùn)用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反映進(jìn)程，對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析的方法?！ぞ哂懈叨让舾行裕河糜跈z測(cè)微量的DNA或RNA樣品；·檢測(cè)每一次PCR循環(huán)中產(chǎn)物的積累；·擴(kuò)增反映結(jié)束后不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。二、PCR的應(yīng)用研究：基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷：細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷人類基因組工程：遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜法醫(yī)：犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析腫瘤：各種腫瘤檢測(cè)其他……電泳上樣緩沖液的作用有哪些？上樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。三個(gè)作用：1）增長樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過程3）指示劑（染料）在電場(chǎng)中的遷移可認(rèn)為預(yù)測(cè)樣品的遷移位置作參考如何估算引物的Tm值？Tm值：就是DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度?；蛘撸篋NA在加熱變性過程中，紫外吸取值達(dá)成最大值的50%時(shí)的溫度稱為核酸的變性溫度或解鏈溫度，用Tm表達(dá)。不同序列的DNA，Tm值不同DNA中G/C含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系Tm值與溶劑性質(zhì)有關(guān)：離子強(qiáng)度低，Tm值低Tm值的計(jì)算：1)長度為25mer以下的引物，Tm計(jì)算公式為：Tm=