生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)總結(jié)材料

生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)材料

（加粗內(nèi)容重點(diǎn)掌握）

一、課程要求

1.通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)達(dá)到了解和掌握現(xiàn)代生物技術(shù)制藥的基本知識(shí)概念,掌握常規(guī)生物制

藥的基本技術(shù)路線(xiàn)和工藝過(guò)程的目的。

2.了解生物藥用資源的知識(shí)背景，把生物資源的科學(xué)利用與藥物研制緊密結(jié)合，培養(yǎng)學(xué)生

的發(fā)明創(chuàng)造能力。

二、知識(shí)歸納

第一章：概述

1.生物技術(shù)概念：以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科

學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類(lèi)生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種

目的的技術(shù)。

2.生物技術(shù)內(nèi)容包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程這四大工程，隨著科技的不

斷發(fā)展所包含的內(nèi)容在不斷擴(kuò)大如：蛋白質(zhì)工程、抗體工程、糖鏈工程、海洋生物技術(shù)、

生物轉(zhuǎn)化等。

3.基因工程是生物技術(shù)的核心和關(guān)鍵，是主導(dǎo)技術(shù)。

細(xì)胞工程是生物技術(shù)的基礎(chǔ)，也是反應(yīng)器。

酶工程是生物技術(shù)的條件。

發(fā)酵工程是生物技術(shù)的獲得最終產(chǎn)品的手段。

4.基因工程：是把不同生物的基因在體外剪切組合，并和載體（如質(zhì)粒、噬菌體、病毒）

DNA連接，然后轉(zhuǎn)入微生物或細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行克隆，并使轉(zhuǎn)入的基因在細(xì)胞或微生物內(nèi)表

達(dá)，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)的技術(shù)。

5.酶工程是利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能，或?qū)γ高M(jìn)行修飾改造，并借

助生物反應(yīng)器和工藝過(guò)程來(lái)生產(chǎn)人類(lèi)所需產(chǎn)品的一項(xiàng)技術(shù)。

6.發(fā)酵工程是一門(mén)利用微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)來(lái)生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)。

所采用的新技術(shù)主要應(yīng)用于3個(gè)方面：工藝改進(jìn),新藥研制和菌種改造。

7.蛋白質(zhì)工程是從改變基因入手制造新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。

8.過(guò)程:找到與新型蛋白質(zhì)基因接近的基因，基因修改/突變，修改后的基因?qū)牍こ叹?/p>

細(xì)胞中生產(chǎn)所需蛋白。

區(qū)別于基因工程：前者改變基因生成新蛋白，后者利用基因拼接技術(shù)生產(chǎn)現(xiàn)有蛋白。

9.抗體工程：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)或分子生物學(xué)手段在體外進(jìn)行遺傳學(xué)操作，改變抗體的遺傳

特性和生物學(xué)特性，獲得所需、有特定生物學(xué)特性和功能的新抗體，或建立能穩(wěn)定獲得高

質(zhì)量和產(chǎn)量抗體的技術(shù)。

10.生物藥物:指包括生物制品在內(nèi)的生物體的初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物或生物體的某一組成部

分，甚至整個(gè)生物體用作診斷和治療的醫(yī)藥品。

11.生物技術(shù)藥物：采用DNA重組技術(shù)或其他生物技術(shù)生產(chǎn)的用于預(yù)防、治療和診斷疾病

的藥物，主要是蛋白質(zhì)或核酸類(lèi)藥物。

“治療藥物：腫瘤壞死因子、胰島素、凝血因子、干

擾素等

1、用途.預(yù)防藥物：疫苗

12.生物技術(shù)藥物分類(lèi)診斷藥物：占絕大多數(shù)；4廢診斷、器官功能標(biāo)志物診所、

.放射性核素診斷、DNA芯片

2、作用類(lèi)型:細(xì)胞因2類(lèi)、激素類(lèi)、梅類(lèi)、疫苗、單

克隆抗體、反義核酸藥物、RNA廣擾藥物、基因治療藥

物。

3、生化特性：多肽類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、核酸類(lèi)、聚二醇化

多肽或蛋白質(zhì)藥物。

13.生物技術(shù)藥物的特性:

1）理化性質(zhì)特性

a.相對(duì)分子量大：幾千、幾萬(wàn)，甚至幾十萬(wàn)；

b.結(jié)構(gòu)復(fù)雜：一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、三維立體結(jié)構(gòu)；

c.穩(wěn)定性差：易受T、pH、化學(xué)試劑、機(jī)械壓力、空氣氧化、光照、表面吸附等影響失活。

2）藥理作用特性

A.活性與作用機(jī)制明確：先明確機(jī)制，后開(kāi)發(fā)藥物；

B.作用針對(duì)性強(qiáng)：特定靶受體、靶器官；

C.毒性低：天然存在或衍生物、生物相容性好；

D.體內(nèi)半衰期短：易被代謝；

E.有種屬特異性：人源、鼠源、豬源等；

F.可產(chǎn)生免疫原性：結(jié)構(gòu)或構(gòu)型上與天然來(lái)源的不同

3）生產(chǎn)制備特性

a.藥物分子在原料中含量低：發(fā)酵；

b.原料液中常存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)：酶；

c.制備工藝條件溫和：目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性差；

d.分離純化困難：結(jié)構(gòu)相近異構(gòu)體

e.易污染：微生物污染、變性（熱源）

4）質(zhì)量控制特性

A.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容：包括基本要求、制造、檢定等；

B.制造項(xiàng)下的特殊規(guī)定：對(duì)于利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生成的生物技術(shù)藥物，在本項(xiàng)下，要寫(xiě)

出工程細(xì)胞的情況；對(duì)于利用工程菌生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物，在本項(xiàng)下要寫(xiě)出工程菌菌

種的情況；本項(xiàng)下還要寫(xiě)出原液和成品的制備方法。

C.檢定項(xiàng)下的特殊規(guī)定：規(guī)定了對(duì)原液、半成品和成品的檢定內(nèi)容和方法。

14.生物技術(shù)制藥概念：指利用基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程等生物技術(shù)的原理

和方法，來(lái)研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)用于預(yù)防、治療和診斷疾病的藥物的一門(mén)科學(xué)。

15.生物技術(shù)制藥業(yè)快速發(fā)展的四十年

第一個(gè)十年(1975—1985)：生物時(shí)代

第二個(gè)十年(1985—1995)：技術(shù)平臺(tái)時(shí)代

第三個(gè)十年(1995—2006)：基因組時(shí)代

第四個(gè)十年(2006—至今)：后基因組時(shí)代

第二章基因工程制藥

1.基因工程:是通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的DNA分子，按照預(yù)先設(shè)計(jì)，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，

從而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，再借助載體，將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，并使目的基

因在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。

2.基因工程制藥的基本過(guò)程

外源基因

位切J拼接(工具酶)

]目的1回大麗相承】+載體

連接(工具酶)[

重組DNA

宿主細(xì)胞懿

工程菌/工程細(xì)胞

|擴(kuò)增

1表達(dá)

目標(biāo)蛋白一?測(cè)

3.基因工程菌的構(gòu)建與篩選的基本方法

>基因工程菌株或細(xì)胞株的構(gòu)建的設(shè)計(jì)思路直接影響后續(xù)的表達(dá)和分離純化，是決定性

的環(huán)節(jié)。

>基因操作中常用的工具酶：限制性?xún)?nèi)切內(nèi)、DNA連接酶、DNA聚合酶、核酸修飾酶

>限制性?xún)?nèi)切酶：常用的是II型限制性?xún)?nèi)切酶

>DNA連接酶僅能鏈接缺口不能連接裂口而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子

的一部分。

>DNA連接酶一大腸桿菌的DNA連接酶,需NAD+做輔助因子

T4DNA連接酶，需ATP做輔助因子

>DNA聚合聚一大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow大片斷酶、TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)

錄酶等。

>核酸修飾酶一末端轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、T4多核昔酸激酶

4.目的基因的制備

問(wèn)題：

為什么不能直接將分離真核細(xì)胞的目的基因，用于產(chǎn)生基因工程藥物？

答案：

目的基因僅占染色體的很小一部分，從染色體直接分離純化目的基因極為困難；

原核細(xì)胞無(wú)RNA加工剪切系統(tǒng)，含有內(nèi)含子的基因組無(wú)法在原核細(xì)胞中表達(dá)。

5.目的基因獲取的方法：化學(xué)合成法、PCR法、基因文庫(kù)法（鳥(niǎo)槍法）、cDNA文庫(kù)法

6.載體

克隆載體：是指能使外源目的基因在宿主細(xì)胞中大量繁殖的功能性載體

常見(jiàn)的載體有質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒等。代表：PBR322

表達(dá)載體：是指能使外源目的基因在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的功能性載體。

常用：質(zhì)粒、噬菌體、cosmid質(zhì)粒

特點(diǎn)：帶表達(dá)元件一轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列

7.載體與目的基因的連接

a.DNA分子體外重組：連接酶催化載體DNA與目的基因DNA片段連接。形成重組子

（recombinant）的過(guò)程。

b.連接方式：粘性末端的連接、平頭末端的連接

8.重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

宿主細(xì)胞：

原核細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌

真核細(xì)胞：酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞

9.常用的基因工程藥物表達(dá)系統(tǒng)

1）原核細(xì)胞

A.大腸桿菌：胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包含體）、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)（原核細(xì)胞

工程菌外源基因表達(dá)的形式）

B.枯草芽抱桿菌：分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體；不

能使蛋白質(zhì)糖基化；有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解。

C.鏈霉菌：不致病、使用安全；分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中；具有糖

基化能力。

?原核細(xì)胞工程菌的目的基因類(lèi)型：CDNA,非基因組DNA,

2）真核細(xì)胞

a.酵母：繁殖迅速，可廉價(jià)的大規(guī)模培養(yǎng)；表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到細(xì)胞外；表達(dá)產(chǎn)物糖基化。

釀酒酵母、畢赤酵母應(yīng)用最多。

b.絲狀真菌：分泌能力強(qiáng)；翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化；成熟的發(fā)酵和后處理工藝。

c.哺乳動(dòng)物細(xì)胞：外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中，產(chǎn)物易純化；產(chǎn)物糖基化，接近或

類(lèi)似于天然產(chǎn)物：生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀。

3）昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒作為載體，具有高度宿主專(zhuān)一性（節(jié)肢動(dòng)物），操作安全

10.提高外源基因表達(dá)效率的有效途徑：

1）優(yōu)化表達(dá)載體的構(gòu)建：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)弱，SD序列和AUG的間距等。

A.啟動(dòng)子的強(qiáng)弱：目的基因插入表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游，可增加基因的表達(dá)。/ac、trp、tac.

B.核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性。

C.SD與AUG的間距：影響非融合蛋白的合成水平。

2）提高稀有密碼子的表達(dá)頻率。設(shè)計(jì)引物或合成基因時(shí)選擇大腸桿菌“偏愛(ài)"的密碼子。

3）提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：組建融合蛋白；利用信號(hào)肽；特異性突變；位點(diǎn)特異突變

改變二硫鍵位置；宿主蛋白酶缺陷。

4）工程菌發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化：細(xì)胞的代謝負(fù)荷：細(xì)胞生長(zhǎng)和外源基因表達(dá)分為兩

個(gè)階段，即宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開(kāi)。優(yōu)化培養(yǎng)條件。

11.重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌方法：化學(xué)轉(zhuǎn)化法：氯化鈣

電轉(zhuǎn)化法：高壓電脈沖

感染法：病毒（噬菌體或包裝病毒）

12.重組DNA導(dǎo)入酵母：化學(xué)轉(zhuǎn)化法：PEG、DMSO

電轉(zhuǎn)化法：山梨醇、電擊

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法：酶消化除壁，PEG/CaCI2

13.重組子的篩選

載體遺傳標(biāo)記法：①抗生素抗性篩選法②互補(bǔ)篩選法

③營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法④噬菌斑篩選法

14.重組子的篩選與鑒定

A.核酸分子雜交法：

既可篩選重組子，也可鑒定目的基因，利用放射性核素或生物素標(biāo)記的探針與目的DNA互

補(bǔ)雜交，從基因組文庫(kù)、CDNA文庫(kù)或者重組質(zhì)粒中直接篩選和鑒定

探針序列可由已知的目的產(chǎn)物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)

特點(diǎn)：高度特異、靈敏度高

14.重組子的篩選與鑒定方法

A.核酸分子雜交法：①菌落（或噬菌斑）原位雜交

②DNA印跡分析(Southernblotting)

?NorthernBlotting（Northern印跡）

B.限制性酶譜分析法

C.DNA序列測(cè)定

D.目的基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定法：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA),westernblotting

15.各種產(chǎn)物表達(dá)形式采用的分離純化方法

基因工程藥物的分離、純化非常重要。表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì)。具有以下特點(diǎn):

①表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低;

②含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物;

③表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；

④表達(dá)產(chǎn)物的種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異;

⑤應(yīng)用面廣，對(duì)其質(zhì)量要求純度高、無(wú)菌、無(wú)熱原。

16.基因工程藥物分離純化的一般流程

發(fā)酵液一細(xì)胞分離

胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物

細(xì)胞破碎

固必離?基閃【.程藥物的分離

純化般包括細(xì)胞破

包含體同質(zhì)發(fā)達(dá)蛋門(mén)可溶性衰達(dá)產(chǎn)物碎、固液分離、濃縮

。初步純化、高度純

化”至內(nèi)到純M以及

___成__品_加__I工__。______________

—初步分離一高度純

A.細(xì)胞分離方法

a.離心:利用固體及液體間的密度差來(lái)實(shí)現(xiàn)分離;

b.膜分離:常規(guī)過(guò)濾、微濾、超濾（微粒與大分子的分離）、反滲透（脫溶劑）、透析

（脫鹽）、電滲透（脫鹽）

,選擇分離純化方法的依據(jù)

B.細(xì)胞破碎方法

＞先濃縮（沉淀、超濾），后色譜

離心沉淀、膜過(guò)濾、雙水相萃?。鞠瘸看箅s質(zhì)（非蛋白），后除難除雜質(zhì)

＞先成本低、快速，后成本高、耗時(shí)

C.固液分離

＞先非特異、低分辨，后特異、高分辨

D.目的產(chǎn)物的分離純化＞工藝銜接：不同分離機(jī)制的方法組合；前

操作單元的產(chǎn)物適合于下一單元的操作，

根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇如：鹽析后一疏水性層析

a.細(xì)胞外分泌蛋白純化前需濃縮

b.周質(zhì)表達(dá)一溶菌酶+滲透裂解

c.細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)一首選親和層析

d.包涵體表達(dá)一洗滌變性復(fù)性

E.表達(dá)產(chǎn)物考察

/基因工程藥物質(zhì)量控制要點(diǎn)：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致

性。

/生物學(xué)活性測(cè)定：效價(jià)測(cè)定、免疫學(xué)活性測(cè)定、體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定、體外生物

學(xué)活性測(cè)定、蛋白質(zhì)的比活。

/蛋白質(zhì)含量測(cè)定：Folin-酚試劑法、染色法、雙縮胭法、紫外吸收法等。

/蛋白質(zhì)純度分析：SDS、等電聚焦、HPLC等

第三章：動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

1.學(xué)習(xí)要求

掌握細(xì)胞工程制藥、動(dòng)物以及植物細(xì)胞工程制藥的含義、基本技術(shù)；動(dòng)、植物工程細(xì)胞

的體外培養(yǎng)方法；熟悉動(dòng)物工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)及生物反應(yīng)器；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建

方法

2.細(xì)胞工程制藥的基本技術(shù)：細(xì)胞或原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)技術(shù)；細(xì)胞或原生質(zhì)體融

合技術(shù)；細(xì)胞核移植技術(shù)；轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。

3.體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型：貼壁依賴(lài)性細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、兼性貼壁細(xì)胞

4,動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基、合成細(xì)胞培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基

5.動(dòng)物培養(yǎng)基采用膜過(guò)濾法滅菌

6.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用的其他溶液：平衡鹽溶液（BSS）、培養(yǎng)基pH調(diào)整液、細(xì)胞消化

液

7.生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得：原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、工程細(xì)胞系（融合

細(xì)胞系，如雜交細(xì)胞，如骨髓瘤細(xì)胞系、基因工程細(xì)胞系，如CHO細(xì)胞，生產(chǎn)INF、IL、

EPO等）

8.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)：細(xì)胞的原代培養(yǎng)、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)、細(xì)胞的克隆培養(yǎng)、

動(dòng)物細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

9.動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法、多孔載體培養(yǎng)法、微囊

培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)法

10.動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器類(lèi)型：攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、中空纖維式生

物反應(yīng)器、透析袋或膜式生物反應(yīng)器、固定床或流化床式生物反應(yīng)器、一次性搖袋式細(xì)

胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器細(xì)胞匚程制藥的基木過(guò)程

11.細(xì)胞工程制藥的基本過(guò)程

12.外源目的基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物的早期胚胎方法

顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞方法、基因打靶、精子載體導(dǎo)入法、人工

酵母染色體法(YAC)(轉(zhuǎn)入較大基因)

13.基因打靶：根據(jù)同源重組原理實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合技術(shù),包括基因敲除

(Knock-out)、基因敲入(Knock-in)、基因替代。

14.基因打靶必備條件：打靶載體、胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)

15.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器

動(dòng)物生物反應(yīng)器(bioreactor):目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物充分修飾，活性穩(wěn)定，成本低，可大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量高且易純化

類(lèi)型：動(dòng)物乳腺反應(yīng)器、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血液生物反應(yīng)器、

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物尿液生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)基因雞蛋生物反應(yīng)器

16.細(xì)胞工程制藥尚待解決的問(wèn)題

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)入基因存在隨機(jī)整合、調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定、表達(dá)率不高等；

目的基因異位表達(dá)或表達(dá)產(chǎn)物泄露問(wèn)題；

產(chǎn)物的分離純化問(wèn)題；

產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物性與人體蛋白相似性不夠

第三章：植物細(xì)胞工程制藥

1.學(xué)習(xí)重點(diǎn)：掌握植物細(xì)胞工程及植物細(xì)胞工程制藥的概念、內(nèi)容、優(yōu)勢(shì)；植物細(xì)胞體

外培養(yǎng)方法；熟悉植物工程細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物的應(yīng)用

2.植物細(xì)胞工程制藥基本概念

/植物細(xì)胞工程

利用植物細(xì)胞為基本單位，按照人們的設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行遺傳操作，以及在體外條

件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖，改變細(xì)胞某些生物學(xué)特性，從而改良品種加速繁育植物個(gè)體或獲得

有用物質(zhì)的技術(shù)。

/植物細(xì)胞全能性：植物體中任何一個(gè)具有完整細(xì)胞核(染色體組)的細(xì)胞，在一定條件

下都可以重新再分化形成原來(lái)的個(gè)體。

/脫分化：己分化的細(xì)胞、組織和器官在人工培養(yǎng)的條件下又分化成未分化的細(xì)胞和組織

的過(guò)程。

再分化:通過(guò)脫分化誘導(dǎo)形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下可再分化為胚狀體或直接

分化出器官。

愈傷組織培養(yǎng)：從植物體的各種組織、器官等外植體，經(jīng)脫分化而形成的細(xì)胞聚集體的

培養(yǎng)。

分生組織培養(yǎng)：又稱(chēng)生長(zhǎng)錐培養(yǎng)，指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細(xì)胞。

外植體：用于植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的器官或組織.

無(wú)性繁殖系：使用母體培養(yǎng)物反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)同一外植體而獲得越來(lái)越多的

無(wú)性繁殖后代。從同一無(wú)性系分離形成兩個(gè)或多個(gè)不同系列，稱(chēng)無(wú)性系變異體。

突變體：經(jīng)過(guò)確定已發(fā)生遺傳變異，或新的培養(yǎng)物至少通過(guò)一種誘變處理發(fā)生變異所得

的新細(xì)胞。

繼代培養(yǎng)：由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代時(shí)間稱(chēng)為第一代培養(yǎng)，連

續(xù)多代的培養(yǎng)為繼代培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)。

次級(jí)代謝：由特異蛋臼質(zhì)調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合過(guò)程0

次級(jí)代謝產(chǎn)物：生物堿、黃酮、菇類(lèi)、有機(jī)酸等。

植所采用技術(shù)

物植物細(xì)胞的全能性

的理論基礎(chǔ)

細(xì)

胞

工

程

3.植物細(xì)胞工程藥物包括：植物工程細(xì)胞生產(chǎn)藥物、轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物

植物細(xì)胞工程制藥

4.植物細(xì)胞工程制藥流程，…、

分裝凍干成品檢定

離體的植物器官、

4.植物細(xì)胞全能性植物體中任何一個(gè)組織或細(xì)胞（外植體）

|脫分化

具有完整細(xì)胞核（染色體組）的細(xì)胞

愈傷組織

在一定條件下都可以

|再分化

重新再分化形成原來(lái)的個(gè)體的能力。

根、芽

5.植物細(xì)胞的培養(yǎng)I

植物體

/培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基

/生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑/植物生長(zhǎng)激素：生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素

赤霉素，脫落酸，乙烯。

,誘導(dǎo)子：刺激植物細(xì)胞合成防御性

次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)，可以通過(guò)改變

次生代謝途徑中催化酶的酶活力引起代謝通量和反應(yīng)速率的改變，提高次生代謝產(chǎn)

物的產(chǎn)量。

/非生物誘導(dǎo)子：水楊酸，茉莉酸等，稀土及重金屬鹽類(lèi)

/生物誘導(dǎo)子：微生物類(lèi)，如真菌胞子，菌絲體真菌培養(yǎng)物濾液等

6.植物細(xì)胞的獲得：外植體直接分離法、愈傷組織分離法、原生質(zhì)體再生法

7.植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法：?jiǎn)渭?xì)胞的培養(yǎng)、單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）、愈傷組織培

養(yǎng)、毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)

8.植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)：大規(guī)模懸浮培養(yǎng)、細(xì)胞或原生質(zhì)體的固定化培養(yǎng)

9.植物細(xì)胞生物反應(yīng)器：改進(jìn)的攪拌式生物反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器

10.植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化存在的問(wèn)題

a.生長(zhǎng)緩慢，通常完成一次生產(chǎn)周期需4-5周

b.次級(jí)代謝物含量低

c.培養(yǎng)細(xì)胞不穩(wěn)定等，不耐受剪切力，易聚集化

d.多數(shù)次生代謝產(chǎn)物積累于胞內(nèi)，提取困難

e.下游產(chǎn)物分離純化成本較高

f.一般的說(shuō)，只有當(dāng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的價(jià)格非常昂貴時(shí)，才考慮采用植物細(xì)胞培養(yǎng)方

法。

g.生物反應(yīng)器技術(shù)還有待發(fā)展

1L轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物

優(yōu)點(diǎn)：基因工程改造的植物細(xì)胞全能性、大田種植成本更低，易于管理、運(yùn)輸

應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)重組抗體、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)其他藥物、極

具藥用潛力的轉(zhuǎn)基因植物（轉(zhuǎn)基因胰島素大米、轉(zhuǎn)基因葛苣胰島素膠囊）

12.轉(zhuǎn)基因植物目前仍存在的問(wèn)題

①產(chǎn)量偏低（至少需要達(dá)到1%）：目的基因沉默或不穩(wěn)定表達(dá)的現(xiàn)象

②糖基化問(wèn)題：抑制或消除植物糖基化;

③生物安全性和公眾接受性以及工業(yè)化技術(shù)問(wèn)題

④藥用植物資源問(wèn)題：野生資源匱乏，品質(zhì)退化，受地區(qū)氣候影響，不利于質(zhì)

量控制、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化

第四章酶工程制藥

1.學(xué)習(xí)要求：掌握酶和細(xì)胞的固定化的概念、方法、優(yōu)缺點(diǎn)；抗體酶、核酶、模擬酶

的概念及應(yīng)用；非水相催化；熟悉酶的化學(xué)修飾；酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用；

2.1953年，德國(guó)人提出了酶固定化技術(shù)。

3.1971年，第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議提出酶工程的主要內(nèi)容：1酶的生產(chǎn)、2酶的分離純

化、3酶和細(xì)胞的固定化、4酶的修飾及其分子改造、5非水相催化、6酶的傳感器、

7酶的反應(yīng)器、8抗體酶，人工酶和模擬酶、9酶和固定化酶技術(shù)的應(yīng)用。

r單純解

4-梅［結(jié)合麗（全酹）=的蛋白+輔因子

輔酶與梅蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。

他囚r輔基與膜蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。

金屬激活劑金屬離子作為輔助因子。

5.固定化所采用的酶可以是純化的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）或者使細(xì)胞碎片

上的酶或酶系。

6.現(xiàn)代酶工程的主要內(nèi)容

a.酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)以及應(yīng)用開(kāi)發(fā)；

b.酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究，包括酶?jìng)鞲衅?、反?yīng)檢測(cè)；

c.酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶的研究；

d.酶的分子改造和化學(xué)修飾，酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究；

有機(jī)相中酶反應(yīng)的研究;

f.酶的抑制劑、激活劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究；

g.抗體酶、核酸酶的研究；

h.模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成研究。

7.酶的來(lái)源：提取分離法、化學(xué)合成法（固相合成技術(shù)）、生物合成法

8.篩選產(chǎn)酶菌的方法：采集、菌種的分離初篩、純化、復(fù)篩、生產(chǎn)性能檢定

9.菌種改良的途徑：基因突變、基因轉(zhuǎn)移和基因克隆

10.常用的產(chǎn)酶微生物：Ecoli、枯草桿菌、啤酒酵母、曲酶（黑曲酶和黃曲酶）

細(xì)胞破碎一動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞

11.酶的分離純化

前提取,_發(fā)酵液

睡分離純化

離心分離，過(guò)濾分離,

I沉淀分離,層析分離,

梅濃縮

電泳分離，萃取分離,

I結(jié)晶分離等。

梅貯存

酶的純化方法

過(guò)濾、膜分離、電泳、凝膠色譜、離子交換層析、疏水層析、反相層析、親和層析等

12.酶制備的基本原則：防止酶的變性失活、建立有效的目的醵跟蹤監(jiān)測(cè)方法

13.酶和細(xì)胞的固定化

（1）固定化酶的定義：指被固定在載體或被束縛在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶

制備固定化酶的過(guò)程稱(chēng)為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以

是結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）或細(xì)胞碎片上的酶或酶系。

（2）固定化酶的優(yōu)點(diǎn)

①可多次使用，酶的穩(wěn)定性提高;

②酶與底物和產(chǎn)物易于分開(kāi)，易于純化;

③反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制；

④酶的利用率高，用酶量少；

⑤比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)；

⑥一般不能長(zhǎng)期保存。添加底物、產(chǎn)物、抑制劑和防腐劑，并于低溫保存。

（3）固定化酶的缺點(diǎn)

①固定化時(shí)，酶活性有所損失；

②成本增加；

③只適用于可溶性底物；

④與完整菌體相比，不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔酶因子的反應(yīng)；

⑤胞內(nèi)酶經(jīng)常需要經(jīng)過(guò)酶的純化過(guò)程

14.酶的固定化方法

（1）載體結(jié)合法：將酶結(jié)合于不溶性載體上（物理吸附法，離子結(jié)合法，共價(jià)結(jié)合法）

（2）交聯(lián)法：用雙功能或多功能試劑使酶與酶或細(xì)胞與細(xì)胞之間形成共價(jià)鍵，交叉

連接，形成網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。

（3）包埋法：酶和載體混合后，借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)

（4）新型的酶固定化方法：耦合固定化、無(wú)載體固定化、定向固定化

15.固定化細(xì)胞：將具有一定生理功能的生物細(xì)胞限制或定位在特定空間區(qū)域。

15.固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用：用固定化酶生產(chǎn)各種產(chǎn)物、制備酶?jìng)鞲衅?/p>

16.制備酶?jìng)鞲衅鳎簩⒒钚悦父采w在電極表面，酶與被測(cè)物反應(yīng)，形成一種能被電極響應(yīng)

的物質(zhì)。

17.酶電極：固定化酶一般用凝膠包埋成薄膜，與電極相連。

18.酶?jìng)鞲衅骺梢院?jiǎn)便快速測(cè)定特異性強(qiáng)的物質(zhì)：糖類(lèi)、醇類(lèi)、有機(jī)酸、氨基酸、激素

等物質(zhì)濃度的測(cè)定，在臨床分析、工業(yè)檢測(cè)等應(yīng)用。

19.常見(jiàn)的酶反應(yīng)器類(lèi)型

固定化酶(細(xì)胞)的反應(yīng)器：用于酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備稱(chēng)為酶反應(yīng)器。

/按結(jié)構(gòu)區(qū)分

攪拌罐式反應(yīng)器(StirredTankReactor,STR)

鼓泡式反應(yīng)器(bubblecolumnreactor,BCR)

填充床式反應(yīng)器(packedcolumnreactor,PCR)是目前工業(yè)生產(chǎn)及研究中應(yīng)用最

為普遍的反應(yīng)器。

流化床式反應(yīng)器(FluidizedBedReactor,FBR)

膜反應(yīng)器(MembraneReactor,MR)常用的是中空纖維反應(yīng)器。

/按操作方式區(qū)分

分批式反應(yīng)(batch)

連續(xù)式反應(yīng)(continuous)

流加分批式反應(yīng)(feedingbatch)

/按混合形式

連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器(ContinuousStirredTankReactor,CSTR)

分批攪拌罐反應(yīng)器(BatchStirredTankReactor,BSTR)

20.模擬酶

根據(jù)酶的作用原理，人為制造的具有酶性質(zhì)的催化劑。利用有機(jī)化學(xué)合成的比酶結(jié)構(gòu)

簡(jiǎn)單得多的具有催化功能的蛋白或非蛋白質(zhì)分子。

特點(diǎn)：高效，高適應(yīng)性，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。

21.模擬酶的分類(lèi)(按照模擬酶的屬性)

①主-客體酶模型：代表-環(huán)糊精模擬酶

②膠束酶模型：膠束在水溶液中提供疏水微環(huán)境，可對(duì)底物束縛將催化基團(tuán)(如

咪噗，筑基,羥基)和輔酶共價(jià)或非共價(jià)連接或吸附在膠束上,可提供“活性部位”

③肽酶：肽酶就是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽，這

是多肽合成的一大熱點(diǎn)。

④抗體酶

⑤分子印跡酶模型

⑥半合成酶

抗體酶

或稱(chēng)催化抗體是一類(lèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的、具有催化活性的抗體。是一種新型人工酶制劑

特點(diǎn)：更高的專(zhuān)一性和更好的穩(wěn)定性：精細(xì)識(shí)別

分子印跡

是指制備對(duì)某一特定化合物具有選擇性的聚合物的過(guò)程。這個(gè)特定化合物叫印跡分子

（print-molecule,P）或模板分子（template-molecule,T）。

分子印跡酶

一種分子為模版，周?chē)镁酆衔锝宦?lián)，模版分子除去后，聚合物留下一空穴產(chǎn)生類(lèi)似酶

活性中心的空腔.在結(jié)合部位的空腔誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基團(tuán)，并與底物定向排列.

22.酶的化學(xué)修飾

/目的：提高酶的穩(wěn)定性,解除酶的抗原性,改變酶學(xué)性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍

/概念：通過(guò)主鏈切割，剪切和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶蛋白進(jìn)行分子改造，以改變其理

化性質(zhì)及生物活性。

/酶的化學(xué)修飾方法：

A.酶的表面化學(xué)修飾

（1）大分子修飾：可溶性大分子如PEG通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面形成一層覆蓋層。

（2）小分子修飾：側(cè)鏈基團(tuán)

（3）交聯(lián)修飾：雙功能基團(tuán)，加固結(jié)構(gòu)

（4）固定化修飾

（PEG是線(xiàn)性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫

原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用

于酶的修飾。獲FDA認(rèn)證）

B.酶分子內(nèi)部的修飾

1）非催化活性基團(tuán)的修飾：空間構(gòu)象、酶動(dòng)力學(xué)

2）蛋白主鏈的修飾：水解

3）催化活性基團(tuán)的修飾：

4）與輔因子有關(guān)的修飾：輔因子共價(jià)結(jié)合，金屬取代等

C.定點(diǎn)突變和化學(xué)修飾結(jié)合技術(shù)

化學(xué)修飾成本高，難度大

非天然AA,關(guān)鍵部位修飾

23.突變酶：采用基因工程技術(shù)對(duì)天然酶基因進(jìn)行剪切、修飾或突變，通過(guò)表達(dá)修改的

基因獲得的酶

突變酶的應(yīng)用：提高酶活性及穩(wěn)定性、研究酶的功能基團(tuán)

定點(diǎn)突變的方法：寡核苦酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、盒式突變或片

段取代突變、循環(huán)延伸突變。

24.酶的分子定向進(jìn)化，定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇

25.酶的分子定向進(jìn)化的突變策略：

①隨機(jī)突變：易錯(cuò)PCR技術(shù)、連續(xù)易錯(cuò)PCR

②同源改組

③非同源改組

④結(jié)構(gòu)域改組

26.核酶（RNase）：具有催化功能的小分子RNA屬于生物催化劑可降解特異的mRNA序列。

核酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用：核酶抗肝炎病毒的研究、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒I型（HIV-炎核酶

抗腫瘤治療（核酶能在特定位點(diǎn)準(zhǔn)確有效地識(shí)別和切割腫瘤細(xì)胞的mRNA,抑制腫瘤基

因的表達(dá)。）

27.非水相催化：酶在水活度受控制的非單一水相（有機(jī)溶劑、氣體、超臨界流

體、離子液等）中進(jìn)行的催化反應(yīng)稱(chēng)為非水相催化。

特點(diǎn)：酶構(gòu)象比水溶液中更具“剛性”。通過(guò)選擇不同性質(zhì)的溶劑來(lái)調(diào)控酶

的某些特性。例如，誘導(dǎo)改變酶分子的構(gòu)象，調(diào)控酶的底物專(zhuān)一性，立體選擇

性和手性選擇性等。

28.酶非水相催化的應(yīng)用：手性藥物的拆分、功能高分子聚合物的合成、精細(xì)化

工產(chǎn)品的生產(chǎn)

29.酶工程主要研究?jī)?nèi)容是什么？

30.固定化酶和固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)各是什么？怎樣制備?

31.為什么要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾？

32.何為分子印跡？分子印跡的應(yīng)用范圍有哪些？

33.有機(jī)相酶反應(yīng)的定義及其優(yōu)點(diǎn)是什么？

34.何為人工模擬酶？

第六章蛋白質(zhì)工程制藥

1、掌握蛋白質(zhì)工程的概念、研究?jī)?nèi)容、基本原理；蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次、內(nèi)容、流程

和策略；蛋白質(zhì)藥物的化學(xué)修飾；熟悉蛋白質(zhì)工程的基本思路與基因工程的差異；

2.蛋白質(zhì)工程：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系研究為基礎(chǔ)，利用基因工程技

術(shù)，按照人類(lèi)自身的需要，定向改造天然蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不

存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子的現(xiàn)代生物技術(shù)。

3.蛋白質(zhì)工程的理論依據(jù)：基因指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。

基因工程一蛋白質(zhì)L程

相同點(diǎn)操作環(huán)境——生物體外：操作對(duì)象——

基因；操作水平——分子

結(jié)果天然存在的蛋白自然不存在的蛋白

實(shí)質(zhì)基因重組基因修飾或基因合成

流程中心法則中心法則逆推

蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上的延伸

聯(lián)系，是第：代基因工程

5.蛋白質(zhì)工程的主要研究?jī)?nèi)容

1）從DNA水平改變基因，改造蛋白質(zhì)

2）從一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基、結(jié)構(gòu)域、全新蛋白質(zhì)，從不同尺度改造蛋白

3）有目的地改造，獲得期望功能，強(qiáng)調(diào)分子設(shè)計(jì)

4）結(jié)合DNA重組技術(shù)改造蛋白質(zhì)

6.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)（ProteinDesign）：依賴(lài)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定和分子模型的建立，按照

蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的理論基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出比天然蛋白質(zhì)性能優(yōu)越的新型蛋白質(zhì)。

7.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次

定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾法（小改）、拼接組裝設(shè)計(jì)法（中改）、全新蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)（大

改）

8.蛋白質(zhì)工程的操作方法

①

②合理化的分子設(shè)計(jì)：活性、結(jié)構(gòu)、專(zhuān)-一性

__________天然蛋門(mén)―

質(zhì)結(jié)向預(yù)測(cè)蛋白液晶

③基因的定向突變和定向進(jìn)化蛋白體學(xué)

1

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)

④突變體的大規(guī)模篩選1

結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系

1

⑤突變體的表達(dá)及其分析檢測(cè)從數(shù)據(jù)-蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一

庫(kù)輸入1

幾何優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)流程1

——-結(jié)構(gòu)分析與原先的結(jié)構(gòu)比較一

1

蛋白質(zhì)合成定位突變

______分離、純化1及表征________

—新蛋白質(zhì)

9.突變策略

定點(diǎn)突變（寡核甘酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、盒式突變）、隨機(jī)突變

（易錯(cuò)PCR）、同源改組、非同源改組、結(jié)構(gòu)域改組

10.篩選策略

熒光標(biāo)記、平板分析（遺傳互補(bǔ)篩選法）、噬菌體展示和細(xì)胞表面展示、高通量篩選

11.蛋白質(zhì)藥物的修飾：指在分子水平上對(duì)蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行化學(xué)改造，通過(guò)對(duì)主鏈的切

割、剪接及化學(xué)基團(tuán)的引入，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)和生物活性的改變

12.PEG修飾

修飾靶點(diǎn)：多為蛋白質(zhì)氨基，賴(lài)氨酸氨基和末端氨基

缺點(diǎn)：修飾產(chǎn)物同分異構(gòu)體多而難以分離，難獲得單一的PEG化產(chǎn)物

思考題

1、蛋白質(zhì)工程的含義及其主要內(nèi)容

2、蛋白質(zhì)工程的主要步驟

3、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原理與流程

4、蛋白質(zhì)工程的基本思路與基因工程的差異

第七章核酸類(lèi)藥物

如何分清核酸、核酸藥物、珍奧核酸三者之間的區(qū)別？

1）珍奧核酸：是從動(dòng)植物組織中提取的核酸類(lèi)物質(zhì)

2）核酸類(lèi)藥物：是天然的代謝激活劑，有助改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝，加速

受損組織的修復(fù)。

3）核酸：是由許多核昔酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。

1.學(xué)習(xí)要求：掌握翻反義核酸藥物的作用機(jī)制、設(shè)計(jì)策略；RNAi的作用機(jī)制、特點(diǎn);

熟悉反義核酸藥物的作用特點(diǎn)；miRNA的基本特征；siRNA和miRNA的異同；

2.核酸類(lèi)藥物（廣義）：腺甘、肌甘、尿昔、核甘酸、脫氧核甘酸、雙丁酰環(huán)腺昔酸、

胞二磷膽堿等核酸組分及衍生物，是天然的代謝激活劑，有助改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和

能量代謝，加速受損組織的修復(fù)。臨床廣泛用于放射病、血小板減少、急慢性肝炎、

血細(xì)胞減少、心血管疾病等。

3.核酸類(lèi)藥物（狹義）：又稱(chēng)核甘酸類(lèi)藥物，寡聚核糖核甘酸（RNA）或寡聚脫氧核糖核

甘酸（DNA）,可以在基因水平上發(fā)揮作用：特異性針對(duì)致病基因，具有特定的靶點(diǎn)和作

用機(jī)制的藥物。分類(lèi)：反義核酸、RNA干擾藥物

4.核酸類(lèi)似物：主要有疊氮胸背、阿糖腺昔、阿糖胞甘、聚肌胞甘酸等。干擾病毒

DNA的合成，治療病毒性疾病、腫瘤、艾滋病等。

5.反義技術(shù)（antisensetechnology）：人工或生物合成的特定DNA或RNA片段抑制或

封閉基因表達(dá)的技術(shù)；

6.反義核酸藥物(反義藥物)：包括：反義DNA、反義RNA、核酶；通常指反義脫氧

寡核甘酸(antisenseoligodeoxy-nucleotide,ASODN)。

7.反義RNA：指能和mRNA完全互補(bǔ)的一段小分子RNA或寡聚核甘酸片段

8.反義DNA：指能與基因DNA雙鏈中的有義鏈互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子

9.核酶：一類(lèi)具催化活性和自我催化剪切的核酸分子，可精確地自我切除某些片段并

重新連接。

10.反義核酸作用機(jī)理

反義核酸可在轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯等各個(gè)環(huán)節(jié)上發(fā)揮調(diào)控作用。

①抑制轉(zhuǎn)錄：與DNA調(diào)控區(qū)或編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mRNA鏈延長(zhǎng)；抑

制mRNA剪切和成熟；

②抑制翻譯：與mRNA形成dsRNA,誘導(dǎo)RNaseH對(duì)其降解;

③糖環(huán)修飾：包括a構(gòu)型、/位取代、2'位取代、3'-3'連接、5'-5'

連接等。使核酸酶不能有效識(shí)別磷酸二酯鍵。

④肽骨架：ASODN的磷酸-糖骨架以肽鍵取代，即多肽核酸(PNA),PNA與DNA

以及RNA與PNA之間均可形成堿基配對(duì)。

10.反義核酸藥物設(shè)計(jì)策略(3個(gè)S)

①選擇性(selectivity)：5,端帽結(jié)構(gòu)區(qū)、mRNA編碼區(qū)、核前體mRNA拼接區(qū)、

反轉(zhuǎn)錄病毒的引物區(qū)等；

②穩(wěn)定性(stability)：核酶酶解玲化學(xué)修飾反義核酸；C-G序列未被甲基化玲免

疫原性玲避免C-G序列；磷的修飾；

③溶解性(solubility):透過(guò)細(xì)胞膜玲分子大小(15-20)、電荷、脂溶性；化

學(xué)修飾，合適的藥物遞送系統(tǒng)；

11.硫代磷酸寡核甘酸(phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN)最為常用，稱(chēng)為"第一代

反義藥物”。

12.反義核酸藥物的應(yīng)用

用于治療惡性腫瘤、感染性疾病、炎癥等。

已有一個(gè)FDA批準(zhǔn)上市的反義核酸藥物福米韋生(fomivirsen)

13.RNATife(RNAinterference,RNAi)：指進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA誘

發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。

14.RNAi作用機(jī)制(右圖)

①啟動(dòng)階段『^成21?23個(gè)臆基對(duì)的

小干擾性RNA

②RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物形成階段IIIII

與青白結(jié)合

RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體

(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)

③效應(yīng)階段

15.miRNA(microRNA,微＜1、RNA)

JfjTT識(shí)匚別二程二序列

IgffiRNA(mRNA)

長(zhǎng)度約為21~25nt小分子單鏈RNA

調(diào)控基因表達(dá)的小分子，具有階段特異性、組織特異＞擷被降解，基因沉默出現(xiàn)

16.RNA!的作用特點(diǎn)

1)高度特異性、高效性

2)可傳播性和可遺傳性

3)高穩(wěn)定性

4)dsRNA長(zhǎng)度限制性

5)RNAi效應(yīng)的依賴(lài)性

6)ATP依賴(lài)

項(xiàng)目siRNAmiRNA

長(zhǎng)度特征都是約為22nt的小分子

相合成底物均由雙鏈RNA或RNA前體加工而來(lái)

同Dicer?均需Dicer?來(lái)加工

點(diǎn)Argonaut屋白均需Argonaute蛋白參與

RISC均是RISC組分，在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有相似之處

作用方式均可導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性降低

思考題

1、什么是核酸藥物

2、反義核酸藥物的作用機(jī)制;

3、RNAi的作用機(jī)制；

4、siRNA和miRNA的異同；

5、反義核酸藥物的設(shè)計(jì)策略;

第八章多肽類(lèi)藥物

1.學(xué)習(xí)要求

掌握多肽類(lèi)藥物的定義、分子組成、優(yōu)點(diǎn)；

熟悉人工合成多肽的方法；多肽類(lèi)藥物的劑型與給藥途徑

2.多肽類(lèi)藥物的優(yōu)勢(shì)

1）活性高，特異性強(qiáng)；

2）分子量小，易吸收，生物利用度高；

3）易合成，合成效率高，過(guò)程自動(dòng)化，易于控制；方便結(jié)構(gòu)改造；

4）副作用小。序列同源，不易引起免疫反應(yīng)；

5）信使作用（神經(jīng)遞質(zhì)），載體作用；

3.多肽：由氨基酸縮合而成的化合物；一般10-50個(gè)氨基酸；多數(shù)無(wú)特定空間構(gòu)象

4.活性多肽：體內(nèi)含量低，但生理功能強(qiáng)，在神經(jīng)、內(nèi)分泌、生殖、消化、生長(zhǎng)等系

統(tǒng)中發(fā)揮著不可或缺的生理調(diào)節(jié)作用。

多肽類(lèi)藥物（多肽類(lèi)激素）是機(jī)體的特定腺體合成并釋放的一種物質(zhì)，通過(guò)與遠(yuǎn)程敏感

細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面的受體相互作用而使靶細(xì)胞發(fā)生變化。主要包括垂體多肽激素、下丘腦多

肽激素、甲狀腺多肽激素、胰島多肽激素、腸胃道多肽激素和胸腺多肽激素等。

5.多肽類(lèi)藥物的作用靶點(diǎn)：主要為G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）

6.多肽藥物的制備方法

化學(xué)合成（液相合成法、固相多肽合成法SPPS）、酶解法、基因工程法

8.多肽類(lèi)藥物的劑型與給藥途徑

?多肽類(lèi)藥物的穩(wěn)定性：穩(wěn)定性差，半衰期短；

原因：脫酰胺、氧化、水解、錯(cuò)誤二硫鍵、消旋、變性、吸附、聚集或沉淀

如何提高：定點(diǎn)突變、化學(xué)修飾、基因融合、添加劑、凍干

?多肽類(lèi)藥物的劑型：大部分為注射劑，靜脈注射或靜脈滴注為主，凍干粉

?目前上市的多肽藥物制劑有微球、埋植齊I」、脂質(zhì)體、微乳納米粒等

9.研發(fā)上市的多肽藥物

/齊考諾肽：具有鎮(zhèn)痛作用的芋螺毒素Ziconotide（齊考諾肽），為N-型電壓門(mén)控鈣

通道阻滯劑，于2004年12月被美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)為鞘內(nèi)注射治療疼痛的新藥，

商品名為Prialt?

/艾塞那肽：細(xì)胞因子模擬肽，大毒蜥的唾液中提取出十多種蛋白和毒素。其中，

種名為exendin-4（39aa）的蛋白被發(fā)現(xiàn)同人體消化管中的胰高血糖素類(lèi)多肽-1有

50%的同源性治療II型糖尿病。

/恩夫韋肽：在美國(guó)上市（羅氏）。新一代抗HIV新藥，病毒的融合阻止劑類(lèi)藥

物（36aa）?

10.多肽類(lèi)藥物的應(yīng)用

①抗糖尿病或低血糖癥多肽

②抗腫瘤多肽

③抗感染多肽：與傳統(tǒng)的抗菌藥不同，抗菌肽作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜穿

孔，細(xì)胞質(zhì)外溢而達(dá)到殺菌的目的。

④抗心血管與泌尿系統(tǒng)疾病治療多肽

⑤多肽疫苗：價(jià)格低廉、安全性高、特異性強(qiáng)（HIV-I病毒多肽疫苗；丙肝病毒

（HCV）多肽疫苗）

⑥其他藥用多肽、診斷用多肽

思考題

1、多肽藥物特點(diǎn)

1）調(diào)節(jié)各種各樣的生理活動(dòng)和生化反應(yīng)；

2）生物活性高；

3）分子小，結(jié)構(gòu)易于改造；

4）許多活性多肽都是由無(wú)活性的蛋白質(zhì)前體經(jīng)酶加工剪切轉(zhuǎn)化而來(lái)；

5）安全性高

2、多肽藥物制備方法；

3、多肽類(lèi)藥物的劑型和給藥途徑；

4、多肽類(lèi)藥物的應(yīng)用

第九章治療性抗體

1.學(xué)習(xí)要求

掌握基因工程抗體的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)；單克隆抗體制備的過(guò)程;

熟悉噬菌體表面展示技術(shù)建立抗體庫(kù)；抗體的功能和基本結(jié)構(gòu)；

2.抗體分類(lèi)：IgG、IgM、IgD、IgA、IgE

3.抗體的結(jié)構(gòu)：

1）基本結(jié)構(gòu)：四肽鏈結(jié)構(gòu)，兩條輕鏈（L）

2）可變區(qū)（V區(qū)）

L鏈N端1/2處（VL）

H鏈N端1/5處（VH）

3）恒定區(qū)（C區(qū)）

L鏈C端1/2處（CL）

H鏈C端3/4處（CH）

（在同一種屬動(dòng)物中比較恒定）

4）超變區(qū)&骨架區(qū)

都在可變區(qū)

超變區(qū)（HVR）/互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）：

某些特定位置的氨基酸殘基顯示更大的變異性；

骨架區(qū)（FR）：維持HVR的空間結(jié)構(gòu)

5）被鏈區(qū)：位于CH1與CH2之間，含有豐富的脯氨酸，易伸展彎曲

4.抗體的結(jié)構(gòu)與功能：VL和VH是抗原結(jié)合的部位（FV區(qū)）。

CL1和CH1上具有同種異型的遺傳標(biāo)記。

CH2具有補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)。IgG可通過(guò)胎盤(pán)屏障。

6.細(xì)胞融合：

骨髓瘤細(xì)胞：次黃喋吟鳥(niǎo)喋吟磷酸核苗轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）缺陷型，確保其對(duì)HAT培養(yǎng)基

的敏感性；融和率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長(zhǎng)

期穩(wěn)定等特點(diǎn)

細(xì)胞融合基本方法：取適量脾細(xì)胞（1*108）與骨髓瘤細(xì)胞（2*107-3*107）進(jìn)行混合,

在PEG作用下誘導(dǎo)融合。為提高融合率