GB/T 42821-2023 貝類(lèi)包納米蟲(chóng)病診斷方法（正式版）

ICS65.020.30貝類(lèi)包納米蟲(chóng)病診斷方法Diagnosticmethodsforbonamiosisofm國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I Ⅲ 1 1 1 1 1 2 3 3 310組織病理檢查 311PCR檢測(cè) 4 5 6附錄A(規(guī)范性)組織印片、組織病理檢查及DNA提取相關(guān)溶液配制 7附錄B(資料性)貝類(lèi)包納米蟲(chóng)病 ⅢGB/T42821—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC156)歸口。柏建山。1貝類(lèi)包納米蟲(chóng)病診斷方法本文件給出了貝類(lèi)包納米蟲(chóng)病(bonamiosis)診斷的縮略語(yǔ)、試劑和材料、器材和設(shè)備，描述了臨床本文件適用于牡蠣包納米蟲(chóng)(Bonamiaostreae)和殺蠣包納米蟲(chóng)(Bonamiaexitiosa)引起的貝類(lèi)包下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)與定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。bp:堿基對(duì)(basepair)Ct:擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(cyclethreshold)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:羧基熒光素(carboxyfluorescein)TE:Tris鹽酸和EDTA緩沖溶液(EDTATris·HCl)Tris:三羥甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)2GB/T42821—20235.1水：符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。5.5生理鹽水(0.9%):常溫保存。5.610×PCR緩沖液(無(wú)Mg2+):—20℃保存。5.7MgCl?溶液(25mmol/L):-20℃保存。5.9TaqDNA聚合酶(5U/μL):-20℃保存。5.10姬姆薩染液、戴維森氏固5.11蛋白酶K(20mg/mL):按A.3配制。5.1210%SDS:按A.4配制。5.13乙酸銨(10mol/L):按A.5配制。5.14酚/三氯甲烷/異戊醇混合液：配制比例25:24:1。5.15乙醇溶液(75%):按A.6配制。5.171×電泳緩沖液：按A.9配制。5.21引物BonF:5'-CATTTAATTGGTCGGGCCGC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.22引物BonR:5'-CTGATCGTCTTCGATCCCCC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.23引物BonqF:5'-GAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAAC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.24引物BonqR:5'-CATAAGTTAGTCTCACCGGAATTAAAG-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.25探針BonqP:5'-FAM-TCTGGCCCGGCGATACTAGCACCC-Eclipse-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.27核酸染料：4℃保存。5.286×上樣緩沖液：—20℃保存。5.29DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)溶液：-20℃保存。5.31載玻片。6器材和設(shè)備6.1組織切片機(jī)。6.2顯微鏡。6.34℃冰箱。6.4—20℃冰箱。6.5—80℃冰箱。6.6勻漿研磨器。6.7冷凍高速離心機(jī)。6.8二級(jí)生物安全柜。3GB/T42821—20236.9普通PCR儀。6.10熒光PCR儀。6.11水平電泳儀。6.12凝膠成像儀。6.13水浴鍋。6.14微量移液器。6.15電子天平。8采樣優(yōu)先采集2齡及以上瀕死的貝類(lèi)。臨床無(wú)癥狀貝類(lèi)樣品每個(gè)批次采集150個(gè)以上，臨床有癥狀貝類(lèi)樣品每個(gè)批次采集30個(gè)以上。進(jìn)口貝類(lèi)樣品的采樣數(shù)量應(yīng)符合GB/T18088的規(guī)定。24h內(nèi)冷鏈送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，立即檢測(cè)或保存于一80℃冰箱待檢。9組織印片檢查后置于400倍～1000倍顯微鏡下觀察。用戴維森氏固定液固定樣品，固定液與組織塊的體積比為(15:1)～(20:1),固定24h～48h。4GB/T42821—2023按A.13的要求采用組織切片機(jī)制備石蠟切片，封片后置于400倍～1000倍顯微鏡下觀察。切片組織中發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體即判為陽(yáng)性。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)要求、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證應(yīng)符合GB/T19495.2的規(guī)定。11.2操作步驟11.2.1DNA提取11.2.1.1利用電子天平稱(chēng)取30mg～50mg組織樣品，置于0℃~4℃的生理鹽水(4℃冰箱預(yù)冷)中反復(fù)沖洗，濾紙吸干表面水分后置于勻漿研磨器中并加入0℃~4℃(4℃冰箱預(yù)冷)的生理鹽水，充分11.2.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K至終濃度100μg/mL,再至終濃度為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),上下顛倒混勻后置于50℃水浴鍋中水浴3h,不時(shí)旋動(dòng)。向勻漿液中按1:1體積比加入酚/三氯甲烷/異戊醇混合液(25:24:1),輕輕震蕩混勻加入兩倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇(—20℃冰箱預(yù)冷)混勻，置于一20℃冰箱放置2h。11.2.1.6采用冷凍高速離心機(jī)12000r/min離心10min,沉淀DNA,傾去上清液。11.2.1.7向沉淀中加入75%乙醇溶液500μL,輕輕混勻后采用冷凍高速離心機(jī)12000r/min離心11.2.1.9可采用同等抽提效果的其他方法或商品化DNA提取試劑盒。在二級(jí)生物安全柜中用微量移液器向PCR管內(nèi)加入10×PCR緩沖液(無(wú)Mg2+)2.5μL、MgCl?溶1.0μL、dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μL,加入模板DNA2.0μL,補(bǔ)充雙蒸水至25.0pL。利用普通PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,55℃退5GB/T42821—2023配制1%～2%的瓊脂糖凝膠并加入核酸染料，待膠凝固后置于含有1×電泳緩沖液的水平電泳儀陽(yáng)性對(duì)照在300bp處有擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照300bp處無(wú)擴(kuò)增條帶，空白對(duì)照無(wú)任何條帶，檢測(cè)有效。若待檢樣品在300bp處無(wú)條帶，則判為PCR檢測(cè)核酸陰性。對(duì)PCR檢測(cè)為核酸陽(yáng)性的樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果同參考序列比對(duì)分析(見(jiàn)附錄C中C.1、C.2),若序列中同時(shí)存在HaeⅡ和BglI兩個(gè)酶切位點(diǎn)(見(jiàn)C.1),可判定樣品為Bonamiaostreae核酸陽(yáng)性。若序列中只存在HaeⅡ酶切位點(diǎn)(見(jiàn)C.2),則判定樣品為Bonamiaexitiosa核酸陽(yáng)性。12熒光PCR檢測(cè)12.1實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)要求、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證應(yīng)符合GB/T19495.2的規(guī)定。12.2.1DNA提取按11.2.1規(guī)定執(zhí)行。在二級(jí)生物安全柜中用微量移液器向PCR管內(nèi)加入10×PCR緩沖液(無(wú)Mg2+)2.5μL、MgCl?溶利用熒光PCR儀進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)置擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性4min;95℃變性陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤35,且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照無(wú)Ct值或者Ct值>40且無(wú)特異性擴(kuò)增曲6GB/T42821—202312.3.2熒光PCR檢測(cè)結(jié)果判定若樣品Ct值≤35,則判定熒光PCR檢測(cè)核酸陽(yáng)性。若樣品無(wú)擴(kuò)增曲線或者Ct值>40,則判定熒光PCR檢測(cè)核酸陰性。若35<Ct≤40,判定為疑似，此時(shí)可調(diào)整模板濃度后對(duì)樣品重新進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，如果樣品重復(fù)檢測(cè)時(shí)的Ct值≤40,則判定熒光PCR檢測(cè)核酸陽(yáng)性；如果樣品重復(fù)檢測(cè)時(shí)無(wú)擴(kuò)增曲線或者Ct值>40,則判為熒光PCR檢測(cè)核酸陰性(熒光PCR擴(kuò)增序列及引物、探針的位置見(jiàn)C.3)。13.2確診判定組織印片檢查和組織病理檢查一種或兩種方法檢測(cè)為陽(yáng)性，且PCR檢測(cè)或者熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)組織印片檢查和組織病理檢查一種或兩種方法檢測(cè)為陽(yáng)性，且PCR檢測(cè)或者熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)7GB/T42821—2023(規(guī)范性)A.1姬姆薩染液A.1.2工作液：取貯存液采用蒸餾水10倍稀釋即可，臨用時(shí)配制。A.2戴維森氏固定液海水335mL95%乙醇330mL37%甲醛220mL冰乙酸115mLA.320mg/mL蛋白酶K蛋白酶K20mg溶解后分裝于1.5mL離心管中(0.25mL/管),—20℃下保存。加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.2,加水定容至100mL。SDS微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，稱(chēng)量時(shí)要戴面罩，稱(chēng)量完畢后要清除殘留在稱(chēng)量工作臺(tái)區(qū)和電子天平上乙酸銨77g無(wú)水乙醇8GB/T42821—20230.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至高壓蒸汽滅菌，4℃貯存。A.850×電泳緩沖液Tris冰乙酸0.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至室溫貯存。A.91×電泳緩沖液50×電泳緩沖液加水定容至室溫貯存。2mL242g57.1mL20mLA.10蘇木精染液的配制方法蘇木精無(wú)水乙醇硫酸鋁鉀蒸餾水氧化汞冰乙酸200mL分別用無(wú)水乙醇溶解蘇木精，蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，然后兩液混合并煮沸，加入氧化汞，繼續(xù)加熱和攪拌至溶液為深紫色，立即用冰水冷卻，恢復(fù)至室溫后過(guò)濾備用。A.11伊紅染液的配制選用水溶性伊紅。配方為：伊紅1g、70%～75%酒精100mL、伊紅用少許蒸餾水調(diào)成耀糊狀，再加入酒精，邊加邊攪拌，直至徹底溶解，此時(shí)試劑有些渾濁，取0.1mL冰乙酸，加入試劑中，試劑逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榍辶粒术r紅色。A.12返藍(lán)液的配制取5mL氫氧化氨，加入1000mL蒸餾水中即可。A.13石蠟切片制備取材固定24h,修整組織塊，換固定液重新固定12h,自來(lái)水沖洗24h、70%乙醇1h、85%乙醇1h、95%乙醇45min2次，無(wú)水乙醇30min3次，二甲苯30min,二甲苯5min～20min2次，放入石蠟二甲苯10min2次，然后依次通過(guò)無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2min,再93min后，返藍(lán)液2min～5min,自來(lái)水5min,蒸餾水5min,然后依次通過(guò)50%乙醇、70%乙醇、80%GB/T42821—2023(資料性)B.1疾病描述包納米蟲(chóng)病是由牡蠣包納米蟲(chóng)(Bonamiaostreae)、殺蠣B.2病原現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的包納米蟲(chóng)包括5個(gè)種，除主要寄生在歐洲平牡蠣(Ostreaedulis)體內(nèi)的牡蠣包納米蟲(chóng)(Bonamiaostreae)外，還有寄生在悉尼巖牡蠣(Saccostreaglomerata)體內(nèi)的魯夫來(lái)包納米蟲(chóng)其在寄主細(xì)胞內(nèi)定位接觸30min即可感染牡蠣，其中以顆粒血細(xì)胞中的病原感染力最強(qiáng)。造成廣泛危害的主要為牡蠣包納米蟲(chóng)和殺蠣包納米蟲(chóng)。B.3易感宿主B.4臨床癥狀B.5地理分布我國(guó)目前尚未有水生動(dòng)物包納米蟲(chóng)病發(fā)生的報(bào)道。B.6組織印片檢查包納米蟲(chóng)見(jiàn)圖B.1中箭頭所指位置。GB/T42821—2023圖B.1組織細(xì)胞內(nèi)的包納米蟲(chóng)B.7血淋巴印片檢查在顯微鏡下可觀察到蟲(chóng)體寄生于血淋巴細(xì)胞內(nèi)，呈球形或卵圓形，大小為2μm～5μm,姬姆薩染圖B.2牡蠣血液中的包納米蟲(chóng)B.8組織病理學(xué)檢查包納米蟲(chóng)呈球形或卵圓形，蟲(chóng)體大小為2μm～5μm,細(xì)胞核紅染，細(xì)胞質(zhì)藍(lán)染。包納米蟲(chóng)見(jiàn)圖B.3中箭頭所指的位置。GB/T42821—2023圖B.3牡蠣石蠟切片中包納米蟲(chóng)的觀察GB/T42821—2023目標(biāo)擴(kuò)增序列及引物、探針的位置C.1Bonamiaostreae的PCR目標(biāo)擴(kuò)增序列及引物位置(300bp)CATTTAATTGGTCGccCTGGTCCTGATCCTTTACTTTGAGAAAATTAAAGTGCTCAAAGCAGGCTCGCGCCTGAATGCATTAGCATGG'AATAATAAGACACGACTTCGGCGC|CGCCT|CGGCGGTTGTTTTGTTGGTTTTGAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTGGGGGTGCTAGTATCGCCGGGCCAGAGGTAAAATTCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATGCGAAAGCATTCACCAAGCGTGTTTTCTTTAATCAAGAACTAAAGTTGGGGGATCGAAGACGATCAG點(diǎn)的酶切位置