遺傳多樣性的分子檢測(cè)

關(guān)于遺傳多樣性的分子檢測(cè)

遺傳多樣性（geneticdiversity）是生物多樣性的重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ)，任何物種都有其獨(dú)特的基因庫(kù)或遺傳組織形式。廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物攜帶的遺傳信息的總和，但通常所說(shuō)的遺傳多樣性是指種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)不同種群之間或一個(gè)種群內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異。遺傳多樣性的概念第2頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月

遺傳多樣性的表現(xiàn)形式是多層次的，可以從形態(tài)特征、細(xì)胞學(xué)特征、生理特征、基因位點(diǎn)及DNA序列等不同的方面來(lái)體現(xiàn)，其中DNA多樣性是遺傳多樣性的本質(zhì)。遺傳多樣性的表現(xiàn)層次第3頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月

對(duì)遺傳多樣性的系統(tǒng)研究始于十九世紀(jì)，達(dá)爾文在《物種起源》中用大量資料和證據(jù)揭示出生物中普遍存在的變異現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)大部分變異有遺傳現(xiàn)象，他把這種可遺傳的變異稱(chēng)為多樣性。隨著孟德?tīng)栠z傳定律的重新發(fā)現(xiàn)，摩爾根染色體遺傳學(xué)及后來(lái)發(fā)展的細(xì)胞遺傳學(xué)的誕生為群體遺傳理論的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)并提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，充分證實(shí)了自然界中確實(shí)存在大量的遺傳變異。遺傳多樣性的研究第4頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月

隨著生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷進(jìn)步，以及實(shí)驗(yàn)條件和方法的不斷改進(jìn)，檢測(cè)遺傳多樣性的方法日益成熟和多樣化，可以從不同的角度和層次來(lái)揭示物種的變異。遺傳標(biāo)記（geneticmarkers）的發(fā)展經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)標(biāo)記（morphologicalmarkers）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytologicalmarkers）、生物化學(xué)標(biāo)記（biochemicalmarkers）和分子標(biāo)記（molecularmarkers）4各階段。第5頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標(biāo)記是指以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。

形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和同工酶標(biāo)記都是基因表達(dá)的結(jié)果，是對(duì)基因的間接反映，標(biāo)記數(shù)目有限、多態(tài)性差。DNA分子標(biāo)記是以個(gè)體間核苷酸序列差異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平上遺傳變異的直接反映，能更準(zhǔn)確的揭示種、變種、品種、品系乃至無(wú)性系間的差異。DNA分子標(biāo)記第6頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月DNA標(biāo)記的優(yōu)越性較高的可靠性，直接以DAN的形式表現(xiàn)，不受環(huán)境因素、取樣部位和發(fā)育階段的影響，不存在基因表達(dá)與否的問(wèn)題；數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組；多態(tài)性高，自然存在著許多變異；表現(xiàn)為“中性”，不影響目的基因的表達(dá)，與不良性狀無(wú)必然的連鎖；有許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別純合基因型與雜合基因型。第7頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月根據(jù)依賴(lài)的技術(shù)手段的不同，DNA分子標(biāo)記可分為3大類(lèi)：第一類(lèi)是以雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）標(biāo)記、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性（VNTR）標(biāo)記；第二類(lèi)是基于PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記、任意RCP（AP-PCR）標(biāo)記、DNA指紋（DAF）標(biāo)記、序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（SCAR）標(biāo)記、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記、內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ISSR）標(biāo)記等；第三類(lèi)是基于測(cè)序和DAN芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記等。第8頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月理想的DNA分子標(biāo)記應(yīng)具備的特點(diǎn)遺傳多樣性高共顯性遺傳在基因組中大量存在且分布均勻表現(xiàn)為“中性”，對(duì)目標(biāo)性狀表達(dá)無(wú)不良影響，與不良性狀無(wú)必然連鎖穩(wěn)定性、重現(xiàn)性高信息量大，分析效率高檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快捷，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化開(kāi)發(fā)成本和使用成本低第9頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月

RFLP是最早發(fā)展的分子標(biāo)記，用已知的限制性?xún)?nèi)切酶消化從生物體中提取的DNA，經(jīng)過(guò)電泳、印跡、探針雜交，最后用放射自顯影顯色或發(fā)光分析顯示與探針互補(bǔ)的DNA片段，因?yàn)槊糠N限制酶只識(shí)別專(zhuān)一的堿基序列，DNA序列的變化就會(huì)導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的減少或增加，限制性片段的長(zhǎng)度發(fā)生變化從而顯示多樣性。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）標(biāo)記第10頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月第11頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月RFLP標(biāo)記特點(diǎn)：呈孟德?tīng)栠z傳，不受環(huán)境影響；RFLP標(biāo)記等位基因之間呈共顯性；非等位的RFLP標(biāo)記之間不存在上位效應(yīng)及其它形式的基因互作；結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。RFLP標(biāo)記的缺點(diǎn)：分析程序復(fù)雜，技術(shù)難度大，費(fèi)時(shí)，成本高，需要適合的探針和放射性同位素，而且每次反應(yīng)需要的DNA量較大，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目有限，所以應(yīng)用受一定的限制。第12頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月

RAPD技術(shù)是由Williams和Welsh領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)小組同時(shí)提出的，Williams稱(chēng)之為RAPD，Welsh稱(chēng)之為AP-PCR。它是利用一個(gè)隨機(jī)序列的寡核苷酸引物，通常為10個(gè)核苷酸，以基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記第13頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月RAPD優(yōu)點(diǎn)：1)不需要了解研究對(duì)象基因組的任何序列，只需很少純度不高的模板，就可以檢測(cè)出大量的信息。2)無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)反應(yīng)引物，隨機(jī)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為8-10個(gè)堿基的核苷酸序列就可應(yīng)用。3)操作簡(jiǎn)便，不涉及分子雜交、放射自顯影等技術(shù)。4)需要很少的DNA樣本。5)不受環(huán)境、發(fā)育、數(shù)量性狀遺傳等的影響，能夠客觀地提示供試材料之間DNA的差異。第14頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月RAPD局限性：它呈顯性遺傳標(biāo)記（極少數(shù)共顯性），不能有效區(qū)分雜合子和純合子。易受反應(yīng)條件的影響，某些情況下，重復(fù)性較差，可靠性較低，對(duì)反應(yīng)的微小變化十分敏感。如聚合酶的來(lái)源，DNA不同提取方法，Mg2+離子濃度等都需要嚴(yán)格控制。第15頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月AFLP是1993年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的新方法。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是先利用限制性?xún)?nèi)切酶水解基因組DNA產(chǎn)生不同大小的DNA片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板DNA，然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加1-3個(gè)選擇性核苷酸作引物對(duì)模板DNA基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同檢測(cè)出多態(tài)性。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記第16頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月第17頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月AFLP分子標(biāo)記的特點(diǎn)DNA需要量少，檢測(cè)效率高，理論上可產(chǎn)生無(wú)限多的AFLP標(biāo)記。一個(gè)0.5mg的DNA樣品可做4000個(gè)反應(yīng)。由于AFLP分析可采用多種不同類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶及不同數(shù)目的選擇性堿基，因此理論上AFLP可產(chǎn)生無(wú)限多的標(biāo)記數(shù)并可覆蓋整個(gè)基因組。多態(tài)性高。AFLP分析可以通過(guò)改變限制性?xún)?nèi)切酶和選擇性堿基的種類(lèi)與數(shù)目，來(lái)調(diào)節(jié)擴(kuò)增的條帶數(shù)，具有較強(qiáng)的多態(tài)分辨能力。第18頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月AFLP分子標(biāo)記的特點(diǎn)可靠性好，重復(fù)性高。AFLP分析采用特定引物擴(kuò)增，退火溫度高，使假陽(yáng)性降低，可靠性增高。AFLP標(biāo)記在后代中的遺傳和分離中遵守孟德?tīng)柖?；種群中的AFLP標(biāo)記位點(diǎn)遵循Hardy-Weinberg平衡。對(duì)DNA模板質(zhì)量要求高，對(duì)其濃度變化不敏感。AFLP反應(yīng)對(duì)模板濃度要求不高，在濃度相差1000倍的范圍內(nèi)仍可得到基本一致的結(jié)果。但該反應(yīng)對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較為嚴(yán)格，DNA的質(zhì)量影響酶切、連接擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行。第19頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月AFLP技術(shù)的應(yīng)用：AFLP具有可靠性好，重復(fù)性強(qiáng)，可信度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究，在動(dòng)物遺傳育種、動(dòng)物基因組研究中有著廣泛的應(yīng)用前景，如：構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；利用AFLP快速鑒別與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；AFLP輔助的輪回選擇育種；利用AFLP技術(shù)研究基因表達(dá)與調(diào)控；分類(lèi)和進(jìn)化研究；甲基化研究，等。第20頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite），又稱(chēng)為短串聯(lián)重復(fù)序列(simpletandemrepeats,STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simplesequencerepeats），是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛。

微衛(wèi)星標(biāo)記第21頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成與分布，微衛(wèi)星被分為3類(lèi)：?jiǎn)渭儯╬ure）SSR：指由單一的重復(fù)單元所組成的序列，如(AT)n；復(fù)合（compound）SSR：是由2個(gè)或多個(gè)重復(fù)單元組成的序列，如(GT)n(AT)m；間隔（interrupted）SSR：在重復(fù)序列中有其它核苷酸夾雜其中，如(GT)nGG(GT)m。第22頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月微衛(wèi)星標(biāo)記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計(jì)算等位基因頻率。第23頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月第24頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月SSR標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)：一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)；微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；所需DNA量少。缺點(diǎn)：微衛(wèi)星引物的通用性還不夠高，一個(gè)物種的特異微衛(wèi)星引物在別的物種中使用時(shí)要進(jìn)行篩選，且多在較近緣的物種間利用，否則可信度會(huì)受影響；微衛(wèi)星引物較貴，成本較高。第25頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月

EST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單一次測(cè)序獲得的短的cDNA部分序列，代表一個(gè)完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫(kù)中其長(zhǎng)度一般從20到7000bp不等，平均長(zhǎng)度為360±120bp。EST來(lái)源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，因此EST也能說(shuō)明該組織中各基因的表達(dá)水平。

表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）標(biāo)記第26頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月第27頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月EST構(gòu)建的技術(shù)路線(xiàn)：提取樣品的總RNA或帶有polyA的mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)，隨機(jī)挑取大量克隆進(jìn)行EST測(cè)序?qū)y(cè)得的EST進(jìn)行組裝、拼接對(duì)網(wǎng)上已有的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較確定EST代表的是已知基因還是未知基因?qū)蜻M(jìn)行定位、結(jié)構(gòu)、功能檢測(cè)分析第28頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月EST的應(yīng)用：EST作為表達(dá)基因所在區(qū)域的分子標(biāo)簽因編碼DNA序列高度保守而具有自身的特殊性質(zhì)，與來(lái)自非表達(dá)序列的標(biāo)記(如AFLP、RAPD、SSR等)相比更可能穿越家系與種的限制，因此EST標(biāo)記在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間比較基因組連鎖圖和比較質(zhì)量性狀信息是特別有用。同樣，對(duì)于一個(gè)DNA序列缺乏的目標(biāo)物種，來(lái)源于其他物種的EST也能用于該物種有益基因的遺傳作圖，加速物種間相關(guān)信息的迅速轉(zhuǎn)化。第29頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月EST作用具體表現(xiàn)在：用于構(gòu)建基因組的遺傳圖譜與物理圖譜；作為探針用于放射性雜交；用于定位克??；借以尋找新的基因；作為分子標(biāo)記；用于研究生物群體多態(tài)性；用于研究基因的功能；有助于藥物的開(kāi)發(fā)、品種的改良；促進(jìn)基因芯片的發(fā)展等方面。第30頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月SNP全稱(chēng)SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。從理論上來(lái)看每一個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4種不同的變異形式,但實(shí)際上發(fā)生的只有兩種,即轉(zhuǎn)換和顛換,二者之比為1:2。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁,而且多是C轉(zhuǎn)換為T(mén),原因是CG中的C常為甲基化的,自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言,SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記第31頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩?lái)說(shuō)，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingSNP，cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周?chē)蛄械?/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。第32頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月從對(duì)生物的遺傳性狀的影響上來(lái)看，cSNP又可分為2種：同義cSNP(synonymouscSNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；同義cSNP(non-synonymouscSNP),指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。第33頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月SNP的特性SNP數(shù)量多，分布廣泛SNP適于快速、規(guī)?；Y查SNP等位基因的頻率容易估計(jì)易于基因分型第34頁(yè),共38頁(yè)，星期六，2024年，5月SNP的檢測(cè)技術(shù)一、基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)：是在固相支持介質(zhì)上進(jìn)行分子雜交和原位熒光檢測(cè)的一種高通量SNP分析方法。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是高通量，一次可對(duì)多個(gè)SNP進(jìn)行規(guī)模性篩選，被撿起始材料也很少，操作步驟簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)是芯片設(shè)計(jì)成本高，由于DNA樣品的復(fù)雜性