免疫學(xué)檢測技術(shù)專家講座

第十五章

免疫學(xué)檢測技術(shù)

IMMUNOLOGICALTECHNIQUES廣州醫(yī)科大學(xué)中法霍夫曼研究所B1-207李孜37103800（O）免疫學(xué)檢測技術(shù)第1頁抗原-抗體反應(yīng)免疫細(xì)胞檢測免疫分子檢測免疫檢測方法應(yīng)用內(nèi)容免疫學(xué)檢測技術(shù)第2頁抗原-抗體反應(yīng)特點(diǎn)抗原-抗體反應(yīng)原因抗原-抗體反應(yīng)檢測技術(shù)第一節(jié)抗原-抗體反應(yīng)免疫學(xué)檢測技術(shù)第3頁1.高度特異性:抗體親和力、交叉反應(yīng)2.可逆性：非共價(jià)結(jié)合（氫鍵、疏水鍵等）親和力；適當(dāng)環(huán)境原因3.百分比性：最適百分比才能可見兩階段：

特異性結(jié)合階段：抗原-抗體互補(bǔ)結(jié)合可見反應(yīng)階段：大復(fù)合物一、抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)**免疫學(xué)檢測技術(shù)第4頁百分比性免疫學(xué)檢測技術(shù)第5頁1.抗原抗體性質(zhì)：關(guān)鍵原因

抗體特異性、親和力；抗原、抗體濃度2.溫度

37℃最適溫度3.溶液pH值最正確6-84.電解質(zhì)：抗原抗體等電點(diǎn)為pH3-5或4-6不等。使抗原抗體復(fù)合物失去電荷而聚集二、抗原抗體反應(yīng)影響原因**免疫學(xué)檢測技術(shù)第6頁三、抗原抗體反應(yīng)檢測技術(shù)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標(biāo)識技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)免疫學(xué)檢測技術(shù)第7頁（一）凝集反應(yīng)（agglutination）**

顆粒性抗原+對應(yīng)抗體（細(xì)菌、螺旋體、細(xì)胞或表面包被抗原顆粒狀物質(zhì)）適量電解質(zhì) 百分比適當(dāng)

凝集顆粒

肉眼可見Ag-Ab復(fù)合物免疫學(xué)檢測技術(shù)第8頁玻片凝集試驗(yàn)：為定性試驗(yàn)，用于判定抗原，如菌種判定、ABO血型判定等1.直接凝集反應(yīng)(directagglutinationreaction)試管凝集試驗(yàn)：為半定量試驗(yàn)，用于檢測抗體效價(jià)，如診療傷寒、副傷寒肥達(dá)試驗(yàn)1.1原理：1.2分類：免疫學(xué)檢測技術(shù)第9頁2.間接凝集反應(yīng)(indirectagglutinationreaction)(正向)間接凝集反應(yīng)：檢測未知Ab,如類風(fēng)濕因子檢測反向間接凝集反應(yīng)：檢測未知Ag，如早孕診療HCG2.1原理：將可溶性抗原或抗體吸附于一些載體顆粒上，形成致敏顆粒，然后與對應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)而產(chǎn)生凝集現(xiàn)象2.2分類免疫學(xué)檢測技術(shù)第10頁3.協(xié)同凝集反應(yīng)(co-agglutinationreaction)將抗體IgGFc段結(jié)合至葡萄球菌A蛋白（SPA），葡萄球菌表面Fab段與抗原結(jié)合，使葡萄球菌凝集原理實(shí)際是反向間接凝集反應(yīng)：載體是葡萄球菌S.aureusAb免疫學(xué)檢測技術(shù)第11頁（二）沉淀反應(yīng)（precipitation）**血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與對應(yīng)抗體→→出現(xiàn)可見沉淀物一定條件下免疫學(xué)檢測技術(shù)第12頁1.單向瓊脂擴(kuò)散（單擴(kuò)）可用于血清中免疫球蛋白、C3、AFP或其它可溶性抗原定量測定免疫學(xué)檢測技術(shù)第13頁免疫學(xué)檢測技術(shù)第14頁2.雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（雙擴(kuò)）應(yīng)用可用于抗原或抗體定性、定量及組分分析1234567免疫學(xué)檢測技術(shù)第15頁3.免疫電泳應(yīng)用：對各種抗原成份復(fù)合物進(jìn)行抗原種類分析，如對血清蛋白組分分析，用于骨髓瘤、性聯(lián)低丙種球蛋白血癥輔助診療免疫學(xué)檢測技術(shù)第16頁4.速率散射比濁法/免疫比濁法原理:是在一定抗體中分別加入遞增量抗原,經(jīng)一定時(shí)間后形成免疫復(fù)合物，使反應(yīng)體系展現(xiàn)不一樣濁度。用濁度儀測量液體濁度，可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中抗原含量。優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便,取代了傳統(tǒng)環(huán)狀沉淀和絮狀

沉淀反應(yīng)。應(yīng)用:檢測前白蛋白、α2巨球蛋白、尿微量蛋白及血清IgG、IgA、IgM和補(bǔ)體等免疫學(xué)檢測技術(shù)第17頁(三)免疫標(biāo)識技術(shù)概念：免疫標(biāo)識技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)與標(biāo)識技術(shù)相結(jié)合，以檢測抗原或抗體一類試驗(yàn)方法。慣用標(biāo)識物：熒光素、酶、放射性核素、膠體金及化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、快速，可定性、定量甚至可定位檢測。免疫學(xué)檢測技術(shù)第18頁慣用免疫標(biāo)識技術(shù)：酶免疫測定法（EIA）免疫熒光技術(shù)（IFA）放射免疫測定法（RIA）化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)（CLIA）免疫膠體金技術(shù)免疫印跡法(Westernblotting)免疫PCR酶熒光素放射性核素化學(xué)發(fā)光物質(zhì)膠體金顆粒免疫學(xué)檢測技術(shù)第19頁酶免疫測定法**（enzymeimmunoassay，EIA）是用酶標(biāo)識抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。其將抗原抗體特異性與酶高效催化作用相結(jié)合，經(jīng)過酶作用于底物后顯色來判定結(jié)果。慣用酶有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）等慣用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法，前者測定可溶性抗原或抗體，后者測定組織或細(xì)胞中抗原。免疫學(xué)檢測技術(shù)第20頁1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）既可檢測抗原，又可檢測抗體簡便、快速，靈敏度高，應(yīng)用最廣泛ELISA法包含：雙抗體夾心法、間接ELISA、BAS-ELISA和微粒捕捉酶免疫分析技術(shù)（MEIA）等。免疫學(xué)檢測技術(shù)第21頁包被一抗加入抗原加入酶標(biāo)一抗加入反應(yīng)底物 測量光密度洗滌洗滌洗滌ELISA雙抗體夾心法示意圖免疫學(xué)檢測技術(shù)第22頁12345678免疫學(xué)檢測技術(shù)第23頁生物素-親和素系統(tǒng)-ELISA（biotin-avidinsystem-ELISA，BAS-ELISA）生物素（biotin，B）：輔酶R或者維生素H親和素（avidin，A）：堿性糖蛋白，一個(gè)親和素分子可結(jié)合四個(gè)生物素分子Ag免疫學(xué)檢測技術(shù)第24頁2)免疫組化技術(shù)（IMMUNOHISTOCHEMISTRYASSAY,IHC）免疫學(xué)檢測技術(shù)第25頁2.免疫熒光法**（immunofluorescenceassay,IFA）是用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待測抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對標(biāo)本中抗原作判定和定位。慣用熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）：發(fā)黃綠色熒光藻紅蛋白（PE）：發(fā)紅色熒光免疫學(xué)檢測技術(shù)第26頁直接免疫熒光與間接免疫熒光免疫學(xué)檢測技術(shù)第27頁激光共聚焦顯微檢測+IFA免疫學(xué)檢測技術(shù)第28頁3.免疫印跡技術(shù)(WESTERNBLOTTING)免疫學(xué)檢測技術(shù)第29頁4.放射免疫測定（RADIOIMMUNOASSAY,RIA）放射性核素標(biāo)識抗原或抗體優(yōu)點(diǎn)：高度靈敏性，可進(jìn)行超微量分析缺點(diǎn)：有放射性危害免疫學(xué)檢測技術(shù)第30頁5.化學(xué)發(fā)光免疫分析（CHEMILUMINESCENCEIMMUNOASAY,CLIA）化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)識抗原或抗體：吖啶酯或魯米諾靈敏性高，操作簡便luminol+hydrogenperoxide→3-APA[?]→3-APA+light免疫學(xué)檢測技術(shù)第31頁6.免疫膠體金技術(shù)（IMMUNOGOLDLABELINGTECHNIQUE）膠體金顆粒標(biāo)識抗原或抗體廣泛用于快速檢測試劑盒（HBsAg,HCG等）已結(jié)合有Ag已結(jié)合有抗抗體免疫學(xué)檢測技術(shù)第32頁7.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（抗原芯片、

抗體芯片）免疫學(xué)檢測技術(shù)第33頁8.免疫PCR（IMMUNO-PCR）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，polymerasechainreactionDNA分子標(biāo)識免疫學(xué)檢測技術(shù)第34頁外周血單個(gè)核細(xì)胞分離T、B淋巴細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞功效檢測

第二節(jié)免疫細(xì)胞檢測免疫學(xué)檢測技術(shù)第35頁一、外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離**葡聚糖-泛影葡胺（淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法分離PBMC免疫學(xué)檢測技術(shù)第36頁二、淋巴細(xì)胞及其亞群分離（一）免疫吸附分離法(淘選法)

將已知針對細(xì)胞表面標(biāo)志抗體包被培養(yǎng)皿,加入淋巴細(xì)胞懸液,表示對應(yīng)表面標(biāo)識細(xì)胞即與對應(yīng)抗體結(jié)合,而貼附于固相載體上從而與懸液中其它細(xì)胞分開.免疫學(xué)檢測技術(shù)第37頁利用表面標(biāo)志分離淋巴細(xì)胞（淘選法）免疫學(xué)檢測技術(shù)第38頁（二）免疫磁珠法（immunemagneticbead,IBM）

將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)志抗體交聯(lián)于磁性微珠（平均直徑<1.5μm),即成為免疫磁珠,將其與細(xì)胞懸液反應(yīng)后,磁珠借抗體結(jié)合于對應(yīng)細(xì)胞群或細(xì)胞亞群表面.再將細(xì)胞懸液加于一試管內(nèi)并置磁場中,因免疫磁珠被磁場吸引,就可將免疫磁珠結(jié)合細(xì)胞與未結(jié)合細(xì)胞分離開來。如借此可分離取得高純度淋巴細(xì)胞.陽性分離法陰性分離法免疫學(xué)檢測技術(shù)第39頁MACS微珠進(jìn)行磁性標(biāo)識未標(biāo)識細(xì)胞

先行流出洗脫陽性分選細(xì)胞免疫磁珠分離(IMB):淋巴細(xì)胞亞群免疫學(xué)檢測技術(shù)第40頁（三）熒光激活細(xì)胞分離儀分離法(FACS)又稱流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM）

集光學(xué)、流體力學(xué)、電力學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體，可對細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量測定和綜合分析，并可進(jìn)行分選。速度快、精度高、準(zhǔn)確性好免疫學(xué)檢測技術(shù)第41頁免疫學(xué)檢測技術(shù)第42頁（四）抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)原理:用生物素化抗原肽-MHCI類分子復(fù)合物與熒光標(biāo)識親和素（抗生物素蛋白）結(jié)合,因?yàn)?個(gè)熒光素標(biāo)識親合素可結(jié)合4個(gè)生物素分子,能使4個(gè)抗原肽-MHCI類分子復(fù)合物形成一個(gè)復(fù)合體,將該復(fù)合體標(biāo)識熒光素后,即成抗原特異性四聚體.該四聚體能與樣品中特異性T細(xì)胞TCR結(jié)合,因?yàn)樗木垠w能同時(shí)結(jié)合一個(gè)T細(xì)胞表面4個(gè)TCR,親和力大大提升.應(yīng)用:可判定表示抗原特異性TCRT細(xì)胞亞群**免疫學(xué)檢測技術(shù)第43頁抗原肽－MHC分子四聚體技術(shù)免疫學(xué)檢測技術(shù)第44頁三、免疫細(xì)胞功效測定（一）T細(xì)胞功效測定1.T細(xì)胞增殖試驗(yàn)PHA、ConA等絲裂原以及抗CD3單克隆抗體等能非特異地活化培養(yǎng)T細(xì)胞使其淋巴母細(xì)胞化，并使其增殖。在此過程中，細(xì)胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成增加，細(xì)胞形態(tài)改變，最終細(xì)胞分裂。形態(tài)計(jì)數(shù)法形態(tài)改變[3H]-TdR摻入法DNA復(fù)制MTT比色法代謝增強(qiáng)

免疫學(xué)檢測技術(shù)第45頁遲發(fā)型（IV型）超敏反應(yīng)（DTH）檢測——皮試法，用于檢測T細(xì)胞功效原理：外來抗原刺激機(jī)體后，再用相同抗原做皮試。陽性反應(yīng)：皮試24~72小時(shí)出現(xiàn)局部紅腫硬結(jié)（效應(yīng)T細(xì)胞與特異性抗原結(jié)合作用后，引發(fā)以單核細(xì)胞浸潤和組織損傷為主要特征炎癥反應(yīng)）免疫學(xué)檢測技術(shù)第46頁（二）細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測CTL、NK等殺傷靶細(xì)胞活性方法：51Cr釋放法：金標(biāo)準(zhǔn)，51Cr與胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定結(jié)合乳酸脫氫酶（LDH）釋放法：正常細(xì)胞不會釋放LDH細(xì)胞凋亡檢測**形態(tài)學(xué)檢測法瓊脂糖凝膠電泳法TUNEL法流式細(xì)胞術(shù)（FCM）免疫學(xué)檢測技術(shù)第47頁DNAladdersTUNELaasay免疫學(xué)檢測技術(shù)第48頁（三）B細(xì)胞功效測定血清Ig含量檢測：單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA、免疫比濁法檢測IgG、IgA、IgM含量2.抗體形成細(xì)胞測定

(1)溶血空斑形成試驗(yàn)

免疫學(xué)檢測技術(shù)第49頁（2)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定（ENZYME-LINKEDIMMUNOSPOTASSAY,ELISPOT）檢測B細(xì)胞產(chǎn)生抗體或者細(xì)胞分泌CK免疫學(xué)檢測技術(shù)第50頁（四）吞噬細(xì)胞功效測定2.氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)試驗(yàn)

NBT是一個(gè)水溶性淡黃色染料，被吞噬細(xì)胞吞入胞漿后，可被胞內(nèi)產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物–超氧陰離子（O-2）還原成不溶性藍(lán)黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中，光鏡下計(jì)數(shù)NBT陽性細(xì)胞，可反應(yīng)中性粒細(xì)胞殺傷功效。1.巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)免疫學(xué)檢測技術(shù)第51頁（五）細(xì)胞因子檢測生物學(xué)活性檢測法分子生物學(xué)檢測免疫學(xué)檢測法①ELISA(雙抗體夾心法)檢測分泌細(xì)胞因子②流式細(xì)胞術(shù):檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子③酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）檢測： 可檢測T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和B細(xì)胞分泌特異性抗體免疫學(xué)檢測技術(shù)第52頁第三節(jié)免疫學(xué)檢測方法應(yīng)用一、免疫學(xué)檢測方法評定與選擇金標(biāo)準(zhǔn)真、假陽性真、假陰性特異性＝真陰性/（真陰性＋假陽性）×100％敏感性＝真陽性/（真陽性＋假陰性）×100％

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-+resultfact免疫學(xué)檢測技術(shù)第53頁

二、疾病診療

應(yīng)用已知Ab（或Ag）檢測未知Ag(或Ab），從而為感染性和非感染性疾病提供診療或輔助診療1、傳染病實(shí)例：

細(xì)菌性疾病:應(yīng)用直接試管凝集反應(yīng)輔助診療腸熱癥(肥達(dá)反應(yīng))、布氏病(瑞特試驗(yàn))

病毒性疾病:HBV感染診療-ELISA檢測乙肝“兩對半”

HIV感染診療：初篩-ELISA、RIA檢測HIV抗體 確診：免疫印跡技術(shù)檢測HIV抗體2、免疫缺點(diǎn)病實(shí)例：

抗體缺點(diǎn)：免疫比濁法檢測Ig（Bruton?。┩淌杉?xì)胞功效缺點(diǎn)：NBT試驗(yàn)輔助診療CGD

補(bǔ)體缺點(diǎn)：檢測C1INH-遺傳性血管神經(jīng)性水腫診療免疫學(xué)檢測技術(shù)第54頁3.本身免疫病實(shí)例SLE:初診-檢測抗