自動生物化學(xué)分析儀的應(yīng)用與原理教材

自動生物化學(xué)分析儀的應(yīng)用與原理自動生物化學(xué)分析儀的特點:精密度高，功能齊全；可進行吸光度、濃度和酶活力的測定，能使用終點法和連續(xù)監(jiān)測法進行分析；具有快速、簡便、微量、標(biāo)準(zhǔn)化、樣品和試劑用量低等優(yōu)點。第一節(jié)自動生物化學(xué)分析儀的類型

①按反應(yīng)裝置的結(jié)構(gòu)可分為連續(xù)流動式、離心式、分立式和干片式四類。②按自動化程度可分為全自動和半自動型。③按同時可測定項目可分為單通道和多通道兩類。④按儀器的復(fù)雜程度及功能可分為小型、中型和大型三類。一、連續(xù)流動式自動生物化學(xué)分析儀連續(xù)流動式自動生物化學(xué)分析儀是第一代自動分析儀，在測定過程中各待測樣品與試劑混合后的化學(xué)反應(yīng)均在同一管道內(nèi)流動的過程中完成。（一）儀器結(jié)構(gòu)儀器主要構(gòu)成部件有：樣品盤、比例泵、混合器、透析器、恒溫器及檢測裝置組成。（二）工作原理在微機控制下，通過比例泵將標(biāo)本和試劑注入到連續(xù)的管道系統(tǒng)中，在一定的溫度下，在管道內(nèi)完成混合，去除干擾物，保溫，比色測定，信號放大，運算處理，最后將結(jié)果顯示并打印出來。二、離心式自動生物化學(xué)分析儀離心式生物化學(xué)分析儀是1969年發(fā)展起來的一種機型，它的全部檢驗過程是在一個類似離心機轉(zhuǎn)頭樣的圓盤上完成的。（一）儀器結(jié)構(gòu)離心式分析儀由加樣和分析兩個部分組成，加樣部分：包括樣品盤、試劑盤、吸樣臂、試劑臂和電子控制部分等。分析部分：除安裝有特殊的離心轉(zhuǎn)盤外，還有溫控和光學(xué)檢測系統(tǒng)，以及微機信息處理和顯示系統(tǒng)。（二）工作原理先將樣品和試劑分別置于轉(zhuǎn)盤相應(yīng)的凹槽內(nèi)，當(dāng)離心機開動后，受離心力的作用，試劑和樣品相互混合發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)適當(dāng)?shù)臅r間后，各樣品最后流入轉(zhuǎn)盤外圈的比色凹槽內(nèi)，通過比色計檢測。三、分立式自動生物化學(xué)分析儀分立式自動生物化學(xué)分析儀是目前國內(nèi)外多采用的設(shè)計模式，因具有結(jié)構(gòu)簡單、檢測速度快的特點，新設(shè)計開發(fā)的儀器已少采用連續(xù)流動式和離心式。（一）工作原理分立式自動生物化學(xué)分析儀是按人工操作的方式編排程序，并以有序的機械動作代替人工，按程序依次完成各項操作的自動分析儀器。儀器操作過程中的各環(huán)節(jié)用傳送帶連接，按程序依次操作。四、干化學(xué)式自動生物化學(xué)分析儀分析儀是采用干化學(xué)(drychemistry)方法，將發(fā)生在液相反應(yīng)物中的反應(yīng)，轉(zhuǎn)移到一個固相載體上，利用分光檢測系統(tǒng)進行檢測的一類新型儀器。

（一）工作原理干化學(xué)分析儀多采用多層薄膜的固相試劑技術(shù)，僅需將樣品加在固相試劑上進行測定。（二）儀器的類型及特點一種是使用試條的反射光度法系統(tǒng)(reflotronsystem)；另一種是采用膠片涂層技術(shù)的化學(xué)分析系統(tǒng)(vitroschemistrysystem)，它與Reflotron系統(tǒng)的區(qū)別是前者使用試條，后者則使用試劑片或塊狀劑。第二節(jié)自動生物化學(xué)分析儀性能及評價

一、生物化學(xué)自動分析儀性能（一）自動化程度自動化程度是指儀器能夠獨立完成生物化學(xué)測定操作程序的能力。除此之外，自動化程度還包括其他許多內(nèi)容，如單位時間處理標(biāo)本的能力，可同步分析的項目數(shù)等。（二）分析效率分析效率是指在測定方法相同的情況下自動生物化學(xué)分析儀的分析速度。分析速度決定于一次測定中可測樣品多少和可測項目的多少。（三）應(yīng)用范圍儀器的應(yīng)用范圍是儀器的一個綜合性指標(biāo)，包括儀器所能進行的分析方法以及可測定項目的種類，應(yīng)用范圍與儀器的設(shè)計原理及結(jié)構(gòu)有關(guān)。（四）精度與準(zhǔn)確度精度和準(zhǔn)確度是自動生物化學(xué)分析儀提供實驗分析結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度的基礎(chǔ)。自動生物化學(xué)分析儀的精度和準(zhǔn)確度取決于儀器各部件的加工精度和精確的工作狀態(tài)。（五）其他性能除上述指標(biāo)外，儀器的取液量、最小反應(yīng)液體積和測試速度也是我們評價儀器性能的指標(biāo)。二、自動生物化學(xué)分析儀性能評價指標(biāo)常用性能評價指標(biāo)有精密度、波長準(zhǔn)確性、線性以及與其他儀器的相關(guān)性等。

(一)精密度評價批內(nèi)重復(fù)性：測定批內(nèi)重復(fù)性就是對樣品的某一個或幾個項目各重復(fù)測定20次，計算它的CV值即不精密度，然后與廠家的該項技術(shù)指標(biāo)進行比較?？偩芏龋哼x擇某一常用的臨床項目的兩個濃度(有醫(yī)學(xué)決定水平的正常和異常值)，每天做室內(nèi)質(zhì)量控制。然后計算總精密度(ST)。與廠商估計的精密度或臨床要求的精密度比較，將計算好的批內(nèi)精密度和總精密度用χ2檢驗法進行比較，若所計算的χ2值小于表中的χ2，則說明所測精密度與廠商估計值無顯著性差異。

(二)相關(guān)性不同儀器的測定結(jié)果之間不可避免地存在著一定的差別，為了取得一致的結(jié)果，擁有兩臺儀器以上的實驗室，應(yīng)該進行儀器間的校正。在僅有一臺儀器時，為了得到實驗室之間的一致性，也可以用參考實驗室的儀器進行校正。(三)波長校正波長校正包括線性和準(zhǔn)確性的檢查。線性檢查方法是用系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在最大吸收處讀取吸光度，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或用回歸法計算線性相關(guān)。

準(zhǔn)確性檢查的方法有兩種：

①用已知準(zhǔn)確摩爾濃度和摩爾消光系數(shù)(ε)的溶液在其特定波長比色，計算ε=A值／摩爾濃度，然后與標(biāo)準(zhǔn)ε比較。

②與已知準(zhǔn)確波長的儀器比較，如有漂移，應(yīng)進行適當(dāng)?shù)男Ｕ?。第三?jié)自動生物化學(xué)分析儀常用分析方法一、分析方法的種類(一)終點分析法(平衡法)

終點分析法是基于反應(yīng)達到平衡時反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其對光吸收強度的大小，對物質(zhì)進行定量分析的一類方法，它是實驗室最常用的方法之一。一點終點法：一點終點法的特點是使用一種或兩種試劑。當(dāng)樣品和試劑混合后，待測物與試劑的物理化學(xué)反應(yīng)達到終點時，測定吸光度,計算待測物的濃度。該法具有代表性的試驗有：總蛋白、清蛋白、葡萄糖氧化酶法等。一點終點法——在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時，選擇一個時間點測定吸光度值。通常在反應(yīng)終點附近連續(xù)讀兩個吸光度，求出兩點的平均值，并根據(jù)兩點的差值判斷反應(yīng)是否達到平衡。一點終點法的設(shè)置：以R和S混合之前的空氣空白、水空白或試劑空白的吸光度值為測定計算基點，以反應(yīng)達到平衡的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準(zhǔn)曲線通過零點且成直線，對于反應(yīng)速度快的多用。如：GLUTGCH等7/17/202435Al

T（時間）AS+R(吸光度）一點終點法反應(yīng)曲線計算公式：

C=(Am-Ab)*KAm----終點讀數(shù)點的吸光度

Ab----試劑空白吸光度

K----校正系數(shù)兩點終點法：兩點終點法也稱固定時間法，它可以用一種試劑，也可以用兩種試劑。該方法的優(yōu)點是可以消除樣品、試劑的顏色、濁度，以及一些干擾物質(zhì)對測定的干擾。

第二試劑加入以前，選擇某一點讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時間后反應(yīng)達終點后測第二個吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計算結(jié)果。第一點吸光度值由樣本本身或第一試劑與樣品的非特異性反應(yīng)有關(guān)，相當(dāng)于樣品空白，可有效的消除樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。7/17/202439AnTAR2AmS+R1(吸光度）（時間）兩點終點Ax=樣本空白An-k0

Am（體積校正因子）k0

=Sv+RlSv+R1+R2兩點終點法計算公式：

C=(An-K0*Am)*K

K0---體積校正因子K0=(Sv+R1)/(Sv+R1+R2)雙波長法：其原理是檢測計在對一待測物進行檢測時，同時用兩個波長檢測，用主波長的吸光度減去副波長的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)物與待測物同等對待，計算待測物的濃度。雙波長法消除樣品中對測定有干擾的物質(zhì)的影響；在試樣中含有兩個組分a和b時，若要測定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測組分b的最大吸收波長λ1作為測量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長λ2，使組分a在這兩個波長處的吸光度相等。雙波長法試樣溶液在λ2和λ1兩個波長處的吸光度之差，只與待測組分的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān)干擾物質(zhì)1.脂血：吸收光譜300～600nm呈下降趨勢2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm吸收峰3.膽紅素：300～500nm有吸收峰可見它們的吸收峰都較寬，且同測定波長有重疊現(xiàn)象。雙波長法主波長的選擇

反應(yīng)體系中待測組分吸收峰對應(yīng)的波長，盡量避開或減少來自試劑空白和樣本空白對測定組分的干擾，提高特異性和靈敏度。雙波長法輔助波長的選擇：根據(jù)測定波長選擇輔助波長，要求干擾物質(zhì)在測定波長同輔助波長有相同的吸光度，待測物吸光度差異很大。如:鉬酸銨法測P3＋用340nm，而Hb在340及380nm均有較高吸收峰，選380nm作為輔助波長。雙波長法雙波長測定優(yōu)點：①消除噪音干擾②減少雜散光影響③減少樣品本身光吸收的干擾(二)連續(xù)監(jiān)測法測定底物的消耗或產(chǎn)物生成速度的化學(xué)方法稱為連續(xù)監(jiān)測法。它是通過適當(dāng)?shù)膬x器，連續(xù)測定酶促反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時間變化的多點數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計算酶活性濃度。具體方法有：

1．兩點速率法

2．多點速率法

3．回歸法

4．帶速率時間法

(三)比濁測定法通過檢測物質(zhì)對光的散射或透射強度來測定物質(zhì)的方法稱比濁法。免疫透射比濁法是自動生物化學(xué)分析儀常用方法。目前常用的免疫比濁法主要用于血清特種蛋白的檢測，如載脂蛋白、微量蛋白、急性時相反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白以及某些藥物監(jiān)測等。(四)均相酶免疫分析法該類方法是以生物體內(nèi)某種特異性很強的結(jié)合反應(yīng)作為測定基礎(chǔ)，在結(jié)合反應(yīng)中可將某種參加反應(yīng)的反應(yīng)物用標(biāo)記物加以標(biāo)記。利用酶作標(biāo)記物，以抗原抗體相互結(jié)合的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的方法稱酶免疫分析法。

二、自動生物化學(xué)分析儀實驗參數(shù)的設(shè)置主要包括樣品量、試劑量、測定方法、校正方法、反應(yīng)時間、測定波長和控制因素等。

(一)樣品與試劑量樣品與試劑量的確定一般按照試劑說明書上的比例，并結(jié)合儀器的特性進行設(shè)置。儀器的特性有：樣品和試劑的最小加樣量及加量范圍、最小反應(yīng)液的體積等。(二)試劑的選擇單試劑法：在反應(yīng)過程中僅加一次試劑的方法稱單試劑法。其常見的有：

①單試劑單波長法：指在選定的溫度和某一特定的波長，讀取反應(yīng)一定時間時的吸光度的方法。這是單試劑法中最常見的方法。②單試劑雙波長法：單試劑雙波長法主要是為了消除檢測體系或標(biāo)本的混濁而設(shè)置。自動生物化學(xué)分析儀大部分終點分析均用此法。③標(biāo)本空白法：該法使用單波長或雙波長均可，常用本法來做終點分析。雙試劑法:其常見的有:①雙試劑單波長一點法：檢測試劑分成兩部分加入，只讀一次吸光度。

②雙試劑二點法：為了去掉標(biāo)本色素、濁度的影響，也可用雙試劑，在加入第一試劑后讀取一次吸光度，再加第二試劑，反應(yīng)一定時間后再讀取一次吸光度，依兩次吸光度之差計算結(jié)果。

③雙試劑雙波長法(三)測定方法的選擇半自動生物化學(xué)分析儀一般具備其中的一點終點、兩點終點(單試劑)、連續(xù)監(jiān)測法(只能是一種固定方法)。全自動生物化學(xué)分析儀的功能較全面，具有前述的各種方法，可根據(jù)需要進行選擇。

(四)波長的選擇單波長：單波長是用一個波長檢測物質(zhì)的光吸收強度的方法。當(dāng)測定體系中含有一種組分或在混合溶液中待測組分的吸收峰與其他共存物質(zhì)的吸收波長無重疊時，可選用。雙波長：用兩個不同波長檢測。當(dāng)被檢溶液混濁或存在較大的干擾物質(zhì)的光吸收時會出現(xiàn)光散射和非特異性光吸收，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，此時可用雙波長甚至多波長測定，以提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。(五)分析時間的選擇生物化學(xué)反應(yīng)的時間是某一項目所特有的，根據(jù)所采用的測定方法不同而異。反應(yīng)時間應(yīng)根據(jù)試劑說明書或自己試驗觀察，作合理的選擇和設(shè)置。(六)校正方法儀器內(nèi)設(shè)置的校正方法一般包含二點校正、多點校正、線性、非線性(對數(shù)、指數(shù)法、量程法)等。三、實驗用水質(zhì)量及生物化學(xué)實驗室條件(一)實驗用水的質(zhì)量生物化學(xué)自動分析儀對水質(zhì)有嚴(yán)格的要求，水的質(zhì)量直接影響到實驗結(jié)果和儀器的使用期限。因此，每個實驗室均應(yīng)有完善的純化水的來源及管理，才能獲取良好的檢驗質(zhì)量。純化水制備常用方法可分三大類：①蒸