第五章 動物細胞制藥課件

第五章

動物細胞制藥第五章動物細胞制藥第一節(jié)概述1、動物細胞培養(yǎng)的定義動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內取出細胞或者組織，模擬體內的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結構和功能的一門技術。第五章動物細胞制藥2、動物細胞培養(yǎng)的歷史（1）開始----1907，Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液內，培養(yǎng)出神經元。（2）成熟----以人的腫瘤細胞與組織為材料建立的各種細胞系，如Hela細胞系。第五章動物細胞制藥3、動物細胞培養(yǎng)的優(yōu)點（1）細胞經培養(yǎng)后形成的細胞系和細胞株，特征均一。（2）理化環(huán)境可控制，培養(yǎng)物可直接被觀測。（3）提供大量均一的細胞供制備用。（4）便于進行人工篩選。（5）結合顯微影相技術，可觀察細胞代謝活動和反應。目前，動物細胞培養(yǎng)技術已經廣泛應用于病毒學，免疫學，遺傳學，腫瘤學，分化及發(fā)育，細胞毒理試驗，生物技術等各個領域。第五章動物細胞制藥4、動物細胞培養(yǎng)的類別1、動物組織培養(yǎng)2、動物細胞培養(yǎng)（1）細胞團塊單層培養(yǎng)（2）單細胞克隆株培養(yǎng)3、原代細胞培養(yǎng)（1）初代培養(yǎng)（2）細胞株確立培養(yǎng)4、細胞繼代培養(yǎng)第五章動物細胞制藥第二節(jié)動物細胞的生理特點

一、動物細胞的形態(tài)適應功能,形態(tài)各異。離體培養(yǎng)細胞分兩類：貼壁細胞懸浮細胞第五章動物細胞制藥第五章動物細胞制藥⒈貼壁細胞

生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長。兩種形態(tài)：成纖維細胞型上皮細胞型第五章動物細胞制藥動物細胞貼壁生長特性第五章動物細胞制藥⒉懸浮細胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細胞。⒊兼性貼壁細胞生長不嚴格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細胞，小鼠L929細胞。第五章動物細胞制藥（2）超凈工作臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。100級超凈工作臺指標：（≥0.5цm≤3.5粒/L）第五章動物細胞制藥培養(yǎng)器具培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板培養(yǎng)皿第五章動物細胞制藥（4）倒置顯微鏡第五章動物細胞制藥（5）純化水裝置第五章動物細胞制藥二、動物細胞的生理特點⒈細胞的分裂周期長細胞分裂時間為12～48h，細胞的分裂周期=間期+分裂期間期（G1+S+G2）分裂期（M）第五章動物細胞制藥第五章動物細胞制藥G1期：4～6h合成DNA聚合酶RNA合成S期：6～8hDNA合成G2期：2～5hDNA量加倍,RNA合成M期：0.5～1h染色體分裂第五章動物細胞制藥第五章動物細胞制藥⒉細胞生長需貼附于基質,并有接觸抑制現象。⒊正常二倍體細胞的生長壽命是有限的。

⑴原代培養(yǎng)

⑵有限細胞系

⑶無限細胞系第五章動物細胞制藥⒋動物細胞對周圍環(huán)境要求十分嚴格，對理化因素很敏感：如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。第五章動物細胞制藥⒌動物細胞對培養(yǎng)基要求高：必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、葡萄糖、細胞生長因子、貼壁因子等。第五章動物細胞制藥

⒍動物細胞蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同。動物細胞蛋白質的合成部位：

⑴游離核糖體

⑵粗面內質網的核糖體

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游離核糖體合成蛋白質用于細胞質基質內。

粗面內質網的核糖體合成蛋白質是分泌的，并在膜中整合修飾為蛋白多糖、糖蛋白等，由粗面內質網提供膜形成大囊泡分泌出胞外。第五章動物細胞制藥動物細胞生產藥物缺點:培養(yǎng)條件高、成本貴、產量低。優(yōu)點:分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖基化，與天然產品一致。第五章動物細胞制藥第三節(jié)生產用動物細胞的

要求和獲得一、生產用動物細胞的要求

⒈原代細胞

⒉二倍體細胞系

⒊轉化細胞系第五章動物細胞制藥二、生產用動物細胞的獲得⒈原代細胞是直接取自動物組織器官,經過粉碎消化而獲得的細胞懸液（109/g）。需要大量動物，費錢費勞力。雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞、淋巴細胞。第五章動物細胞制藥⒈原代細胞培養(yǎng)定義：從新鮮供體取得組織細胞后在體外進行首次培養(yǎng)，一般持續(xù)1－4周。步驟：取材---組織分離---培養(yǎng)第五章動物細胞制藥⒉二倍體細胞系原代細胞經過傳代篩選克隆，從多種細胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。第五章動物細胞制藥二倍體細胞的培養(yǎng)意義二倍體細胞：（1）具有二倍性染色體（2n），染色體核型正常。（2）培養(yǎng)條件下只具有有限的生命力，不能進行無限期的分裂繁殖。（3）無致癌性。培養(yǎng)意義：二倍體細胞保留著在位組織正常的細胞性狀。（1）可用于生產疫苗、尿激酶、干擾素等藥物的生產。（2）也可用于細胞遺傳學、細胞分化及衰老的研究、以及藥物的細胞毒性、環(huán)境污染的細胞學檢測。

第五章動物細胞制藥⒊轉化細胞系通過某個轉化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。轉化過程可以是自發(fā)的，和人工的，從腫瘤組織中。第五章動物細胞制藥三、生產常用動物細胞

的特性

MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細胞系。核型為2n=46。有限壽命42～46代。培養(yǎng)基用加小牛血清，同工酶G6PDB型。

第五章動物細胞制藥培養(yǎng)的該細胞株分泌的組織型纖溶酶原激活因子（t-PA）用于治療心肌梗塞，腦栓塞、肺栓塞等血栓病。還可以治療骨髓移植或化療中出現的中性粒細胞減少的粒細胞集落刺激因子等疾病。第五章動物細胞制藥BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現已用于工程細胞構建，表達重組凝血因子Ⅷ已投放市場，用于治療血友病。第五章動物細胞制藥Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清。第五章動物細胞制藥該細胞株適于用于多種病毒的增殖，包括多瘤病毒、脊髓灰質炎、狂犬病毒等，現重組的多種疫苗已投放市場。第五章動物細胞制藥復習與作業(yè)何謂動物細胞工程制藥？有何優(yōu)點？生產用動物細胞有何要求？如何獲得動物工程細胞？第五章動物細胞制藥四、基因工程細胞構建和

篩選在生產中采用更多的更有前景的是融合細胞及采用基因工程構建的各種工程細胞。第五章動物細胞制藥⒈真核細胞基因表達載體的構建使用的載體有兩類：㈠病毒載體牛痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、桿狀病毒㈡質粒載體第五章動物細胞制藥

牛痘病毒：用構建多價疫苗腺病毒、逆轉錄病毒：用于基因治療。桿狀病毒：用于外源基因表達。

第五章動物細胞制藥其作為載體的優(yōu)點：①雙鏈DNA，易重組②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的形成。第五章動物細胞制藥③多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；

第五章動物細胞制藥④多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產生的蛋白質可占全部蛋白質的20%～30%；第五章動物細胞制藥⑤用光學顯微鏡可看到多角體，可以此作為標記物，選陽性克隆。⑥如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達外源基因。第五章動物細胞制藥

質粒載體在細菌和哺乳動物細胞體內都能擴增。都含有如下基本成分：①允許載體在細菌體內擴增的質粒序列。②含有使基因表達的調控元件。

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③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。④有時還帶有選擇性增加拷貝數的擴增系統(tǒng)。第五章動物細胞制藥⒉基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選第五章動物細胞制藥基因載體導動物細胞常用方法是：磷酸鈣沉淀法電穿孔法

第五章動物細胞制藥磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA—磷酸鈣共沉淀物，當和細胞表面接觸時，則通過細胞吞噬作用而將DNA導入。第五章動物細胞制藥

電穿孔法：

借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細胞膜出現瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。轉化率較高，拷貝數低。第五章動物細胞制藥五、細胞庫的建立生產用的工程細胞必須建立兩個細胞庫：⒈原始細胞庫⒉生產用細胞庫第五章動物細胞制藥⒈原始