端粒在皮膚光老化中的作用課件

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科-端粒在皮膚光老化中的作用

-改善皮膚光老化的臨床與基礎(chǔ)端粒在皮膚光老化中的作用1.研究背景光老化：在內(nèi)源性老化的基礎(chǔ)上加之環(huán)境因素（主要為紫外線輻射）的損害而發(fā)生的外源性老化，臨床上表現(xiàn)為提前出現(xiàn)更加嚴(yán)重的老化表現(xiàn)。

PH端粒與光老化端粒在皮膚光老化中的作用

空白組1UVA組8-MOP+UVA組空白組UVA8-MOP+UVA8-MOP+UVA

照光三個(gè)月的小鼠皮膚

光老化皮膚的動(dòng)物模型觀察光損傷作用端粒在皮膚光老化中的作用照光7d后各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)8-MOP+UVA組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞衰老改變:胞漿中可見(jiàn)較多空泡，細(xì)胞核中可見(jiàn)較多絮狀物,核仁不清晰，局部出現(xiàn)核膜內(nèi)褶,核內(nèi)染色質(zhì)凝集且分布不均。線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,脫顆粒，可見(jiàn)較多次級(jí)溶酶體。

8000×

8-MOP+UVA組

15000×8000×

UVA組

15000×8000×

8-MOP組

15000×8000×

對(duì)照組

15000×端粒在皮膚光老化中的作用端粒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)--光損傷易感性：光老化中紫外線引起的基因的氧化應(yīng)激損傷，大部分情況下發(fā)生在鳥(niǎo)嘌呤殘基；端粒的重復(fù)序列TTAGGG二分之一是鳥(niǎo)嘌呤殘基且3’末端也富含鳥(niǎo)嘌呤。-TTAGGG-結(jié)構(gòu)2.端粒與光老化端粒在皮膚光老化中的作用NB-UVB和PUVA：臨床上光療法（治銀屑病、白癜風(fēng)）的主要副作用之一是皮膚易出現(xiàn)光老化外觀光老化模型：已聯(lián)合利用8-MOP+UVA建立小鼠皮膚光老化模型，在此基礎(chǔ)上利用人皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)相同處理建立體外光老化模型內(nèi)源性老化中的端?？s短機(jī)制1.是否參與紫外線輻射引起的光老化？2.光老化進(jìn)程中光損傷是如何加快端粒縮短的？端粒在皮膚光老化中的作用研究?jī)?nèi)容——實(shí)驗(yàn)流程對(duì)照組8-MOP組

or8-MOP+UVAUVA組MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞化學(xué)酶法檢測(cè)β-半乳糖苷酶

處理后24h，48h,72h,7d分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷水平：MDA,SOD及T-AOC免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化光產(chǎn)物8-oxo-dGReal-TimePCR檢測(cè)端粒的相對(duì)長(zhǎng)度：T/SWesternBlot檢測(cè)細(xì)胞老化相關(guān)蛋白P53,P21WAF-1及

P16INK-4a

藥物組端粒在皮膚光老化中的作用

1.各組細(xì)胞照光處理后各時(shí)間段細(xì)胞半乳糖苷酶陽(yáng)性率

對(duì)照組8-MOP組UVA組8-MOP+UVA組照光后24h、48h、72h及7d后8-MOP+UVA聯(lián)合處理組SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞比例較對(duì)照組均明顯增高（*P<0.01），且隨時(shí)間積累而逐漸增高（r=0.988)。結(jié)論：

8-MOP+UVA聯(lián)合作用可使皮膚FB出現(xiàn)光老化生物學(xué)特性改變SA-β-Gal電鏡端粒在皮膚光老化中的作用2.照光后2h各組細(xì)胞光產(chǎn)物8-oxo-dG8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤

對(duì)照組

UVA組***8-MOP+UVA組8-oxo-dG陽(yáng)性細(xì)胞核比例明顯高于對(duì)照組（**P<0.01

）；UVA組8-oxo-dG陽(yáng)性細(xì)胞核比例也明顯高于對(duì)照組（*P<0.05

）；而8-MOP處理組較對(duì)照組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05

）

端粒在皮膚光老化中的作用3.Real-TimePCR檢測(cè)各組細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度比較8-MOP+UVA聯(lián)合處理組端粒相對(duì)長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照組（2.57±0.05vs6.63±0.12，P<0.01）UVA照射組（4.59±0.07vs6.63±0.12,）8-MOP+UVA聯(lián)合處理組（2.57±0.05vs4.59±0.07）端粒相對(duì)長(zhǎng)度經(jīng)t檢驗(yàn)比較均短于對(duì)照組（P<0.05）

，后者端粒長(zhǎng)度更短。而8-MOP處理組（6.62±0.09）與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）

***端粒在皮膚光老化中的作用4.WB檢測(cè)各組細(xì)胞老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平各組老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較8-MOP+UVA聯(lián)合處理組P53,P21WAF-1及P16INK-4a蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P值均<0.01），而UVA輻射組相關(guān)蛋白水平也有明顯增高（P值均<0.05），8-MOP+UVA聯(lián)合處理組及UVA照射組兩組間經(jīng)t檢驗(yàn)比較，前者相應(yīng)蛋白表達(dá)水平均高于后者（P值均<0.05）。端粒在皮膚光老化中的作用討論在UVA照射下，外源性光敏劑8-MOP使細(xì)胞的基因氧化應(yīng)激損傷顯著加重，產(chǎn)生大量氧化光產(chǎn)物8-oxo-dG；oxodeoxyguanosine

8-MOP+UVA聯(lián)合作用后，細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)上由于較多氧化光產(chǎn)物的產(chǎn)生，使其端?？s加速，提前到達(dá)臨界長(zhǎng)度；

8-MOP+UVA聯(lián)合作用后由于端?？s短加速，提前激活P53老化檢查點(diǎn)，并依次激活下游信號(hào)蛋白-細(xì)胞周期激酶抑制劑P21WAF-1

及P16INK-4a蛋白，相應(yīng)蛋白表達(dá)水平明顯增高；

綜上所述：

8-MOP+UVA聯(lián)合作用可導(dǎo)致基因的氧化應(yīng)激損傷，端粒受損嚴(yán)重，縮短加速，并激活老化相關(guān)蛋白表達(dá)。端粒在皮膚光老化中的作用3.藥物-端粒-光老化細(xì)胞周期生物鐘端粒在皮膚光老化中的作用1.

GS-Rg1有效降低老化特征酶β-半乳糖苷酶表達(dá)各組細(xì)胞照光后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SA-β-Gal及8-oxo-dG表達(dá)水平

GS-Rg1各濃度干預(yù)組基因氧化產(chǎn)物8-oxo-dG及SA-β-Gal陽(yáng)性率均明顯低于光老化模型組（P<0.05）且與藥物劑量負(fù)相關(guān)（r值依次為0.968,0.943）。

***端粒在皮膚光老化中的作用3.

GS-Rg1顯著減緩端?？s短各組細(xì)胞于照光后第7日端粒長(zhǎng)度比較GS-Rg1各濃度干預(yù)組端粒相對(duì)長(zhǎng)度（2.57±0.05）明顯長(zhǎng)于8-MOP+UVA聯(lián)合處理組（6.63±0.12，P<0.01），且各濃度組之間端粒相對(duì)長(zhǎng)度與GS-Rg1濃度有明顯的正相關(guān)，表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性（P<0.05）；高劑量組GS-Rg1干預(yù)組端粒長(zhǎng)度接近對(duì)照組水平，兩者無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）

***端粒在皮膚光老化中的作用4.

GS-Rg1顯著降低老化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

β-Actin

P53P21WAF-1P16INK-4a照光后第7日老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平GS-Rg1各濃度干預(yù)組老化相關(guān)蛋白P53,P21WAF-1及P16INK-4a的表達(dá)水平明顯低于8-MOP+UVA組（P值均<0.01），且各濃度組之間蛋白表達(dá)水平與GS-Rg1藥物濃度有明顯的負(fù)相關(guān)(r1=0.981，r2=0.916，r3=0.914)。端粒在皮膚光老化中的作用GS-Rg1預(yù)處理的人真皮成纖維細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的氧化應(yīng)激耐受性，細(xì)胞內(nèi)基因氧化產(chǎn)物8-oxo-dG產(chǎn)生明顯減少；

GS-Rg1預(yù)處理的細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)中相應(yīng)堿基損傷較光老化模型組明顯減弱，端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性加強(qiáng)，端?？s短減緩；

GS-Rg1預(yù)處理的細(xì)胞由于端?？s短減緩，其對(duì)老化檢查點(diǎn)的激活受抑制，老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低；

綜上所述：GS-Rg1預(yù)處理可阻止基因損傷后對(duì)細(xì)胞老化P53檢查點(diǎn)的激活，抑制其后細(xì)胞周期激酶抑制劑P21WAF-1

及

P16INK-4a的表達(dá)，減弱兩者對(duì)細(xì)胞周期激酶CDK的抑制作用，使得CDK得以和核因子Rb蛋白結(jié)合，Rb蛋白磷酸后促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，使得細(xì)胞恢復(fù)分裂活性。討論端粒在皮膚光老化中的作用1、黃芩苷對(duì)UVA輻射后β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞比率的影響

黃芩苷對(duì)端?？s短及光老化的影響端粒在皮膚光老化中的作用2.黃芩苷對(duì)UVA輻射后細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的影響端粒在皮膚光老化中的作用3.黃芩苷對(duì)UVA輻射后細(xì)胞p53、p16和c-mycmRNA水平的影響p53p16c-myc端粒在皮膚光老化中的作用4.黃芩苷對(duì)UVA輻射后細(xì)胞p16和c-myc蛋白水平的影響端粒在皮膚光老化中的作用結(jié)論人參皂苷-Rg1可有效緩解細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，減少基因中光產(chǎn)物形成，減輕端粒損傷從而抑制端?？s短，阻止端粒臨界長(zhǎng)度激活P53老化檢查點(diǎn)，阻止細(xì)胞周期受抑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平，從而發(fā)揮顯著的抗光老化作用黃芩苷可有效保護(hù)人成纖維細(xì)胞免于氧化損傷和延緩光老化進(jìn)程。其抗光老化機(jī)制包括延緩端?？s短、調(diào)節(jié)老化相關(guān)基因包括p66、p53、p16、c-myc、MMP-1和TIMP-1表達(dá)有關(guān)，但黃芩苷對(duì)細(xì)胞端粒酶活性沒(méi)有影響。端粒在皮膚光老化中的作用光療臨床改善光老化——“Traditonal激光磨削”(臨床圖片)點(diǎn)陣激光（臨床圖片）強(qiáng)脈沖激光治療光老化及保健嫩膚（臨床圖片）端粒在皮膚光老化中的作用

空白2UVA+IPL組8-MOP/UVA+IPLIPL對(duì)小鼠光老化皮膚的改善作用

空白組1

UVA組8-MOP/UVA組LuoD,CaoY,WuD,XuY,ChenB,XueZ/ImpactofintensepulselightirradiationonBALB/cmouseskin-invivostudyoncollagens,matrixmetalloproteinasesandvascularendothelialgrowthfactor.LasersMedSci;2007Dec15.

空白組1UVA組