食品中有害物質(zhì)的檢測-課件

第九章食品中有害物質(zhì)的檢驗有毒有害物質(zhì)（按來源分）外源性內(nèi)源性誘發(fā)性有毒有害物質(zhì)（按特征分）固有有毒有害物質(zhì)污染有毒有害物質(zhì)正常條件下代謝合成應(yīng)激條件下代謝合成直接污染食品

第一節(jié)概述一、有毒有害物質(zhì)的概念從環(huán)境中吸收吸收并轉(zhuǎn)化加工中產(chǎn)生薄層色譜法氣相色譜法高效液相色譜法

質(zhì)譜法色—質(zhì)聯(lián)用酶聯(lián)免疫吸附劑測定二有毒有害物質(zhì)的檢測技術(shù)新興現(xiàn)代分析技術(shù)（生物學(xué)、化學(xué)、儀器）優(yōu)點：

檢測限低多組分同時檢測化學(xué)分析優(yōu)點：價格便宜前處理簡單

第二節(jié)食品中農(nóng)藥殘留的檢驗

農(nóng)藥是指農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中為了預(yù)防、控制、消滅病蟲害及其他有害物質(zhì)，或者是調(diào)節(jié)植物生長而使用的各種化、生物藥劑。我國農(nóng)藥生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢：

目前全世界實際生產(chǎn)和使用的農(nóng)藥的品種為1000多種，我國有近200種，主要是化學(xué)合成生產(chǎn)的。我國現(xiàn)有主要農(nóng)藥合成企業(yè)近400家，已建成700千噸以上原藥生產(chǎn)裝置，可常年生產(chǎn)250多種原藥、農(nóng)藥中產(chǎn)量居世界第二位（美國第一），農(nóng)藥產(chǎn)量呈逐年增長的趨勢。常用的有：有機氯農(nóng)藥和有機磷農(nóng)藥兩類。殺蟲劑有胺丙畏、苯胺硫磷等。殺菌劑有腐霉利、乙霉威等。除草劑有丙草胺、麥草畏等。生長調(diào)節(jié)劑有烯效唑、多效唑、油菜素內(nèi)酯等農(nóng)藥殺蟲劑除草劑植物生長調(diào)節(jié)劑殺菌劑危害最大農(nóng)藥在防治農(nóng)作物病蟲害、控制人類傳染病、提高農(nóng)畜產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量以及確保人體健康等方面，都起著重要的作用。但是，大量廣泛用農(nóng)藥也會造成對食物的污染。

農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥施用后，殘存在生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝產(chǎn)物、降解物和雜質(zhì)的總稱。殘留的數(shù)量叫殘留量。

農(nóng)藥進(jìn)入人體的方式土壤、水、空氣家禽、畜植物、飼料水生動、植物肉、蛋、乳人

一般來說容易生蟲、生蟲后比較難防治的果蔬，常常是農(nóng)藥污染比較嚴(yán)重的品種。如水果中的蘋果、梨、李子、葡萄、草莓、西瓜、橘子、香蕉等農(nóng)藥殘留比較嚴(yán)重，而帶殼的水果如荔枝、龍眼等污染較小。污染較重的蔬菜有葉菜，如小白菜、青菜、雞毛菜、韭菜、菠菜、油菜等，而根菜、瓜菜和果菜（如土豆、南瓜、黃瓜、苦瓜、西紅柿、倭瓜以及洋蔥等）受到農(nóng)藥的污染相對較小，并且這些蔬菜的營養(yǎng)成分也較高。

為提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量，保證食品的安全性，保障消費者身體健康，許多國家都對食品中農(nóng)藥允許殘留量作了規(guī)定。表l和2分別為我國和WHO制訂的有機氯農(nóng)藥六六六、滴滴涕在食品中的允許殘留量標(biāo)準(zhǔn)；表3為我國制訂的有機磷農(nóng)藥在食品中允許殘留量標(biāo)準(zhǔn)；表4為FAO/WHO推薦的部分食品中有機磷農(nóng)藥允許殘留量標(biāo)準(zhǔn)。二、有機氯農(nóng)藥的檢測

有機氯農(nóng)藥是農(nóng)藥中一類有機含氯化合物，一般分為五大類：

1、DDT類——氯化苯及其衍生物，包括DDT、六六六。

2、氯化甲撐萘類——七氯、艾氏劑、狄氏劑。

3、七O五四——純品為白色晶體，微溶于水，易溶于某些有機溶劑。主要用于殺滅蚊蠅。蓄積在動植物脂肪中，通過食物鏈進(jìn)入人體。中毒癥狀為乏力、失眠、眩暈、惡心等，長期接觸可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肝臟。

4、氯丹——純品為無色或淡黃色液體，微溶于水，易溶于某些有機溶劑。中毒情況同70545、林丹（又名高丙體六六六）——本品為無色晶體，不溶于水，溶于大多數(shù)有機溶劑。中毒情況同7054。主要用于糧食、蔬菜、果樹、煙草、森林、糧倉。由于有機氯性質(zhì)穩(wěn)定，在水域、土壤中仍有殘留，并會在較長時間內(nèi)繼續(xù)影響人類健康。

有機氯農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

（1）六六六

六六六分子式為C6H6Cl6，化學(xué)名為六氯環(huán)己烷、六氯化苯，英文名為Benzenehexachl

oride(簡稱BHC)。BHC有多種異構(gòu)體，其常見的異構(gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

BHC為白色或淡黃色固體，純品為無色無臭晶體，工業(yè)品有霉臭氣味，在土壤中半衰期為2年，不溶于水，易溶于脂肪及丙酮、乙醚、石油醚及環(huán)己烷等有機溶劑。BHC對光、熱、空氣、強酸均很穩(wěn)定，但對堿不穩(wěn)定(β—BHC除外)，遇堿能分解(脫去HCl)。

C6H6Cl6十3KOHC6H3Cl3十3KCl十3H2O

(2)滴滴涕

滴滴涕分子式為C14H9Cl15，化學(xué)名為2，2——雙(對氯苯基)——1，1，1一三氯乙烷、二氯二苯三氯乙烷，簡稱二二三，英文名為Dichlorodiphenyl

trichloroethane，簡稱DDT。根據(jù)苯環(huán)上Cl的取代位置不同形成如下幾種異構(gòu)體：

DDT產(chǎn)品為白色或淡黃色固體，純品DDT為白色結(jié)晶，熔點108.5-109℃，在土壤中半衰期3-10年，（在土壤中消失95%需16-33年）。不溶于水，易溶于脂肪及丙酮、CCl4、苯、氯苯、乙醚等有機溶劑。DDT對光、酸均很穩(wěn)定，對熱亦較穩(wěn)定，但溫度高于本身的熔點時，DDT會脫去HCl而生成毒性小的DDE，對堿不穩(wěn)定，遇堿亦會脫去HCl。1874年人工合成DDT，1939年瑞士化學(xué)家穆勒發(fā)現(xiàn)了DDT的殺昆蟲作用，并因此獲得了1948年的諾貝爾獎。在二次世界大戰(zhàn)中及戰(zhàn)后的歐洲和亞洲，DDT用于殺滅傳播瘧原蟲的蚊子，挽救了數(shù)千人的生命。DDT在生物體內(nèi)富集作用很強。例如水鳥體內(nèi)DDT殘留為25mg/kg，DDT污染的水要高出800-1000萬倍。DDT的污染是全球性的，在人跡罕至的南極的企鵝、海豹、北極的北極熊、甚至未出世的胎兒體內(nèi)均可檢出DDT的存在。2.1定性檢驗

2.1.1焰色法

2.1.1.1原理此法是利用樣品中的有機氯受熱分解為氯化氫，它與銅勺表面的氧化銅作用，生成揮發(fā)性的氯化銅，在無色火焰中呈綠色。用以鑒別樣品提取液中有機氯農(nóng)藥的存在。

2.1.1.2操作步驟取銅小勺在煤氣燈或酒精燈上灼燒，直至銅勺表面覆蓋一層黑色氧化銅為止。取少量懷疑污染有機氯農(nóng)藥的食品，用乙醚浸漬振搖并過濾。將濾液逐滴加在銅勺表面蒸發(fā)，然后進(jìn)行灼燒，呈綠色火焰者，說明食品被有機氯農(nóng)藥(包括DDT及六六六)污染。若樣品中農(nóng)藥含量很低，可將乙醚提取液濃縮蒸干，用少量乙醇溶解殘留物，然后按上法檢驗，本法最低檢出范圍為1ug有機氯。2.1.2．亞鐵氨化銀試紙法

2.1.2.1原理此法是根據(jù)有機氯農(nóng)藥與碳酸鈉灼燒生成氯化鈉。與硫酸作用生成氯化氫。氯化氫與亞鐵氰化銀試紙反應(yīng)，在硫酸鐵存在下產(chǎn)生藍(lán)色，可鑒別有機氯的存在。

2.1.2.2操作步驟

(1)亞鐵氰化銀試紙稱取硝酸銀2．5g、亞鐵氰化鉀1．3g，分別溶于25mL水中。將硝酸銀溶液緩慢加到亞鐵氰化鉀溶液中，離心分離，將沉淀物反復(fù)用水洗滌至不含銀離子為止。在沉淀中加濃氨水25mL，搖勻后，將濾紙浸入懸浮氨溶液中5min，取出試紙用熱風(fēng)吹干，備用.(2)檢測取10．Og左右待測磨碎樣品，置于三角燒瓶中，加入20mL乙醚，振搖后，分出乙醚層。置水浴上揮發(fā)至0．4mI。移入小試管中，加入一勺碳酸鈉，在水浴上蒸干、冷卻。取亞鐵氰化銀試紙條，在1g／L硫酸鐵溶液中浸濕后，懸掛于橡皮塞下。向試管內(nèi)殘渣小心滴入濃硫酸2～3滴，迅速將掛有試紙的橡皮塞塞緊小試管，將試管移入水浴內(nèi)加熱，如果試紙變?yōu)樗{(lán)色，表示樣品中有有機氯農(nóng)藥存在。試驗中應(yīng)防止無機氯的干擾。2.2定量檢驗

2.2.1氣相色譜法(GB／T5009．19—2008)

2.2.1.1原理

樣品中六六六、滴滴涕經(jīng)提取、凈化后用氣相色譜法測定，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。電子捕獲檢測器對于負(fù)電極強的化合物具有較高的靈敏度，利用這一特點，可分別測出微量的六六六和滴滴涕。不同異構(gòu)體和代謝物可同時分別測定。

出峰順序：a-666、β-666、u-666、δ-666、p，p’-DDE、0，p’-DDT、p，p’-DDD、p，p’-DDT。

2.2.1.2儀器與試劑（1）儀器小型粉碎機小型絞肉機組織搗碎機電動振蕩器旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)器吹氮濃縮器氣相色譜儀：具有電子捕獲檢測器(ECD)(2)試劑①丙酮②正己烷；③石油醚：沸程30～60℃；④苯；⑤硫酸；⑥無水硫酸鈉；⑦硫酸鈉溶液(20g／L)；⑧六六六、滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)溶液:作為儲備液存于冰箱中。

⑨六六六、滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)使用液

2.2.1.3操作步驟

（1）提取稱取搗碎后的果蔬樣品50g，加100mL丙酮，振搖1min浸泡1h，過濾并用30mL丙酮洗滌3次，加80mL石油醚，振搖1min，加入2%的硫酸鈉溶液200mL，搖混，分層。將上層石油醚溶液取出經(jīng)無水硫酸鈉濾入至分液漏斗中，提取液定容至100mL。

(2)凈化

100mL提取液加10mL濃硫酸，蓋上試管塞。振搖數(shù)次后，開塞子放氣，然后振搖0.5min。于1600r／min離心15min，上層清液供氣相色譜法分析用。

(3)測定

①氣相色譜參考條件

色譜柱：內(nèi)徑3～4mm，長1．2～2m的玻璃柱，內(nèi)裝涂以O(shè)V-17(15g／L)和QF-1(20g／L)的混合固定液的80～100目硅藻土。

②Ni電子捕獲檢測器：汽化室溫度：215℃；色譜柱溫度；195℃；檢測器溫度：225℃；載氣(氮氣)流速：90mL／min；

③電子捕獲檢測器的線性范圍窄，為了便于定量，選擇樣品進(jìn)樣量使之適合各組分的線性范圍。根據(jù)樣品中六六六、滴滴涕存在形式，相應(yīng)的制備各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算出樣品中的含量。

六六六、滴滴涕及其異構(gòu)體含量按下式計算。

X1＝式中：X1—樣品中六六六或滴滴涕及其異構(gòu)體的單一含量，mg／kg；

A1—樣品中六六六或滴滴涕及其異構(gòu)體的單一含量，ng；

V1—樣品凈化液體積，mL；

V2—樣液進(jìn)樣體積，uL；

m1—樣品質(zhì)量，g。三、有機磷農(nóng)藥的檢測

(一)有機磷農(nóng)藥的特性及種類

1．常見的有機磷農(nóng)藥及其結(jié)構(gòu)

有機磷農(nóng)藥(OrganophosphorusPesticides)是農(nóng)藥中一類含磷的有機化合物，其種類很多，目前大量生產(chǎn)與使用至少有60多種，按其毒性可分成高毒、中等毒及低毒三類；按其結(jié)構(gòu)則可劃分為磷酸酯及硫代磷酸酯兩大類，其結(jié)構(gòu)通式如下：根據(jù)R，Rl及X等基團不相同，可構(gòu)成不同的有機磷農(nóng)藥。2．有機磷農(nóng)藥的理化性質(zhì)

有機磷農(nóng)藥中，除敵百蟲、樂果為白色晶體外，其余有機磷農(nóng)藥的工業(yè)品均為棕色油狀。有機磷農(nóng)藥有特殊的蒜臭味，揮發(fā)性大，對光、熱不穩(wěn)定，并具有如下性質(zhì)：

①溶解性：由于各種有機磷農(nóng)藥的極性強弱不同，故對水及各種有機溶劑的溶解性能也不一樣，但多數(shù)有機磷農(nóng)藥難溶于水，可溶于脂肪及各種有機溶劑，如疏水性有機溶劑：丙酮、石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷及苯等，親水性有機溶劑：二甲基亞砜等。②水解性：因有機磷農(nóng)藥屬酯類(磷酸酯或硫代磷酸酯)，故在一定條件下能水解，特別是在堿性介質(zhì)、高溫、水分含量高等環(huán)境中，更易水解。如敵百蟲在堿性溶液中易水解為毒性較大的敵敵畏。

③氧化性：有機磷農(nóng)藥中，硫代磷酸酯農(nóng)藥在溴作用下或在紫外線照射下，分子中S易被O取代，生成毒性較大的磷酸酯。（二）有機磷農(nóng)藥的檢測

GC法測定-氮磷檢測器

幾種有機磷農(nóng)藥的檢驗標(biāo)準(zhǔn)：馬拉硫磷GB/T5009.36倍硫磷GB/T5009.20甲胺磷GB148763.2.1原理

氣相色譜法－將樣品的峰高或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品相比較做定量分析。本法適用于水果、蔬菜、谷類的檢測。最低檢出量為0.1－0.25ng。3.2.2儀器和試劑

(1)儀器組織搗碎機，粉碎機，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，氣相色譜儀：附有火焰光度檢測器(FPD)。

(2)試劑

丙酮，二氯甲烷，助濾劑Celiee545，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：敵敵畏99％，速滅磷順式60%,久效磷99%，甲拌磷98％，巴胺磷99％，二嗪農(nóng)98％.

3.2.3操作步驟

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷為溶劑，分別配制成1.0mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲于冰箱(4℃)中。使用時用二氯甲烷分別稀釋成1.0ug／mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

(2)試樣制備取糧食樣品粉碎，過20目篩制成糧食試樣；取水果、蔬菜樣品洗凈，晾干，去掉非可食部分后制成待測試樣。

(3)提?、俜Q取50.00g水果、蔬菜試樣，置于300mL燒杯中，加入50mL水和100mL丙酮(總體積150mL)。用組織搗碎機搗1～2min。勻漿液經(jīng)鋪有兩層濾紙和約10gCellte545的布氏漏斗，減壓抽濾。從濾液中分取l00mL，移至500mL分液漏斗中。

②稱取25.00g谷物試樣，置于300mL燒杯中，加入50mL水和100mL丙酮，以下同上一步驟。

(4)凈化向以上兩種濾液中，加人10～15g氯化鈉，使其呈飽和狀態(tài)。猛烈振搖2～3min，靜置10min，使丙酮從水相中鹽析出來，水相用50mL二氯甲烷振搖2min，再靜置分層。將丙酮與二氯甲烷提取液合并，并經(jīng)裝有20～30g無水硫酸鈉的玻璃漏斗脫水，濾人250mL圓底燒瓶中。再以約40mL二氯甲烷分?jǐn)?shù)次洗滌容器和無水硫酸鈉，洗滌液也并入燒瓶中。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至約2mL，濃縮液定量轉(zhuǎn)移至5～25mL容量瓶中，加二氯甲烷定容至刻度。氣相色譜條件色譜柱：a．玻璃柱2.6m×3mm，填裝涂有4.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DC200+2.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))OV-17的ChromosorbWAWDMCS(80～100目)的擔(dān)體。b．玻璃柱2.6m×3mm(i．d．)，填裝涂有1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DCOE-1的ChromosorbWAWI)MCS(60～80目)。氣體速度：氮氣(N2)50mL／min、氫氣(H2)100mL／min、空氣50mL／min。溫度：柱溫240℃，汽化室260℃，檢測器270℃。測定：吸取2～5uL混合標(biāo)準(zhǔn)液及樣品凈化液，色譜儀中，以保留時間定性。以試樣的峰高或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。結(jié)果計算

Xi=式中xi—i組分有機磷農(nóng)藥的含量，mg／kgAi—試樣中i組分的峰面積，積分單位

Asi

—混合標(biāo)準(zhǔn)液中i組分的峰面積，積分單位

V1

—試樣提取液的總體積，mLV2

—凈化用提取液的總體積，mLV3

—濃縮后的定容體積，mLV4—進(jìn)樣體積，mL

Esi—進(jìn)入色譜儀中的i標(biāo)準(zhǔn)組分的質(zhì)量，ngm—樣品的質(zhì)量，g

合成殺蟲劑；分子較大；親脂性強，可溶于多種有機溶劑；在水中的溶解度小；在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下易分解；高效、廣譜、低毒和生物降解等特性；在光和土壤微生物的作用下易轉(zhuǎn)變成極性化合物，（不易造成污染）。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有的共同特點之一是分子結(jié)構(gòu)中含有數(shù)個不對稱碳原子，因而包含多個光學(xué)和立體異構(gòu)體。（這些異構(gòu)體又具有不同的生物活性，即使同一種擬除蟲菊酯，總酯含量相同，若包含的異構(gòu)體的比例不同，殺蟲效果也大不相同。）四、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留及其檢測(一)擬除蟲菊酯的特性及常用品種常見的擬除蟲菊酯有：烯丙菊酯(Allethrin)、胺菊酯(Tetramethrin)、醚菊酯(Ethofenprox)、苯醚菊酯(Phenothrin)、甲醚菊酯(Methothrin)氯菊酯(Permethrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(Dehamethrin)、氰菊酯(Fenpropanate)、殺螟菊酯(Phencyclate)、氰戊菊酯(Fenvalerate)、氟氰菊酯(Flucythrin)、氟胺氰菊酯(Fluvalinate)、氟氰戊菊酯(Flucythtinge)、溴氟菊酯(Bmthrinate)等。目前，已合成的菊酯數(shù)以萬計，迄今已商品化的擬除蟲菊酯有近40個品種，在全世界的殺蟲劑銷售額中占20％左右。擬除蟲菊酯主要應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上，如防治棉花、蔬菜和果樹的食葉和食果害蟲，特別是在有機磷、氨基甲酸酯出現(xiàn)抗藥性的情況下，其優(yōu)點更為明顯。除此之外，擬除蟲菊酯還作為家庭用殺蟲劑被廣泛應(yīng)用，它可防治蚊蠅、蟑螂及牲畜寄生蟲等。(二)擬除蟲菊酯殘留的檢測

參考本節(jié)中有機氯農(nóng)藥殘留的檢測，詳見GB／T17332。

第三節(jié)食品中獸藥殘留與激素殘留的檢驗一、獸藥殘留的種類與危害獸藥是指用于預(yù)防和治療畜禽疾病的藥物。但是，隨著集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)的開展，一些化學(xué)的、生物的藥用成分被開發(fā)成具有某些功效的動物保健品或飼料添加劑，也屬于獸藥的范疇。獸藥的主要用途有防病治病、促進(jìn)生長、提高生產(chǎn)性能、改善動物性食品的品質(zhì)等。獸藥殘留是指動物性產(chǎn)品的任何可食部分含有獸藥母化合物或其代謝物。獸藥最高殘留限量(MRLVD)是指某種獸藥在食物中或食物表面產(chǎn)生的最高允許獸藥殘留量(單位μg／kg，以鮮重計)。1．抗生素類藥物

這類藥物多為天然發(fā)酵產(chǎn)物，是臨床應(yīng)用最多的一類抗菌藥物，如青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、螺旋霉素、鏈霉素、土霉素、金霉素等。青霉素類最容易引發(fā)過敏反應(yīng)，四環(huán)素類、鏈霉素有時也能引起過敏反應(yīng)。輕至中度的過敏反應(yīng)一般表現(xiàn)為短時間內(nèi)出現(xiàn)血壓下降、皮疹、身體發(fā)熱、血管神經(jīng)性水腫、血清病樣反應(yīng)等，極度過敏反應(yīng)可能導(dǎo)致過敏性休克甚至死亡。長期攝入含氨基糖苷類殘留超標(biāo)的動物性食品，可損害聽力及腎臟功能。常見獸藥殘留的種類2．磺胺類藥物

主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺瞇、菌得清、新諾明等。近年來，磺胺類藥物在動物性食品中的殘留超標(biāo)現(xiàn)象，在所有獸藥當(dāng)中是最嚴(yán)重的。長期攝入含磺胺類藥物殘留的動物性食品后，藥物可不斷在體內(nèi)蓄積。磺胺類藥主要經(jīng)腎臟排出，在尿中濃度較高，其溶解度又較低，尤其當(dāng)尿液偏酸性時，可在腎盂、輸尿管或膀胱內(nèi)析出結(jié)晶，產(chǎn)生刺激和阻塞，造成泌尿系統(tǒng)損傷，引起結(jié)晶尿、血尿、管型尿等。

3．硝基呋喃類藥物

主要用于抗菌消炎，如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。通過食品攝入超量硝基呋喃類殘留后，對人體造成的危害主要是胃腸反應(yīng)和過敏反應(yīng)。劑量過大或腎功能不全者，可引起嚴(yán)重毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為周圍神經(jīng)炎、嗜酸性白細(xì)胞增多、溶血性貧血等。長期攝人可引起不可逆性末端神經(jīng)損害，如感覺異常、疼痛及肌肉萎縮等，我國尚未制定硝基呋喃類藥物殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)。

4．抗寄生蟲類藥物這類藥物主要用于驅(qū)蟲或殺蟲，如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑類抗寄生蟲藥物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。食用殘留有苯并咪唑類藥物的動物性食品，對人主要的潛在危害是致畸作用和致突變作用。對于妊娠期的孕婦有可能發(fā)生胎兒畸形，如短肢、兔唇等；對所有消費者來說，可能由于其致突變作用使消費者發(fā)生癌變和性染色體畸變，從而其后代有發(fā)生畸形的危險。5．激素類藥物這類藥物主要用于提高動物的繁殖和加快生長發(fā)育速度，使用于動物的激素有性激素和皮質(zhì)激素，而以性激素最常用，如孕酮、睪酮、雌二醇等。正常情況下，動物性食品中天然存在的性激素含量是很低的，因而不會干擾消費者的激素代謝和生理機能。但攝人性激素殘留超標(biāo)的動物性食品，可能會影響消費者的正常生理機能，并具有一定的致癌性，可能導(dǎo)致兒童早熟、兒童發(fā)育異常、兒童異性趨向等。

第四節(jié)食品中其他有毒有害物質(zhì)的檢驗

人類至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的食物種類是很豐富的，這是人類在不斷地探索自然的過程中積累的成果，其中絕大多數(shù)是不含任何天然有害物質(zhì)的，但也有少數(shù)含有天然有害物質(zhì)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)一些原來被認(rèn)為是安全的食物事實上也含有某種或某些天然有害的物質(zhì)。

一、常見的動物性天然毒素1．動物肝臟中的毒素

動物肝臟中主要的毒素是膽酸、?；悄懰岷兔撗跄懰?。它們是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制劑，其中?；悄懰岬亩拘宰顝姡撗跄懰岽沃?。許多試驗研究還發(fā)現(xiàn)，脫氧膽酸對結(jié)腸癌、直腸癌的發(fā)生有促進(jìn)作用。豬肝臟中的膽酸含量較少，一般不會產(chǎn)生明顯的毒性作用，但食用過多或食用時處理不當(dāng)也會對人體健康產(chǎn)生一定的危害。

2．河豚毒素

河豚魚是一種味道鮮美又含劇毒的魚類。全球有200種左右，我國有70多種，廣泛分布于各海區(qū)。河豚魚的肝、脾、胃、生殖系統(tǒng)、皮膚以及血液均含有毒素，其中以卵和卵巢的毒性最大，肝臟次之。一般品種的河豚魚肌肉的毒性較低，但雙斑圓鯨純、蟲紋圓純、鉛點圓純肌肉的毒性較強。毒素含量的大小隨著生長水域、品種及季節(jié)的不同而不同。

河豚魚中毒是世界上最嚴(yán)重的動物性食物中毒。

中毒癥狀

河豚毒素中毒后癥狀出現(xiàn)的快慢、嚴(yán)重程度與個體差異和毒素攝人量有關(guān)。一般攝人毒素30min出現(xiàn)典型中毒癥狀，通常癥狀輕者呈現(xiàn)自限性，但大多數(shù)中毒嚴(yán)重者常在17min后迅速發(fā)生呼吸麻痹和循環(huán)衰竭而致死。有報道中毒癥狀最快可出現(xiàn)在進(jìn)食后的5～10min。救護(hù)措施目前對河豚中毒的最好療法是催吐、洗胃和導(dǎo)瀉，并及時進(jìn)行人工輔助呼吸。具體措施如下：1排毒?？诜％硫酸銅溶液100ml予以催吐；后用l：5000高錳酸鉀溶液或0．5％活性炭懸液洗胃；也可用高位清潔灌腸；最后口服硫酸鎂導(dǎo)瀉。2解毒。尚無特效解毒劑，但可用相應(yīng)藥物以拮抗毒素對人體的毒性作用，如應(yīng)用阿托品可拮抗毒素對心臟的毒性作用；肌注l％硝酸士的寧，可拮抗毒素對運動麻痹的作用等。3輸液。輸液可以促進(jìn)毒素盡快排出及維持水和電解質(zhì)的平衡。4中草藥治療。鮮蘆根和鮮橄欖各100g洗凈搗汁內(nèi)服，早期可有解毒作用。5對癥治療。呼吸困難者可給予氧氣吸人；血壓下降者應(yīng)用強心劑或升壓藥等。檢測方法1定性試驗1）樣品用溫水浸漬10min→攪拌→靜止后過濾→濾液加適量乙酸鉛→濾棄沉淀→向濾液中通入H2

過濾→滴加磷鎢酸試液使膽堿等沉淀→濾液置真空干燥器干燥→多次用無水乙醇浸制→黃色殘渣即可初制河豚毒素。2）將殘渣溶于硫酸中，加重鉻酸鉀少許，如果系河豚毒素，則呈綠色。3）殘渣溶于水，加熱煮沸2min消毒，冷后注入青蛙體內(nèi)，數(shù)分鐘后青蛙呈麻痹狀，則為河豚毒素。2含量測定1）取處理好樣品5.Og置于200ml圓底燒瓶→50ml甲醇，醋酸(109／6)→Ph4～5→回流10～20min→離心沉淀→收集上清液→蒸去甲醇→水浴蒸至糖漿狀→乙醚除去脂肪→加水至lOml。2)將檢液以水稀釋成各種濃度。3)健康小白鼠分組腹腔注射0.5ml。4)選擇小白鼠死亡時間和中毒癥狀來判斷毒物濃度

3．巖蛤毒素蛤的種類很多，只有少數(shù)幾種如文蛤、石房蛤等含有有毒物質(zhì)。目前認(rèn)為，這些有毒物質(zhì)源于一些屬于膝勾藻科的藻類，如渦鞭毛藻，當(dāng)此種藻類大量繁殖時，可形成“赤潮”。海洋軟體動物包括蛤類，攝食了這類海藻后，海藻所含的巖蛤毒素及膝勾藻毒素在中腸腺以無毒的結(jié)合態(tài)大量蓄積，當(dāng)人體攝食此類蛤肉后，毒素被釋放出來，引起中毒。

4．螺類毒素

螺的種類很多，絕大多數(shù)食用安全性較高，但少數(shù)種類如接縫香螺、問肋香螺、油螺、節(jié)棘骨螺及蠣敵荔枝螺等含有四甲胺、骨螺毒素、千里酰膽堿、丙烯酰膽堿等有毒物質(zhì)。

5．組胺

組胺屬于生物堿，溶于水及乙醇。組胺中毒，國內(nèi)外均有報道，大多是由于食用不新鮮或腐敗變質(zhì)的魚類引起的。一般認(rèn)為，成人攝入100mg的組胺就有可能引起中毒。組胺是由魚體內(nèi)的游離組氨酸在魚的存放過程中經(jīng)脫羧而形成的，溫度升高時則組胺形成的更多。魚體中的組胺被水或極性有機溶劑提取后，在弱堿條件下，能與偶氮試劑反應(yīng)生成橙色物質(zhì)，利用這一點，可以對組胺進(jìn)行定性或定量檢測。二、常見的植物性天然毒素

1．氰苷

氰苷進(jìn)人體內(nèi)水解后產(chǎn)生HCN，從而具有較強的毒性。含有氰苷的食源性植物有木薯、豆類以及一些果樹的種子如杏仁、桃仁、枇杷仁及亞麻仁等。氰化物在酸性條件下可產(chǎn)生HCN氣體，HCN可使苦味酸試紙顯紅色，據(jù)此可對含有氰苷的物質(zhì)進(jìn)行定性檢測。2．紅細(xì)胞凝集素

這是一類對紅細(xì)胞具有凝集作用的蛋白質(zhì)，多為糖蛋白。含有紅細(xì)胞凝集素的食源性植物有蓖麻、豆類的種子。不同植物的紅細(xì)胞凝集素其毒性是不同的，以蓖麻凝集素的毒性最強，紅細(xì)胞凝集素比較耐熱，80℃數(shù)小時不能使之失活，100℃需經(jīng)過1h可完全破壞其活性。3．皂苷

也稱皂素，很多豆科植物如黃豆、菜豆、蠶豆等不僅含有紅細(xì)胞凝集素、氰苷，還含有有毒的皂苷。其中菜豆中毒是天然食物中毒中較常見的。菜豆中的毒皂苷對消化道粘膜有強烈的刺激作用。

4．龍葵堿

龍葵堿又名茄堿、馬鈴薯毒素、龍葵毒素，不溶于水，能溶于乙醇，與稀酸共熱可發(fā)生分解。龍葵堿廣泛存在于馬鈴薯、番茄及茄子等中。馬鈴薯中龍葵堿的含量一般在0.1305％．0.01％，且隨著貯存時間的增加而漸增，發(fā)芽的馬鈴薯其幼芽及芽眼部分的含量可高達(dá)0.3％～0.5％。人攝人0.2～0.4g龍葵堿即可引起中毒。

5．秋水仙堿

秋水仙堿是鮮黃花菜(也稱金針菜)中的一種生物堿，其本身無毒，但當(dāng)它進(jìn)人人體后會轉(zhuǎn)化成一種劇毒物質(zhì)：二秋水仙堿，后者對胃腸道、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等具有毒性。成人一次攝人0.1～0.2mg秋水仙堿可引起中毒，攝入3～20mg可致死。食用鮮黃花菜時一定要用開水焯，浸泡后，再經(jīng)充分烹飪，以防中毒。食用干黃花菜較安全。6．棉酚

棉酚系萘的衍生物，在結(jié)構(gòu)上有醛、烯醇及醌式三種同分異構(gòu)體。溶于中等極性的有機溶劑，不溶于水及己烷等。棉酚對心、肝、腎及神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)均有毒性。棉酚在棉籽中的含量為0.15％～0.28％，冷榨棉籽油中可高達(dá)l％～1.3％，因此不可食用冷榨棉籽油或毛棉籽油。7．毒蘑菇

毒蘑菇所含有的有毒成分可分為生物堿類、肽類及其他化合物，根據(jù)中毒的癥狀可分為胃腸毒素、神經(jīng)精神毒素、血液毒素、原漿毒素和其他毒素五類。磨菇毒素的檢驗常用紙層析法或薄層層析法。四食品加工過程中形成的

有害物質(zhì)及其檢測

一、食品加工過程中形成的有害物質(zhì)

煙熏、油炸、焙烤、腌制等加工技術(shù)，在改善食品的外觀和質(zhì)地、增加風(fēng)味、延長保存期、鈍化有毒物質(zhì)(如酶抑制劑、紅細(xì)胞凝集素)以及提高食品的可利用度等方面發(fā)揮了很大作用，但隨之還產(chǎn)生了一些有害物質(zhì)，相應(yīng)的食品存在著嚴(yán)重的安全性問題，對人體健康可產(chǎn)生很大的危害。

1．N一亞硝基化合物

N-亞硝基化合物(NOC)是一大類有機化合物，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，可分為兩類：一類為亞硝胺，另一類為N-亞硝酸胺。含有N-亞硝基化合物較多的食品有干魷魚、熏肉、熏魚、咸魚、咸肉、油煎火腿、干香腸、腌制蔬菜、另外，在啤酒及干奶酪、乳粉、奶酒等乳制品中也含有微量的N-亞硝基化合物。

2．苯并[a]芘

苯并[a]芘又稱3，4-苯并芘，是一種由五個苯環(huán)構(gòu)成的多環(huán)芳烴。常溫為淺黃色針狀結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，能與硝酸、過氯酸、氯磺酸起化學(xué)反應(yīng)，人們可利用這一性質(zhì)來消除苯并[a]芘。苯并[a]芘是已發(fā)現(xiàn)的200多種多環(huán)芳烴中最主要的環(huán)境和食品污染物，是一種強烈的致癌物質(zhì)，對機體各器官，如對皮膚、肺、肝、食道、胃腸等均有致癌作用。

加工過程中苯并[a]芘對食品的污染主要是針對熏制、烘烤和煎炸等食品而言的，該類食品中的苯并[a]芘一方面來源于煤、煤氣等不完全燃燒，另一方面來源于食品中的脂肪、膽固醇等成分的高溫?zé)峤饣驘峋?。?jù)研究報道，在烤制過程中動物食品所滴下的油滴中苯并[a]芘含量是動物食品本身的10～70倍。當(dāng)食品經(jīng)煙熏或烘烤而發(fā)生烤焦或炭化時，苯并[a]芘生成量隨著溫度的上升而急劇增加。

二、該類有害物質(zhì)的檢測1．食品中Ⅳ一亞硝基化合物的測定

GB／T5009．26—1996規(guī)定了食品中Ⅳ一亞硝胺類的檢測方法。2．食品中苯并[a]芘的測定GB／T5009．27—1996該法先將樣品用有機溶劑提取或皂化后提取，再將提取液經(jīng)液一液分配或?qū)游鲋鶅艋?，然后?jīng)乙?；癁V紙層析分離后，在365nm或254nm的紫外光下圈出相應(yīng)藍(lán)紫色斑點，用溶劑溶出后，用熒光分光光度法比色測定。第十章食品中毒素及其檢測第一節(jié)霉菌毒素及其檢測

一、霉菌毒素的種類

霉菌是一些絲狀真菌的通稱，在自然界分布很廣，幾乎無處不有，主要生長在不通風(fēng)、陰暗、潮濕和溫度較高的環(huán)境中。霉菌可非常容易地生長在各種食品上并產(chǎn)生危害性很強的霉菌毒素。目前已知的霉菌毒素約有200余種，與食品關(guān)系較為密切的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉素等。已知有5種毒素可引起動物致癌，它們是黃曲霉毒素、黃天精、環(huán)氯素、雜色曲霉素和展青霉素。霉菌污染食品可使食品的食用價值降低，甚至使之完全不能食用，造成巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計全世界每年平均有2％的谷物由于霉變不能食用。霉菌毒素引起的中毒大多通過被霉菌污染的糧食、油料作物以及發(fā)酵食品等引起。霉菌毒素多數(shù)有較強的耐熱性，一般的烹調(diào)加熱方法不能使其破壞。當(dāng)人體攝入的霉菌毒素量達(dá)到一定程度后，可引起中毒。霉菌中毒往往表現(xiàn)為明顯的地方性和季節(jié)性，臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突變等。食品中常見的幾類霉菌毒素如下。

1．黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(Aflatoxins。簡寫AFT)是黃曲霉、寄生曲霉及溫特曲霉等產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，是一群結(jié)構(gòu)類似的化合物。目前已發(fā)現(xiàn)17種黃曲霉毒素。根據(jù)其在波長為365nm紫外光下呈現(xiàn)不同顏色的熒光而分為B、G二大類：

B大類在氧化鋁薄層板上于紫外光照射下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；G大類則呈綠色熒光。

AFT主要污染糧油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染嚴(yán)重，此外各種植物性與動物性食品也能被廣泛污染，如在胡桃、杏仁、高梁、小麥、豆類、王豆、皮蛋、奶與奶制品、干咸魚及辣椒中均有AFT污染。其污染程度與各種作物生物學(xué)特性和化學(xué)組成以及成熟期所處的氣候條件有很大關(guān)系。一般來說，富含脂肪的糧食易產(chǎn)生AFT。此外，收獲季節(jié)高溫、高濕，也易造成AFT的污染。

AFT為劇毒物質(zhì)，其毒性比氰化鉀還高，也是目前最強的化學(xué)致癌物質(zhì)。其中AFTBl的毒性和致癌性最強，故其在食品中允許量各國都有嚴(yán)格規(guī)定。

FAO／WHO規(guī)定食品中AFTBl＜15ppb，

美國≤20ppb，

日本≤10ppb，

以色列與瑞典規(guī)定不得檢出。

黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

(一)黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)

(二)黃曲霉毒素的理化性質(zhì)

1.溶解性：AFT的分子量為312-346，難溶于水、乙醚、石油醚及己烷中，易溶于油和甲醇、丙酮、氯仿、苯等有機溶劑中。

2．穩(wěn)定性：AFT是一組性質(zhì)比較穩(wěn)定的化合物；其對光、熱、酸較穩(wěn)定，而對堿和氧化劑則不穩(wěn)定。

樣品預(yù)處理

樣品預(yù)處理包括AFT的提取、凈化及濃縮等過程。（三）薄層層析法測定黃曲霉毒素B1

薄層層析是在黃曲霉毒素研究方面應(yīng)用最廣的分離技術(shù)。自1990年，它被列為AOAC(associationofofficialagriculturalchemists)標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法同時具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能。

3.1原理

本法是利用樣品中的黃曲霉毒素B1，經(jīng)有機溶劑提取、凈化、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定黃曲霉毒素B1的含量。薄層色譜法黃曲霉毒素Bt的最低檢出量為0．0004ug，最低檢出濃度為5ug／Kg。。3.2儀器和試劑

(1)儀器小型粉碎機、樣篩、電動振蕩器、玻璃濃縮器、玻璃板5cm×20cm、薄層板涂布器、展開槽(25cm×6cm×4cm)、紫外光燈100-125w、波長365nm濾光片、微量注射器(2)試劑①三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、無水乙醚或乙醚經(jīng)無水硫酸鈉脫水、丙酮。以上試劑在試驗前需先進(jìn)行空白試驗，如不干擾測定即可使用，否則需逐一進(jìn)行重蒸。②硅膠G(薄層色譜用)、三氟乙酸、無水硫酸鈉、氯化鈉、苯-乙腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。

③黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取1～1．2mgAFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此標(biāo)準(zhǔn)液濃度約為10ug／mL。先用紫外分光光度計測定其濃度，再用苯-乙腈混合液調(diào)整其濃度為準(zhǔn)確10．0ug／mL。在350nm，AFTB在苯-乙腈(98+2)混合液中的摩爾消光系數(shù)為19800.④黃曲霉毒素B：標(biāo)準(zhǔn)使用液：

I液(1.0ug／mL)：取1mLAFTB標(biāo)準(zhǔn)液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀釋、定容。

Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。

Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。。⑤次氯酸鈉溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，攪拌均勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉(Na2CO3·H2O)溶于500mL溫水中。將兩液合并、攪拌、澄清、過濾。此液含次氯酸25g／L。污染的玻璃器皿用次氯酸鈉溶液浸泡可達(dá)到去毒的效果。

3.3操作步驟

(1)樣品處理樣品從大樣經(jīng)粗碎及連續(xù)多次用四分法縮減至0．5～lkg后全部粉碎。糧食樣品全部通過20目篩，花生樣品全部通過10目篩、混勻。

(2)提取稱取20.00g經(jīng)粉碎樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液，瓶塞上涂一層水、蓋嚴(yán)防漏。振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶內(nèi)。取20.00mL甲醇水溶液(相當(dāng)于4.0g樣品)置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振搖2min、靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使分層。放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水硫酸鈉的定量慢速濾紙，過濾于50mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放在通風(fēng)柜，于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后于冰盒上冷卻2～3min后，準(zhǔn)確加入1mL苯一乙腈混合液。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘渣充分混合，若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL的具塞試管中。(3)測定①單向展開法

a．薄板制備：稱取3g硅膠G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊狀后，倒人涂布器推成5cm×20cm，厚度約0.25mm的薄層板3塊。在空氣中干燥15min，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置時間較長，可再活化后使用。

b．點樣：將薄板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血紅素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個點，點距邊緣和點間距為lcm，點直徑約3mm，在同一板上滴加點的大小應(yīng)一致，滴加時可用吹風(fēng)機用冷風(fēng)邊吸邊加。滴加樣式如下：第一點：10μLAFTB，標(biāo)準(zhǔn)使用液(0．04μg／mL)。第二點：20μL樣液。第三點：20μL樣液+10μL0.04μg／mL

AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點：20μL樣液+10μL0.02tLg，／mLAFTB。標(biāo)準(zhǔn)使用液。②展開與觀察在展開槽內(nèi)加10mL無水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展開10～12cm，取出，在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下：

a．由于樣液上加滴了AFTB1標(biāo)準(zhǔn)，可使AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點與樣液中AFTB1熒光點重疊。若樣液為陰性，薄板上第三點AFTB1為0．0004μg，可用作檢查樣液中AFTB1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；若樣液為陽性；則起定性作用。薄層板上第四點AFTB1標(biāo)準(zhǔn)為0．002ug．主要起定位作用。

b．若第二點與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點的相應(yīng)位置上無藍(lán)色熒光點，則表示樣品中AFTBl含量<5ug／kg；若在相應(yīng)位置上有藍(lán)色熒光點，則須進(jìn)行確證試驗。③確證試驗為確認(rèn)薄層樣上樣液熒光系由黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生AFTB1的衍生物，展開后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個點。第一點：10uL0．04ug／mL

AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。第二點：20／μL樣液于以上兩點各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機吹熱風(fēng)2min(板上溫度不高于40℃)，再于薄層板上滴加以下兩點。第三點：10uL0.04ug／mL

AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點：20μL樣液。

按上法展開并觀察，樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四兩點，可依次作為標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對照。④稀釋定量：樣液中的AFTB1熒光點的熒光強度，如與AFTB1。標(biāo)準(zhǔn)點最低檢出量(0.0004μg)的熒光強度一致，則樣品中AFTB1含量為即為5~g／kg．若樣液中熒光強度比最低檢出量強，則根據(jù)其強度估計，減少滴加微升數(shù)，或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液的熒光強度與最低檢出量的熒光強度一致為止。滴加式樣如下：第一點：l0uLAFTB1，標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.04ug／mL)。第二點：根據(jù)情況滴加10uL樣液。第三點：根據(jù)情況滴加15uL樣液。第四點：根據(jù)情況滴加20uL樣液。4)結(jié)果計算

X=式中：X一樣品中AFTBl的含量，ug／kg；

V1一加入苯一乙腈混合液的體積，mL；

V2—出現(xiàn)最低熒光時滴加樣液的體積，mL；

D一樣液的總稀釋倍數(shù)；

m1—加入苯一乙腈混合液溶解時相當(dāng)樣品的質(zhì)量，g；0.0004—AFTBl的最低檢出限量，ug。3.2．雙向展開法

3.2.1原理如用單向展開法后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了AFTB1的熒光強度，需采用雙向展開法。薄層板先用無水乙醚做橫向展開，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點的一邊，而AFTB1不動，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)做縱向展開，樣品在相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法的靈敏度。

3.2.2操作步驟

(1)點樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上，在距左邊緣0．8～1cm第二篇食品理化檢測技術(shù)處，各滴加10uLAFTB1(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液，在距左邊緣2.8～3cm處，各滴加20uL樣液。然后在第二塊板的樣液點上滴加l0uLAFTBl(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液，在第三塊板的樣液點上滴加10uLAFTB1(0.02ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液。(2)展開：

a．橫向展開：在展開槽內(nèi)的長邊置一玻璃支架，加10mL無水乙醇，將上述點好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點的長邊，置于展開槽內(nèi)展開，展至板端后，取出揮干。根據(jù)情況，需要時，可再重復(fù)l～2次。

b．縱向展開：揮干的薄層板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展開至10～12cm為止。丙酮與氯甲烷的比例，根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。

(3)觀察與評定結(jié)果：

a．在紫外光下觀察第一、二塊板，若第二塊板在AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而在第一板與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光，則樣品中AFTBl含量<5ug／kg.

b．若第一塊板與第二塊板的相同位置上出現(xiàn)熒光點，則將第一塊板與第三塊板比較，這第三塊板上第二點與第一塊板上第二點的相同位置上的熒光點是否與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗。在具體測定中，三塊板可以同時做，也可按順序做。當(dāng)?shù)谝粔K板出現(xiàn)陰性時，第三塊板可以省略，如第一塊板為陽性，則第二塊板可省略，直接做第三塊。

(4)確認(rèn)試驗：另取薄層板二塊，于第四、五兩板距左邊緣0.8～1cm處，各滴加10uLATTB1(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液及一小滴三氟乙酸；在距左邊緣2.8～3cm處，于第四板滴加20uL樣液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20gL樣液、10uL。AFTBl(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液及一小滴三氟乙酸，反應(yīng)5min后，用熱風(fēng)吹2min(板上溫度不高于40℃)。再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點重疊的衍生物。觀察時，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。若樣液AFTB1含量較高時，則將樣液稀釋后，按單向展開法中(4)做確認(rèn)試驗

.

(5)稀釋定量：若樣液中AFTBl含量較高，可按單向展開法中(5)稀釋定量操作。若AFTB1含量較低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果判斷，可將樣液再做雙向展開法測定，以確定含量。

3.2.3結(jié)果計算同單向展開法。

3.2.4說明及注意事項用過后受污染的玻璃器皿，應(yīng)經(jīng)次氯酸溶液(25g／L)，浸泡消毒后再清洗之。

(四）酶聯(lián)免疫法測定原理：固相酶聯(lián)免疫吸附。B1特異性抗體包被于聚苯乙烯微量反應(yīng)板的孔穴中，再加入樣品提取液（未知抗原）及B1抗原（已知抗原），使兩者與抗體進(jìn)行免疫競爭反應(yīng)，然后加酶底物顯色，顏色的深淺取決于抗體和酶