細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合

概念促融合劑與融合技術(shù)應(yīng)用與意義

重點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第1頁一定義：Cellfusion細(xì)胞融合：(Cellfusion)又稱體細(xì)胞雜交（somatichybridization）是指將不一樣起源原生質(zhì)體(除去細(xì)胞壁細(xì)胞)相融合，將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞技術(shù)。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第2頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第3頁人心肌細(xì)胞人肝臟細(xì)胞種內(nèi)雜交細(xì)胞人細(xì)胞鼠細(xì)胞種間雜交細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第4頁在適當(dāng)條件下，細(xì)胞融合在一起，產(chǎn)生含有原來兩個(gè)細(xì)胞基因信息單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。種內(nèi)雜交細(xì)胞（intraspecifichybridcell）:同種細(xì)胞融合而成細(xì)胞種間雜交細(xì)胞（interspecifichybridcell）:不一樣種細(xì)胞融合而成細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第5頁非對(duì)稱細(xì)胞融合（asymmetricfusion）：利用物理或化學(xué)方法使某親本細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第6頁細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活有物理和化學(xué)方法：1.物理方法，如X射線、r射線等，它們能使細(xì)胞核失活；2.化學(xué)方法，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，它是一個(gè)親脂染料，能夠抑制線粒體氧化磷酸化過程而到達(dá)失活作用。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第7頁動(dòng)物克隆細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第8頁上海第二醫(yī)科大學(xué)陳瑩博士年，她將一5歲男孩包皮細(xì)胞與一只已去除細(xì)胞核新西蘭兔卵母細(xì)胞融合，取得了人類早期胚胎。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第9頁二細(xì)胞融合原理細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第10頁熒光標(biāo)識(shí)小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞融合試驗(yàn)將小鼠抗體與發(fā)綠色熒光熒光素(fluorescin)結(jié)合,人抗體與發(fā)紅色熒光羅丹明(rhodamine)結(jié)合；細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第11頁顯微鏡下細(xì)胞融合過程

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第12頁細(xì)胞融合過程細(xì)胞相互靠近細(xì)胞膜融合細(xì)胞橋形成細(xì)胞質(zhì)融合細(xì)胞核融合細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第13頁細(xì)胞融合主要經(jīng)過了兩原生質(zhì)體或細(xì)胞相互靠近、細(xì)胞橋形成、胞質(zhì)滲透、細(xì)胞核融合主要步驟。

細(xì)胞橋形成是細(xì)胞融合最關(guān)鍵一步，融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第14頁

細(xì)胞融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜改變

形成細(xì)胞橋詳細(xì)改變細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第15頁細(xì)胞融合分為兩種：1.自發(fā)細(xì)胞融合2.人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第16頁（1）自發(fā)細(xì)胞融合

自發(fā)細(xì)胞融合（spontaneouscellfusion）是在未施加任何誘導(dǎo)條件情況下所發(fā)生細(xì)胞融合現(xiàn)象。

自發(fā)細(xì)胞融合現(xiàn)象在自然界中并不多見，常見主要有以下幾個(gè)情況：

1.精子和卵子受精

2.肌管形成

3.胚胎著床

4.巨細(xì)胞形成

5.

破骨細(xì)胞形成

6.

腫瘤細(xì)胞融合細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第17頁（2）誘導(dǎo)細(xì)胞融合人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合是在人為條件下發(fā)生細(xì)胞融合現(xiàn)象慣用誘導(dǎo)方法有三種：

1.生物法（病毒誘導(dǎo)法等）

2.化學(xué)法（PEG誘導(dǎo)法、Ca2+誘導(dǎo)法、溶血卵磷脂誘導(dǎo)法等）

3.物理法（電誘導(dǎo)法等）細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第18頁1.病毒誘導(dǎo)法

慣用病毒：仙臺(tái)病毒（Sendalvirus),又稱日本血凝病毒（HemagglutinatingvirusofJapan,HVJ）屬于副粘液病毒科，RNA病毒，圓球形

1962年，日本仙臺(tái)東北大學(xué)學(xué)者岡田發(fā)覺仙臺(tái)病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞融合。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第19頁病毒促使細(xì)胞融合

兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近，使兩個(gè)細(xì)胞膜、胞質(zhì)間相互滲透--------細(xì)胞核相互融合，進(jìn)入正常細(xì)胞分裂路徑，雜種子細(xì)胞。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第20頁2化學(xué)法（聚乙二醇）PEG:聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH性狀：白色蠟狀固體，含有強(qiáng)烈凝集、沉淀蛋白質(zhì)作用分子量〉1000-6000u，可作誘融劑。20世紀(jì)70年代，華裔科學(xué)家高國南發(fā)覺聚乙二醇能誘導(dǎo)細(xì)胞融合細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第21頁分子量小PEG，融合效應(yīng)差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。pH偏堿時(shí)融合效應(yīng)最高。用作細(xì)胞融合劑聚乙二醇普通選取分子量為4000者，慣用濃度為50％，pH8.0~pH8.2

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第22頁聚乙二醇普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜脂類分子發(fā)生疏散和重組，因?yàn)閮杉?xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜相互親和以及彼此表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第23頁

基本原理聚乙二醇(PEG)是一個(gè)多聚化合物，商品名卡波蠟(Carbowax)。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第24頁聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)細(xì)胞融合

原理：PEG帶有大量負(fù)電荷,和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷在鈣離子連接下，形成靜電鍵，促使異源原生質(zhì)體間粘著和結(jié)合，在高pH,高鈣離子溶液作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合PEG分子洗脫，造成電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上正負(fù)電荷連接起來，進(jìn)而形成含有共同質(zhì)膜融合體。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第25頁融合過程中應(yīng)注意①事先要做好兩種原生質(zhì)體識(shí)別標(biāo)識(shí)，如色素、缺點(diǎn)型、抗性標(biāo)識(shí)等。②原生質(zhì)體密度應(yīng)在105個(gè)／mL左右，兩種原生質(zhì)體按1：1等量混合。③慣用PEG分子量通常為4000~6000，加熱熔化與Eagle溶液配成50％(W／V)濃度(小分子質(zhì)量PEG配成55％濃度)。加入PEG后，24℃培育10~20min注意時(shí)間宜短不宜長，過長，使原生質(zhì)體周圍包裹一層膜形成凝集體，會(huì)降低融合率)，緩緩加入高pH、高鈣離子溶液15min后用沖洗液清洗，離心搜集原生質(zhì)體。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第26頁3.物理法一電融合誘導(dǎo)法1981年，Scheurich和Zimmermann創(chuàng)造了電誘導(dǎo)細(xì)胞融合。電融合槽在直流電脈沖誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整膜形成融合體。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第27頁細(xì)胞電融合原理：懸于大小不一樣兩平行電極間低導(dǎo)電率溶液中細(xì)胞，在1—100MHz和100—1000V/cm交流電場(chǎng)中，會(huì)向小電極移動(dòng)，并極化成偶極子，而沿電場(chǎng)方向發(fā)生雙向電泳，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和連續(xù)時(shí)間高壓電脈沖，即可使相鄰細(xì)胞膜接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)細(xì)胞融合。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第28頁+--+-+-+---+偶極子電誘導(dǎo)法原理+---+細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第29頁雙向電泳：在交流電場(chǎng)作用下（1MHz，150V/cm）細(xì)胞膜上正負(fù)電荷分離，產(chǎn)生偶極，兩個(gè)極化細(xì)胞會(huì)發(fā)生相互緊密接觸。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第30頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第31頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第32頁原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場(chǎng)下相互接觸。2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第33頁注意事項(xiàng)1）對(duì)介質(zhì)要求高，普通用高純度蒸餾水并選取適當(dāng)非電介質(zhì)溶液，如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓強(qiáng)度和時(shí)間，以預(yù)防細(xì)胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第34頁優(yōu)點(diǎn)：融合率高，達(dá)70％－80％，甚至100％可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可直接挑選雜種細(xì)胞重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)原生質(zhì)體傷害??；裝置精巧、方便簡單；免去PEG誘導(dǎo)后洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強(qiáng)等。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第35頁融合指數(shù)（fusionindex）:反應(yīng)細(xì)胞融合效率有兩種計(jì)算方法：1.FI=（對(duì)照組細(xì)胞數(shù)-試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)）/試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)2.FI=多核細(xì)胞中細(xì)胞核數(shù)/全部細(xì)胞中細(xì)胞核數(shù)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第36頁不一樣細(xì)胞融合條件及其主要應(yīng)用起源前處理融合方法主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞不需仙臺(tái)病毒,PEG，電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細(xì)胞脫壁PEG,電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細(xì)胞脫壁PEG,高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第37頁AABBAABBBAAB同核體同核體異核體（雜交細(xì)胞）未融合未融合加入融合劑融合細(xì)胞類型

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第38頁同核體：由同一親本細(xì)胞融合而來異核體：

（heterokaryon）有不一樣親本細(xì)胞融合而來異核體其細(xì)胞膜融合在一起，而融合細(xì)胞含有兩個(gè)不一樣細(xì)胞核。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第39頁動(dòng)物細(xì)胞融合影響原因

動(dòng)物細(xì)胞融合中，除促融劑外，其它如細(xì)胞性質(zhì)、溫度、pH、離子強(qiáng)度及離子種類等均全影響細(xì)胞融合效率。

①親本細(xì)胞表面性質(zhì)影響較大②細(xì)胞種類不一樣，融合效果也不一樣，如腹水癌及株化細(xì)胞較易融合，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不融合。③細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。

如仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)-腹水癌細(xì)胞融合時(shí)，于37℃振搖時(shí)易于融合，且融合效率與病毒量呈正比。但在34℃振搖則融合率下降。在37℃時(shí)不振搖則-不融合。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第40頁④細(xì)胞融合過程中，通常耗氧量較大，缺氧時(shí)經(jīng)常不融合?？諝庵泻趿看笥?0％時(shí)有一定融合率，但有些細(xì)胞在無氧條件也可融合。⑤有些細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2+，不然不融合，細(xì)胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生改變。

試驗(yàn)表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等離子可代替Ca2+，但有效濃度較Ca2+大多。融合時(shí)最適合離子強(qiáng)度普通為0.1mol/L。⑥最適合pH為7.4-7.8之間，在此范圍之外，融合率均較低。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第41頁比較慣用雜種細(xì)胞篩選方法1遺傳互補(bǔ)篩選法：2營養(yǎng)互補(bǔ)篩選：3溫度敏感篩選法細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第42頁1）遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功效正常等位基因，糾正另一親本缺點(diǎn)，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。親本A：HGPRT-/TK+親本B：HGPRT+/TK-雜交細(xì)胞：HGPRT+/TK+在HAT培養(yǎng)基中雜交細(xì)胞存活，A、B死亡細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第43頁2）營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：細(xì)胞在缺乏一種或幾個(gè)營養(yǎng)成份時(shí)，不能生長繁殖即營養(yǎng)缺點(diǎn)型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理能夠篩選雜種細(xì)胞。親本A：色氨酸缺點(diǎn)型親本B：蘇氨酸缺點(diǎn)型雜種細(xì)胞能夠在不含色氨酸和蘇氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第44頁3）溫度敏感突變型雜種細(xì)胞篩選：普通培養(yǎng)細(xì)胞能在32度到40度范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型細(xì)胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細(xì)胞。親本一：低溫敏感突變型，可在低溫下生長，在高溫下死亡。親本二：高溫敏感突變型，可在高溫下生長，在低溫下死亡。雜種細(xì)胞能在高溫和低溫下生長。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第45頁細(xì)胞融合應(yīng)用1.用于基因定位2.用于生產(chǎn)樹突狀細(xì)胞抗腫瘤疫苗2.用于動(dòng)物育種3.用于細(xì)胞治療4.用于生產(chǎn)單克隆抗體5.用于研究核質(zhì)關(guān)系和腫瘤發(fā)生機(jī)制細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第46頁細(xì)胞融合應(yīng)用一.單克隆抗體

1975年英國科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而取得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第47頁TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"GeorgesJ.F.Koehler

FederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerlandb.1946d.1995

CarMilstein

ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)

d.科萊爾米爾斯坦細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第48頁單克隆抗體概念單:單個(gè)細(xì)胞克隆:無性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第49頁親本細(xì)胞準(zhǔn)備

細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞篩選可分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)單克隆抗體生產(chǎn)和純化生產(chǎn)過程細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第50頁單克隆抗體大量制備過程一細(xì)胞融合前準(zhǔn)備(一)動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液制備在腹腔免疫1－2次后2－4周，于融合前3—4天加強(qiáng)免疫一次，這么能夠使抗原最近激活B淋巴細(xì)胞定位于脾臟，也使記憶細(xì)胞處于激活與分裂狀態(tài)。許多資料結(jié)果表明，脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤最正確時(shí)間，是在抗體形成高峰之前，而不是在抗體形成高峰期?？扇苄钥乖庖吡砍?0-100ug，經(jīng)皮下或腹腔注射免疫1-2次（間隔2-3周），3周后50-500ug抗原加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫一定要靜脈注射或腹腔內(nèi)注射，確保抗原抵達(dá)脾臟。細(xì)胞抗原慣用2×107用細(xì)胞腹腔注射，不需佐劑。

普通取最終一次加強(qiáng)免疫3天以后脾臟，制備成細(xì)胞懸液。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第51頁淋巴細(xì)胞：經(jīng)過免疫處理淋巴細(xì)胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：對(duì)細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動(dòng)物體內(nèi)。3－4天后，在無菌條件下能夠取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95％以上能夠用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細(xì)胞，調(diào)整為107個(gè)/ml，加適當(dāng)濃度抗原，3－4天后，搜集被刺激淋巴細(xì)胞。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第52頁小牛血清選擇①供血新生小牛必須是健康牛產(chǎn)仔，并在產(chǎn)后24小時(shí)內(nèi)抽血，此期間不得吸收母乳。②以無菌操作自頸動(dòng)脈放血，并在無菌條件下分離血清及濾菌，全過程在36小時(shí)內(nèi)完成。經(jīng)濾菌血清置－20℃保留。③血清使用前需做細(xì)菌、支原體培養(yǎng)及內(nèi)毒素測(cè)定，在確實(shí)無污染情況下方可使用。④每批小牛血清測(cè)定總蛋白含量并分別配成10％、20％、25％于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和HAT培養(yǎng)基中，對(duì)骨髓瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察小牛血清對(duì)瘤細(xì)胞和融合細(xì)胞細(xì)胞毒性。⑤輕微溶血血清，而無細(xì)胞毒性者仍可應(yīng)用。⑥在用血清做細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行，培養(yǎng)期間隨時(shí)可放于倒置顯微鏡下觀察，可防止因?yàn)槿庋塾^察疏忽。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第53頁B淋巴細(xì)胞準(zhǔn)備紅細(xì)胞將紅細(xì)胞注入小鼠皮下或腹腔取出脾臟B淋巴細(xì)胞

親本細(xì)胞準(zhǔn)備細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第54頁(二)骨髓瘤細(xì)胞取得與培養(yǎng)

骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這么雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一晶系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAB。骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)可利用普通動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液。小牛血清濃度普通在10％—20％，細(xì)胞最大密度不得超106個(gè)／ml，普通擴(kuò)大培養(yǎng)以1：10稀釋傳代，每3-5天傳代一次。細(xì)胞倍增時(shí)間為16-20h。親本細(xì)胞準(zhǔn)備細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第55頁骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備

骨髓瘤細(xì)胞：是癌變漿細(xì)胞，能夠分泌免疫球蛋白，所以必須選擇不分泌免疫球蛋白缺點(diǎn)型骨髓瘤細(xì)胞，多用BALB/C小鼠骨髓瘤細(xì)胞。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第56頁

細(xì)胞融合加入PEG作融合劑B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞1234細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第57頁二細(xì)胞融合融合條件除了融合劑以外，還包含溫度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)板等。我們首先分析用PEG作融合劑時(shí)條件選擇。因?yàn)樽饔脮r(shí)間不一樣對(duì)細(xì)胞毒性也不一樣。用于融合分子量普通在1000－4000，普通作用濃度在35％－50％之間，PEG作用1－2分鐘，以PH8.0－8.2時(shí)融合率最高。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第58頁小白鼠脾臟細(xì)胞B

與癌細(xì)胞N

以PEG進(jìn)行融合，操作在10min內(nèi)完成(以下圖)，隨即把細(xì)胞平均分配在96槽細(xì)胞培養(yǎng)盤中

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第59頁細(xì)胞融合：1.脾細(xì)胞準(zhǔn)備；拉頸處死小鼠；無菌操作取出脾臟；清洗、研磨。2.制備脾細(xì)胞懸液:搜集細(xì)胞；離心洗滌；細(xì)胞計(jì)數(shù)。3.準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞:搜集細(xì)胞；離心洗滌；活細(xì)胞計(jì)數(shù)；調(diào)整細(xì)胞濃度，骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾胞按一定百分比混合。4.細(xì)胞融合劑選擇：病毒，PEG。5.細(xì)胞融合：在聚乙二醇作用下各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第60頁將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2：1或10：1百分比混勻于50ml錐形離心管內(nèi)。1200rpm離心7—10分鐘，盡可能吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀細(xì)胞鋪展成薄層。在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%PEG0.5ml，隨即靜置90秒。再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清培液或鹽水緩沖液，以終止PEG作用，再靜置10分鐘。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第61頁融合細(xì)胞早期觀察及其異常結(jié)果分析：1．融合后細(xì)胞早期觀察與管理；2．無分泌特異性抗體雜交瘤原因分析；3．轉(zhuǎn)種與擴(kuò)大培養(yǎng)過程中雜交瘤細(xì)胞生長；4．不出現(xiàn)雜交瘤原因分折。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第62頁三雜交瘤細(xì)胞篩選融合將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)HAT1234細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第63頁HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細(xì)胞不超出2×105ml，即可加入有喂養(yǎng)細(xì)胞96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時(shí)每隔2－3天半量換液，7天后能夠選擇出雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第64頁HAT選擇系統(tǒng)HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）一個(gè)選擇性培養(yǎng)基，其中三種成份與細(xì)胞DNA合成相關(guān)。DNA合成路徑有兩種。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第65頁雜交瘤技術(shù)中，常選取次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺點(diǎn)（HPRT-）骨髓瘤細(xì)胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺點(diǎn)型（TK-）骨髓瘤細(xì)胞為親本之一。HPRT-細(xì)胞嘌呤只能由全合成路徑產(chǎn)生；TK-

細(xì)胞嘧啶只能由全合成路徑合成。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細(xì)胞內(nèi)嘌呤和嘧啶全合成路徑。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第66頁淋巴細(xì)胞含有合成DNA兩條路徑。雜種細(xì)胞經(jīng)過互補(bǔ)作用取得HRPT或TK基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，經(jīng)過補(bǔ)救合成路徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT-

或TK-

親本細(xì)胞死亡，淋巴細(xì)胞亦逐步死亡，只有雜種細(xì)胞存活。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第67頁四可分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞篩選HAT將培養(yǎng)皿孔內(nèi)上清液取出，檢測(cè)抗體。慣用方法有：放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫熒光測(cè)定。融合細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第68頁五雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)123456融合HAT細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第69頁雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定分泌特異抗體細(xì)胞系。在培養(yǎng)過程中，普通要加能釋放一些生長因子促進(jìn)雜交瘤生長喂養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第70頁克隆化目標(biāo)

1）是細(xì)胞建株必經(jīng)過程，以得到遺傳特征相同細(xì)胞；

2）就雜交瘤而言，可從中篩選出穩(wěn)定而同源雜種細(xì)胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定雜交瘤細(xì)跑。

3）降低非分泌型無關(guān)細(xì)胞生長過快。

注意事項(xiàng)：①待克隆細(xì)胞生優(yōu)點(diǎn)于對(duì)數(shù)增加期；②小牛血清質(zhì)量和濃度；③細(xì)胞計(jì)數(shù)要準(zhǔn)確；④及時(shí)觀察細(xì)胞生長情況。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第71頁喂養(yǎng)細(xì)胞種類和作用

對(duì)于培養(yǎng)小鼠細(xì)胞來說，主要有以下各種細(xì)胞可供作為其喂養(yǎng)細(xì)胞：

①胸腺細(xì)胞,用量為106/0.2ml

②正常脾細(xì)胞；

③傳代培養(yǎng)中大鼠胚胎成纖維細(xì)胞；

④腹腔細(xì)胞其用量為2×104/0.2ml，腹腔細(xì)胞是使用得最普遍喂養(yǎng)細(xì)胞。

胚胎成纖維細(xì)胞因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下有分裂增殖能力，故只適應(yīng)于軟瓊脂平板法培養(yǎng)中，該細(xì)胞鋪于平板底層。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第72頁

喂養(yǎng)細(xì)胞作用

①提升培養(yǎng)細(xì)胞密度，使待克隆細(xì)胞輕易生存與繁殖。

②腹腔細(xì)胞能去除培養(yǎng)中死亡細(xì)胞，從而促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞克隆生長。

③喂養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長因子類物質(zhì)，起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖作用。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第73頁1.有限稀釋法稀釋細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第74頁1）有限稀釋法

有限稀釋法原理是從理論上將細(xì)胞稀釋到10個(gè)/ml，然后裝成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理論上含有單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)后即可取得單個(gè)細(xì)胞形成集落。

有限稀釋法舉例：

1.取1.0ml5×104ml細(xì)胞+4ml培養(yǎng)基稀釋，得1×104/ml.

2.取0.5ml1×104ml細(xì)胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1×103/ml.

3.取1.0ml1×103ml細(xì)胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1×102/ml.

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第75頁2.軟瓊脂培養(yǎng)法在加入喂養(yǎng)細(xì)胞無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細(xì)胞0.25％軟瓊脂。待細(xì)胞長成集落后，用毛細(xì)管吸出移種于含喂養(yǎng)細(xì)胞96孔板內(nèi)。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第76頁2）軟瓊脂培養(yǎng)法：

本法對(duì)于一些抗原，能夠把克隆化培養(yǎng)與特異性篩選測(cè)定結(jié)合起來進(jìn)行，所以它特點(diǎn)是效率較高，速度較快。但缺點(diǎn)是克隆率不高?；驹硎抢脝蝹€(gè)細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基上局限化生長，待細(xì)胞集落長到肉眼可見后，用巴氏吸管從瓊脂上挑出來(普通8—10天后)，再移到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行生長繁殖，并檢測(cè)培養(yǎng)上清液活性。也能夠用溶血空斑技術(shù)或圍繞集落形成免疫沉淀方法來直接測(cè)它活性。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第77頁3.顯微鏡操作法細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第78頁3）顯微鏡操作法

在倒置(或解剖)顯微鏡下，借助于毛細(xì)吸管將單個(gè)細(xì)胞個(gè)別吸出，分別放入已加喂養(yǎng)細(xì)胞96孔培養(yǎng)孔內(nèi)，依據(jù)原理不一樣，又分為普通法和玫瑰花結(jié)兩種方法。

普通顯微鏡操作法：于6cm平皿中，假如約103個(gè)細(xì)胞；CO2培養(yǎng)基箱中靜置1小時(shí)左右無菌條件；在倒置顯微鏡下去平皿蓋用直角轉(zhuǎn)頭滴管，吸出單個(gè)細(xì)胞移至預(yù)先加有喂養(yǎng)細(xì)胞96孔板內(nèi)直至96孔均分裝有細(xì)胞，加蓋；于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)觀察與更換培養(yǎng)方法同有限稀釋法。

玫瑰花結(jié)原理：分泌抗體細(xì)胞在其表面含有抗原受體，在—定條件下常可與特異性抗原致敏羊紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)。假如從免疫動(dòng)物脾細(xì)胞中除去能形成特異性玫瑰花結(jié)細(xì)胞則失去對(duì)特異性抗原反應(yīng)性。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第79頁4.熒光激活分離法細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第80頁熒光激活細(xì)胞分離器法(FluoresemuactivatedCellSortu，F(xiàn)ACS)

用本儀器分離單細(xì)胞原理是將懸液中細(xì)胞引入一個(gè)液流中央，使其一個(gè)接一個(gè)地經(jīng)過聚焦高能激光束，依據(jù)熒光和光放射性質(zhì)快速分析和分離細(xì)胞。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第81頁5）蓋片分離法

1.用釘錘于潔凈橡膠上砸潔凈蓋片；

2.選擇碎塊、大小形態(tài)適用選出；

3.加培養(yǎng)液及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

4.倒置鏡下選細(xì)胞，挑出單細(xì)胞玻片；

5.進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第82頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第83頁

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第84頁大量生產(chǎn)單克隆抗體：(1)體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體；（2）體nei雜交瘤細(xì)胞制備腹水或血清1)實(shí)體瘤法：對(duì)數(shù)生長久雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml.腫瘤到達(dá)一定大小后則可采血，從血清取得單克隆抗體。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第85頁2）腹水制備：腹腔注射1x106雜交瘤細(xì)胞，按種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水。也可用注射器抽取腹水，可重復(fù)搜集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml，能夠?qū)⒏顾屑?xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第86頁防止夭折方法可采取：①換液動(dòng)作輕柔、換液量不超出1/2；②防止重復(fù)取出CO2培養(yǎng)箱，不宜經(jīng)常換液；③不輕易更換新批號(hào)小牛血清。及時(shí)判斷陽性孔也是一項(xiàng)主要工作，可起降低工作量和確保重點(diǎn)雜交細(xì)胞雙重作用，待集落生長到96孔板孔1/3左右，24孔板1/5左右，就要及時(shí)測(cè)定各孔上清中是否會(huì)有特異性抗體，一旦發(fā)覺抗體陽性孔，就應(yīng)馬上擴(kuò)大培養(yǎng)，再凍存和克隆化，以免被其它細(xì)胞生長所壓抑或意外丟失。無分泌特異性抗體雜交瘤原因分析：融合后經(jīng)HAT選擇有細(xì)胞克隆出現(xiàn)，但不能篩選出產(chǎn)生特異抗體雜交瘤，常見原因是：①抗體檢測(cè)法不夠敏感；②HAT選擇失敗；③染色體丟失和克隆競爭；④動(dòng)物免疫不成功。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第87頁雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第88頁單克隆抗體應(yīng)用主要用于疾病診療、治療和預(yù)防。與常規(guī)抗體相比，含有特異性強(qiáng)、靈敏度高優(yōu)點(diǎn)。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細(xì)菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病診療；在疾病治療方面，單克隆抗體如同人體衛(wèi)士，能識(shí)別“自己”與“異己”，一旦發(fā)覺致病原因便與之結(jié)合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥品制成“生物導(dǎo)彈”，將藥品定向帶到癌細(xì)胞所在部位，既毀滅了癌細(xì)胞又不會(huì)傷害健康細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第89頁美國科學(xué)家采取細(xì)胞融合技術(shù)將番茄和馬鈴薯細(xì)胞融合在一起，培育出稱之為“番茄薯”或“薯番茄”新型植物。植株地上部結(jié)番茄，地下部生長根莖，產(chǎn)量高，品質(zhì)好。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第90頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第91頁動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體

思索與探究

1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不一樣？

提醒：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不一樣是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動(dòng)物細(xì)胞融合是兩個(gè)體細(xì)胞直接融合。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第92頁2.制備單克隆抗體時(shí)，為何要選取B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？

提醒：哺乳動(dòng)物感染抗原后，其體內(nèi)會(huì)形成對(duì)應(yīng)B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞能分泌對(duì)應(yīng)抗體凝聚或殺死這些抗原。動(dòng)物在免疫反應(yīng)過程中，每一個(gè)B淋巴細(xì)胞能分泌一個(gè)特異性抗體，要想取得大量特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞含有產(chǎn)生單一抗體能力，但不能在體外增殖骨髓瘤細(xì)胞是一個(gè)癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。所以，把一個(gè)B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會(huì)兼有兩個(gè)親本細(xì)胞特征──在體外培養(yǎng)條件下能不停增殖，同時(shí)能產(chǎn)生出某種特異性抗體。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第93頁3已成功動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)例還有哪些？生物種類細(xì)胞起源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—

血紅細(xì)胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細(xì)胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細(xì)胞—畸胎瘤細(xì)胞1978年細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第94頁4.為何不