一種制備唾液酸磁性表面分子印跡聚合物的新方法

摘要一鍋法合成的氨基化磁性納米顆粒Fe3O4@NH2，與對甲?；脚鹚幔‵PBA）反應(yīng)嫁接上硼酸官能團，通過硼酸基與模板唾液酸Neu5Ac分子上的順式二醇共價反應(yīng)，將Neu5Ac定向固定于磁性納米顆粒。以多巴胺（DA）及3-氨基苯硼酸（3-APBA）為功能單體，自聚合反應(yīng)形成共聚殼層包覆在磁性納米顆粒的表面，制備得Neu5Ac磁性分子印跡聚合物（MMIPs）。通過透射電鏡、紅外光譜對其形態(tài)及結(jié)構(gòu)進行表征，并評價其吸附性能。結(jié)果表明，Neu5Ac磁性分子印跡聚合物對Neu5Ac具有較好的吸附量、較好的印跡效率、較好的特異性等優(yōu)點；通過對Neu5Ac至少5輪吸附-洗脫的循環(huán)實驗表明，MMIP具有較好的重復(fù)再利用能力。引言唾液酸是一類天然神經(jīng)氨酸的N-或O-衍生物的總稱?，F(xiàn)已知的唾液酸成員有50多種，主要包括N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）和脫氨神經(jīng)氨酸（KDN）3種核心結(jié)構(gòu)。唾液酸基本上都是這3種核心成分的乙?；?、巰基化、甲基化、酯化和內(nèi)酯化產(chǎn)物。唾液酸在機體生理、病理過程中發(fā)揮重要的作用。Neu5Ac、Neu5Gc是唾液酸最豐富的形式；人體內(nèi)主要的唾液酸形式是Neu5Ac。研究表明，Neu5Gc可能參與了人體慢性炎癥、腫瘤和心血管疾病如血管炎和動脈粥樣硬化等的發(fā)展。來源于飲食的Neu5Ac可增加腦內(nèi)唾液酸水平，促進神經(jīng)發(fā)育、提高認知能力；Neu5Ac是保健品燕窩中的最重要成分。另外，KDN也可以作為Neu5Ac的替代品，在選擇拮抗劑和保健食品添加劑方面發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，已有多種方法來分析糖綴合物中的唾液酸，包括薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法和核磁共振波譜法等[7]。但是，這些方法的共同局限性是需要純化樣品以避免其他污染物的干擾。因此，對唾液酸的分離純化對與唾液酸相關(guān)的食品藥品質(zhì)量、疾病代謝機理研究都有著重要的意義。利用分子印跡技術(shù)，模板分子與功能單體間共聚合成的對模板具有特異性識別能力的分子印跡聚合物，以其低成本、制備簡單、物理和化學(xué)穩(wěn)定性好，適應(yīng)各種復(fù)雜樣品環(huán)境和高特異性等優(yōu)點在分離、純化等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。表面分子印跡法形成的表面印跡層更薄，印跡腔更靠近表面，模板分子更容易出入結(jié)合點位，提高了分子印跡聚合物對模板的結(jié)合能力和傳質(zhì)速率。苯硼酸（PBA）在堿性條件下可與唾液酸的順式二羥基結(jié)構(gòu)共價結(jié)合形成環(huán)狀酯，當(dāng)環(huán)境處于pH

7.4時，二者的結(jié)合常數(shù)大于PBA對其他糖類的結(jié)合常數(shù)；當(dāng)環(huán)境pH變?yōu)樗嵝裕h(huán)狀酯解離。硼酸基化的磁性納米顆粒（Fe3O4@BA），不僅可定向固定模板唾液酸分子，并可通過改變環(huán)境pH實現(xiàn)對唾液酸的快速吸附和解吸，這對后續(xù)制備均質(zhì)的表面印跡聚合物極為有利。多巴胺（DA）是一種含有鄰苯二酚和胺類官能團的生物分子，也可作為一種性能良好的分子印跡功能單體，在弱堿性水溶液中自聚合在物體表面，形成一層具親水性和生物相容性的聚多巴胺膜，該膜的厚度可通過改變基體材料和多巴胺的質(zhì)量比來調(diào)節(jié)。另據(jù)報道，3-氨基苯硼酸（3-APBA）也可作為功能單體自聚合。本文提出了一種基于模板的定向固定和表面分子印跡技術(shù)相結(jié)合，以DA及3-3-APBA為功能單體，制備唾液酸Neu5Ac磁性分子印跡聚合物（MMIP）的方法。該方法工藝簡單、條件溫和。目前尚無類似方法制備唾液酸Neu5Ac磁性分子印跡聚合物的文獻報道。正文部分1

實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

表征1.3

Neu5Ac-MMIPs和MNIPs的合成下圖為制備Neu5Ac磁性分子印跡聚合物（MMIP）的總體方案。1.4

吸附實驗在吸附動力學(xué)實驗中，稱取2mgNeu5Ac-MMIPs（或MNIPs），加入2mL（10μg/mL）Neu5Ac溶液，室溫孵育10～120min，磁力分離上清液和磁性聚合物。按照唾液酸熒光標(biāo)記試劑盒說明書，使用1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧苯（DMB）熒光衍生物對上清液中未被吸附的Neu5Ac進行標(biāo)記，HPLC檢測，分析峰面積，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中唾液酸的濃度，得到被吸附量。2

結(jié)果與討論2.1

印跡條件的影響雖然DA和3-APBA都可單獨的作為表面分子印跡的功能單體，但是DA對硼酸基的親和力比Neu5Ac對硼酸基的親和力強；若單獨使用DA作為功能單體，DA可競爭取代定向固定于磁核表面的模板Neu5Ac；若單獨使用3-APBA作為功能單體，產(chǎn)物印跡聚合物表面將殘留數(shù)目可觀的硼酸基團，即在印跡腔外也有大量非特異結(jié)合位點；以上兩種情況都會嚴(yán)重影響印跡聚合物對Neu5Ac的特異性吸附效果。2.2

Neu5Ac-MMIPs的表征為驗證磁性印跡聚合物制備過程中，各步驟的官能團修飾是否成功，我們對各步驟產(chǎn)物進行了傅里葉紅外吸收光譜分析。如圖2所示，F(xiàn)e3O4@NH2、Fe3O4@BA、Neu5Ac-MMIPs

3種納米材料在567cm-1附近都有一個較強的吸收峰，對應(yīng)于Fe—O鍵的振動吸收峰。Fe3O4@NH2在1100cm-1附近的吸收峰對應(yīng)于C—NH2的振動吸收峰，表明磁核表面確實已氨基化；盡管Fe3O4@BA上B—C鍵和B—O鍵的紅外吸收峰很弱，在紅外光譜中無法明顯顯示，但其在1100cm-1附近的振動吸收峰消失了，故依舊可推測此處的氨基與FPBA的硼酸基團發(fā)生反應(yīng)；而在Neu5Ac-MMIPs上，C—NH2的振動吸收峰重新出現(xiàn)，這是由于聚多巴胺表面存在大量氨基基團，表明DA如期形成聚合層。Fe3O4@NH2和Neu5Ac-MMIPs在透射電鏡下的形貌如圖3所示，所制備的磁性納米顆粒粒徑約30nm，均一度好、分散性也不錯。2.3

Neu5Ac-MMIPs的吸附動力學(xué)和等溫吸附線2.4

選擇性評價2.5

可重復(fù)性實驗10%醋酸水溶液清洗后的Neu5Ac-MMIPs可以被回收重復(fù)使用。將分子印跡聚合物Neu5Ac-MMIPs對Neu5Ac連續(xù)進行5個吸附-洗脫循環(huán)實驗，考察印跡聚合物的穩(wěn)定性及吸附能力，結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，Neu5Ac-MMIPs性質(zhì)很穩(wěn)定，5次吸附-洗脫循環(huán)后其吸附量仍然可以達到第一次吸附量的93%。3

結(jié)論結(jié)論本文以硼酸基團修飾的磁性納米顆粒為核，結(jié)合模板的定向固定和表面分子印跡技術(shù)，建立了一種制備核殼型唾液酸磁性分子印跡聚合物的方法。所制備的磁性分子印跡聚合物Neu5Ac-MMIPs對Neu5Ac最大理論吸附量為2.82mg/g，相應(yīng)的印跡因子為2.18，說明具有較大的吸附量和較好的印跡效果；研究其吸附動力學(xué)曲線發(fā)現(xiàn)，Neu5Ac-MMIPs對于Neu5Ac在90min基本達到吸附平衡；在選擇性吸附實驗中，Neu5Ac-MMIPs表現(xiàn)出對Neu5Ac良好的選擇性，對常見的6種單糖及Neu5Gc的選擇性