GB/T 40664-2021 用于高通量測序的核酸類樣本質(zhì)量控制通 用要求（正式版）

ICS07.080GB/T40664—2021用于高通量測序的核酸類樣本國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 1 14質(zhì)量控制要求 24.1通用要求 24.2基因組DNA核酸類樣本質(zhì)量要求 34.3總RNA核酸類樣本質(zhì)量要求 35質(zhì)量檢測方法 35.1主要設(shè)備和儀器 35.2核酸類樣本質(zhì)量檢測方法 4附錄A(資料性)核酸類樣本完整性檢測示例圖 5ⅢGB/T40664—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國生物樣本標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC559)提出并歸口。本文件起草單位：深圳華大生命科學(xué)研究院、中國計量科學(xué)研究院、深圳華大智造科技股份有限公屬醫(yī)院(廣東省中醫(yī)院)、湖北國際旅行衛(wèi)生保健中心(武漢海關(guān)口岸門診部)。GB/T40664—2021隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，越來越多種類的核酸樣本被用于高通量測序，從而在DNA和RNA的分子水平來揭示不同物種間核酸序列的差異以及特定生物學(xué)過程和疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)理。由于核酸樣本的質(zhì)量會對高通量測序的數(shù)據(jù)結(jié)果產(chǎn)生直接影響，因此制定用于高通量測序的核酸類樣本質(zhì)量控制的通用要求就顯得尤為緊迫和重要，從而保證高通量測序的核酸樣本具備達(dá)標(biāo)的質(zhì)量，進(jìn)而得到可靠的測序數(shù)據(jù)，避免信息錯誤和信息丟失等情況的出現(xiàn)。本文件是基于高通量測序技術(shù)應(yīng)用和驗(yàn)證數(shù)據(jù)而制定，規(guī)定了多種高通量測序類型的核酸樣本準(zhǔn)入要求，從而提高測序的成功率及準(zhǔn)確性，對于規(guī)范整個高通量測序市場起到了重要作用。1GB/T40664—2021用于高通量測序的核酸類樣本質(zhì)量控制通用要求1范圍核生物的基因組DNA和總RNA樣本。GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程帶有遺傳信息的生物大分子。由四種主要的脫氧核苷酸(脫氧單磷酸腺嘌呤dAMP、脫氧單磷酸鳥嘌呤dGMP、脫氧單磷酸胞嘧啶dCMP和脫氧單磷酸胸腺嘧啶dTMP)通過3',5'-磷酸二酯鍵連接注：不同種類的RNA鏈長不同，行使各式各樣的生物功能，如與蛋白質(zhì)生物合成有關(guān)的RNA有信使RNA(mes-sengerRNA,mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transferRNA,tRNA)和核糖體RNA(ribosomeRNA,rRNA);與轉(zhuǎn)錄后加工有關(guān)的RNA有核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)、核仁小RNA(smallnucleolarRNAs,snoRNAs);與生物調(diào)控有關(guān)的RNA有微RNA(microRNAs,miRNA)、干擾小RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等。生物細(xì)胞中主要的核糖核酸之一，是一種具有催化能力的核糖酶。注：其單獨(dú)存在時不能如其他核糖核酸那樣發(fā)揮作用，僅在與多種核糖體蛋白質(zhì)共同構(gòu)成核糖體(一種無膜細(xì)胞器)后才能執(zhí)行其功能，是含量最高的一種RNA。原核生物的核糖體所含的rRNA有52核生物有4種rRNA,它們分子大小分別是5S、5.8S、18S和28S。一種簡便高效的分離和純化DNA片段的方法。注：由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場中向正極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，常用的分子篩有瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA在分子篩中泳動速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來使其分離。在電泳過程中可以通過將樣品和示蹤染料或相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物一起進(jìn)行電泳而得到檢測。通常包括自配制及商業(yè)化預(yù)制膠凝膠電泳。RNA完整性，RIS/RIN(RIN2)/RQS值均為1～10,數(shù)值越大表明RNA完整性越好。S表示顆粒物質(zhì)或溶質(zhì)在超速離心場中的沉降速率。注：一般用s表示，8=v/a,其中a為重力加速度或離心加速度，v為沉降速度，即沉降系數(shù)為每單位離心力場的沉高通量基因測序high-throughputgenesequencing高通量測序high-throughputsequencing4.1通用要求4.1.1用于高通量測序的核酸類樣本應(yīng)根據(jù)GB/T4.1.2生物樣本及相關(guān)數(shù)據(jù)的使用應(yīng)遵守區(qū)域、國家和國際的倫理規(guī)范。GB/T40664—20214.1.4樣本質(zhì)量要求應(yīng)通過完整性和樣本濃度確定。4.2基因組DNA核酸類樣本質(zhì)量要求4.2.1基因組DNA完整性基因組DNA是組成生物基因組的所有DNA。其完整性應(yīng)符合凝膠電泳主帶單一，在23kb左右4.2.2基因組DNA樣本濃度單位體積的液體里含核酸的量，可使用質(zhì)量濃度(ng/μL)表示?；鶗r儀器檢測精度不夠且影響文庫構(gòu)建的成功率，不同文庫構(gòu)建類型和不同高通量測序儀對樣本濃度要4.3總RNA核酸類樣本質(zhì)量要求總RNA是從基因組轉(zhuǎn)錄出來的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。包括信使RNA、核糖體RNA及一些與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)錄后翻譯有關(guān)的非編碼RNA?？赏ㄟ^總RNA的檢測確定RNA的完整性。RNA樣本的完整性宜通過微流控或自動化凝膠電泳分析總RNA的RIN值以及rRNA的28S/18S或23S/16S比值進(jìn)行判斷(其中原核生物應(yīng)使用23S/16S數(shù)值進(jìn)行判斷，真核生物應(yīng)使用28S/18S數(shù)值進(jìn)行判斷),真核生物又分為人、動物，植物、真菌和昆蟲這三類作不同要求。不同物種的總RNA完整性要求見表1。微流控分析檢測圖譜見A.2～A.5。完整性要求樣本類型原核生物總RNA植物、真菌總RNA人、動物(不含昆蟲)總RNA—23S/16S或28S/18S18S主帶清晰微流控檢測圖譜基線基線呈直線基線呈直線基線呈直線基線呈直線總RNA樣本濃度低于1ng/μL時儀器檢測精度不夠且影響RNA文庫構(gòu)建的成功率，不同文庫構(gòu)建類型和不同高通量測序儀對樣本濃度有不同要求，樣本濃度應(yīng)大于1ng/μL。5質(zhì)量檢測方法5.1.2微流控電泳分析儀。34GB/T40664—20215.1.3定量熒光計：可配合熒光染料檢測試劑快速完成核酸濃度的讀取，最低應(yīng)能檢測0.2ng/μL的核酸樣本。5.2核酸類樣本質(zhì)量檢測方法5.2.1基因組DNA核酸類樣本的檢測方法采用凝膠電泳法檢測DNA核酸樣本的完整性，宜使用1%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓120V,電泳時間30min;采用熒光染料法進(jìn)行核酸濃度的檢測，按照對應(yīng)的熒光染料檢測試劑流程進(jìn)行操作。5.2.2總RNA核酸類樣本的檢測方法采用微流控電泳或自動化凝膠電泳分析法檢測總RNA核酸樣本的完整性，具體操作參考微流控電泳或自動化凝膠電泳的操作說明；常規(guī)樣本宜采用熒光染料法進(jìn)行總RNA濃度的檢測，微量樣本宜采用微流控電泳或自動化凝膠電泳分析法檢測總RNA的濃度。5GB/T40664—2021A.1基因組DNA樣本完整性檢測凝膠電泳檢測基因組DNA樣本完整性結(jié)果見圖A.1。泳道2、泳道3的樣本降解嚴(yán)重，高通量測序結(jié)果堿基測序準(zhǔn)確率低于99%。bpbp400002000094168144655761084361407223130說明：Mnarker,參照標(biāo)準(zhǔn)，用于指示核酸分子大小的一系列核酸分子；bp——basepair,堿基對，用于表示DNA核酸類樣本分子大小的單位。注2:泳道2、泳道3:樣本DNA主帶不清晰，有彌散，降解嚴(yán)重。圖A.1凝膠電泳檢測結(jié)果A.2原核總RNA樣本完整性檢測微流控電泳檢測原核總RNA樣本完整性結(jié)果見圖A.2。6GB/T40664—2021RNAArca;201.8RNAConeen|raliL17-403ng/μLrRNARatio[23S16S]:1.2RNAInlegrityNumber(RIN)7.9[B.02.07,AnomalyThreshold(s)manuallyadapled]Ecoli711RNAConcentrationrRNARatio[23S/16S] 23S和16S的rRNA比值：RNAIntegrityNumber(RIN)——儀器自己計算出的一個數(shù)值，代表了RNA的完整性。圖A.2原核樣本微流控電泳檢測結(jié)果A.3植物總RNA樣本完整性檢測微流控電泳檢測植物總RNA樣本完整性結(jié)果見圖A.3。7GB/T40664—2021OverallResultstorsaimplc8:RNAArea:RNAConcentration:rkNARatio[28S/185]:RNAIntegrityNumber(RIN):A6260ngiulL6.8(B02.07)FUntA62RNAAreaRNAConcentrationrRNARatio[28S/18S]RNAIntegrityNumber(RIN) ——樣本8的總結(jié)果； 圖A.3植物樣本微流控電泳檢測結(jié)果A.4昆蟲總RNA樣本完整性檢測微流控電泳檢測昆蟲總RNA樣本完整性結(jié)果見圖A.4。8GB/T40664—2021OvcrallResultsforsample8:RNAArea:RNAConcentration:rRNARatro|28S/18S|:RNAIntegrityNumber(RIN):NA(B3.02.07)Ld—1RNAArea RNAIntegrityNumber(RIN)——儀器自己計算出的一個數(shù)值，代表了RNA的完整性。昆蟲樣本沒有此數(shù)值，所以顯示N/A。圖A.4昆蟲樣本微流控電泳檢測結(jié)果A.5動物總RNA樣本完整性檢測微流控電泳檢測動物總RNA樣本完整性結(jié)果見圖A.5。GB/T40664—202104000RNAArcaRNAConccntration:FU——熒光單位，熒光的大小反映了核酸類樣本的濃度；ntOverallResultsforsam