DNA的復制與修復課件

3DNA的復制與修復3.1DNA復制概述3.2原核生物的DNA復制3.3真核生物的DNA復制3.4DNA修復3DNA的復制與修復DNA雙螺旋結構模型的建立為DNA自我復制機制做了初步解釋，即堿基互補——兩條鏈互補，堿基配對——模板式復制。DNA復制機理的復雜性D.S.DNA→S.S.DNA能量的供求構型的變化：超螺旋→線狀、開環(huán)狀多種酶類的互作→

Replisome3DNA的復制與修復復制的準確性（修復，校正）DNA復制速度（E.coli105bp/min，高速解旋112km/h?）DNA復制模式不統(tǒng)一（dsDNA、sDNA、LinearDNA….）DNA復制起始控制機理3DNA的復制與修復3.1DNA復制概述3.1.1DNA復制研究選材3.1.2DNA復制的半保留性3.1.3DNA復制過程的順序性3.1.4DNA的半不連續(xù)復制3.1.5復制子3DNA的復制與修復3.1DNA復制概述為了保證遺傳的穩(wěn)定性，在每次細胞分裂之前，遺傳信息載體必須精確地復制自己。遺傳信息的載體是DNA，但許多病毒的遺傳信息載體是RNA而不是DNA。3DNA的復制與修復3.1.1DNA復制研究選材原核細胞是研究DNA復制的最佳的實驗系統(tǒng)①細胞小，生活周期短，易在人工條件下培養(yǎng)，原核生物易獲得各種突變體。原核生物中的大腸桿菌是在各方面研究最深入的一種。3DNA的復制與修復②噬菌體（phage）是研究復制機制的一個重要實驗系統(tǒng)。優(yōu)點：基因組小，易操作；DNA分子有線形、環(huán)形、單鏈和雙鏈形式，可代表不同類型DNA的復制。如：線型，θ式，D型等復制。已研究過的典型噬菌體系統(tǒng)：Phageφx174、T4等。3DNA的復制與修復Watson和Crick發(fā)表了DNA雙螺旋模型之后又發(fā)表了DNA半保留復制（semiconservativereplicationmodel）模型，這一建立在堿基互補基礎上的機制，為DNA的轉錄、修復、和分子雜交等奠定了基礎。3.1.2DNA復制的半保留性3DNA的復制與修復DNA復制（replication）是在親代雙鏈DNA分子的每一條鏈上按堿基互補配對而準確地合成一條新的互補鏈，結果生成兩個與親代鏈相同的DNA雙鏈的過程。3DNA的復制與修復在半保留復制模型提出之前，普遍認為“蛋白質和核酸是彼此互補的，DNA自我復制過程是通過核酸和蛋白質的交替合成”。但Watson和Crick認為DNA自我復制時親本鏈保持不變，但雙鏈分開，每個親本鏈作為復制的模板，子代雙鏈含有一條親本鏈和一條新合成的鏈。這就是DNA復制的半保留模型。3DNA的復制與修復當時人們對半保留模型是持懷疑態(tài)度的，因雙螺旋模型中存在最大的問題是雙鏈是如何打開的？其所需的能量從何而來？Watson和Crick也承認這是“最大的問題”。人們?yōu)榱吮荛_打開雙鏈這個難題，又提出了全保留復制(conservativereplicationmodel)和分散(dispersivemodel)兩個模型。3DNA的復制與修復在全保留模型中兩條母鏈彼此結合，恢復原狀，新合成的兩條子鏈彼此互補結合形成一條新的雙鏈。在分散模型中親代雙鏈被切成雙鏈片段，而這些片段又可作為新合成雙鏈片段的模板，新、老雙鏈片段又以某種方式聚集成“雜種鏈”。后來通過實驗證實其中半保留模型是正確的。3DNA的復制與修復DNA復制的3種假說3DNA的復制與修復3.1.2.1半保留復制在DNA的半保留復制過程中復制區(qū)域雙螺旋解旋并分開，以每條單鏈為模板，按堿基互補配對原則，由DNA聚合酶催化合成新的互補鏈，結果由一條鏈成為互補的兩條鏈，這樣新形成的兩個DNA分子與原來的DNA分子的堿基序列完全相同。由于每個子代DNA的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復制方式稱為半保留復制(semiconservationreplication)。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3.1.2.2半保留復制的證據(jù)①Meselson和Stahl的實驗他們的同位素標記和密度梯度離心實驗支持了半保留復制方式。PhotographtakenbyF.L.HolmesofMattMeselsonandFrankStahlin1996,standingatthesitewheretheymetatWoodsHole42yearsearlier.CourtesyoftheHolmesfamily.3DNA的復制與修復1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N標記DNA，而不用放射性同位素32P和14C。15N會導致DNA分子密度顯著增加，這樣可通過密度梯度離心將親本鏈和子代鏈區(qū)分開來。3DNA的復制與修復將大腸桿菌放在15NH4C1培養(yǎng)基中生長15代，使DNA被15N標記后，再將細菌移到只含有14NH4C1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別取0代、1代、2代、3代的細胞，提取DNA，進行密度梯度離心，分辨重鏈DNA、正常的輕鏈DNA和包含一條重鏈和一條輕鏈的DNA“雜種鏈”。3DNA的復制與修復離心后從管底到管口DNA分子就停留在與其相當?shù)腃sC1密度處，紫外光下可以看到形成的區(qū)帶。14N-DNA密度較輕，停留在離管口較近的位置；15N-DNA密度較大停留在較低的位置。3DNA的復制與修復當含有15N-DNA的細胞在14NH4C1培養(yǎng)液中培養(yǎng)1代后，只有一條區(qū)帶介于14N-DNA與15N-DNA之間。培養(yǎng)2代后則在14N-DNA區(qū)又出現(xiàn)一條帶。有等量的“雜種鏈”和輕鏈密度。這些結果只與半保留復制模型相符。全保留模型可以排除，但分散模型卻不能排除。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復Meselson等又將第1代的14N/15N雜種鏈變性使雙鏈分開，再將變性前后的雙鏈和單鏈分別進行CsCl密度梯度離心。變性前雜種雙鏈只有一種帶，密度為1.717g/cm3，變性后兩條單鏈的密度不同而呈現(xiàn)了兩條帶，一條為15N帶，（1.740g/cm3），另一條為14N帶（1.725g/cm3）。作為對照的是從肺炎球菌（S.pneumoniae）中提取的DNA，變性前后都只有一條帶，密度為1.700g/cm3。這一結果完全符合半保留復制預期的結果，并否定了全保留模型和分散模型。3DNA的復制與修復按照半保留復制方式培養(yǎng)兩代，只能出現(xiàn)14N和14N/15N兩種DNA分子，隨著代數(shù)的增加14N-DNA逐漸增加。而14N-15NDNA區(qū)帶逐漸減弱。3DNA的復制與修復②Taylor的實驗真核細胞的每條染色單體是由一條DNA雙鏈組成，1958年HerbertTaylar用3H的胸腺嘧啶核苷酸處理蠶豆根尖細胞8小時，然后移入含有秋水仙素而沒有標記放射性的培養(yǎng)液中。經(jīng)標記處理后第一次分裂中期的染色體周圍均顯示放射性，每個染色體中有一條染色單體被標記，另一條染色單體未被標記。第二次分裂中期的染色體就只有一個顯示有放射性，而另一個卻沒有。證明真核DNA復制也符合半保留模型。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復③姐妹染色單體差別染色方法（sister-chromatiddifferentialstaining）在復制過程中用胸腺嘧啶的類似物5-尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，BUdR）可摻入到新合成的DNA中。在兩細胞周期之后，一條染色單體中含有DNA分子的雙鏈都被BrdU取代，而另一條染色單體只有一條DNA單鏈中含有BrdU。若用熒光染料染色，DNA雙股都含有Brdu的染色單體的熒光強度要小于DNA的單股含BrdU的染色單體的熒光強度，在熒光顯微鏡下可觀察到兩條姐妹染色單體的熒光強弱不同。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復若用Giemsa染色，當雙鏈都插入5-BudR時則染不上Giemsa，而一條插入5-BudR則可染色。若細胞的培養(yǎng)基加入5-BudR則第二復制周期時，兩條姊妹染色體染色狀況不同，一明一暗，稱花斑染色體。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3.1.3DNA復制過程的順序性3.1.3.1邊解鏈邊復制DNA的復制是邊解鏈邊合成從SV40復制的早期電鏡照片可見復制部分和未復制部分。3DNA的復制與修復3.1.3.2復制起點DNA復制是從DNA分子上特定位置（原點，origin）開始，此位置稱復制起點(Originofreplication，ori)。3DNA的復制與修復復制起點（origin）是DNA復制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌體、細菌染色體、質粒和一些動物病毒的DNA通常具有明顯的復制起點。酵母也有特異的復制起點，在細胞周期S期染色體復制時起重要的作用。3DNA的復制與修復大多數(shù)原核生物基因組和細菌質粒只有一個Ori位點，而真核生物染色體中有多個Ori。例如，果蠅染色體DNA約有3000個Ori位點。3DNA的復制與修復3.1.3.3復制方向DNA復制方向的可能性。3DNA的復制與修復研究DNA復制的方向常用溫度敏感性變異菌株結合放射自顯影技術。大腸桿菌的一個溫度敏感株在42℃時能使DNA在完成復制后不再開始新的復制過程，而在25℃時復制功能恢復。將此溫度敏感株在同一時間開始復制，細菌同步生長。3DNA的復制與修復先將這種同步生長的突變株在含高比度3H-TdR中生長幾分鐘，再移入低比度3H-TdR中作脈沖標記。然后對菌體DNA作放射自顯影分析。若復制是單向的，僅有一個高比度區(qū)，且高比度與低比度的放射性分布應該鄰近。若復制是雙向的，有兩個分離的低比度放射性分布區(qū)。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復枯草桿菌孢子在弱放射性DNA前體培養(yǎng)基萌發(fā)標記一段時間，添加較強放射性前體3DNA的復制與修復果蠅（Drosophilamelanogaster）DNA復制的放射自顯影圖3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復DNA可進行單向和雙向復制，大多數(shù)DNA的復制是雙向的。有些病毒（如腺病毒、Φ29噬菌體等）及線粒體DNA的復制是單向進行的，滾筒式屬單向復制。3DNA的復制與修復SV40為5224bp的環(huán)形分子，有1個EcoRⅠ切點。中用EcoRⅠ酶切復制中的SV40得到復制眼大小不同的系列DNA分子，可見隨復制眼擴大兩側DNA變短，說明復制從原點開始雙向復制。3DNA的復制與修復真核一般為多起點復制胚性蠑螈細胞DNA復制的放射自顯影圖，圖像顯示多個復制起點可能同時開始復制3DNA的復制與修復也可利用變形對DNA電泳遷移的作用來確定復制原點。例如用二維作圖方法，即復制中DNA的限制性片段在第一維方向進行電泳，按分子量的大小分離。再在第二維方向電泳，第二維方向電泳移動主要由形狀決定。不同復制中分子會有不同的路徑，這可以通過它偏離雙倍大小線形DNA分子的路線的程度來確定。3DNA的復制與修復復制起點的位置和復制叉的數(shù)目決定了限制性復制片段的形狀，這些形狀可通過不同的電泳路跡(實線)顯示出來。虛線顯示線形DNA的電泳路跡。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復DNA正在復制的分叉部位稱為復制叉（replicationfork）3DNA的復制與修復非復制DNA的旁邊復制的DNA在電鏡下象只眼睛稱復制眼（泡）3DNA的復制與修復3.1.4DNA的半不連續(xù)復制DNA復制是半保留復制，且是半不連續(xù)復制(Semi-discontinuousreplication)。DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行的，因此，在復制起點處兩條DNA鏈解開成單鏈時，一條是5’→3’方向，另一條是3’→5’方向。3DNA的復制與修復DNA復制時，新生鏈延伸方向一條為3’→5’，另一條為5’→3’。但生物細胞內所有催化DNA聚合酶都只能催化5’→3’延伸。3DNA的復制與修復3.1.4.1半不連續(xù)復制的證據(jù)Okazaki（岡崎）于1968年通過3H–脫氧胸苷酸（3H–dT）標記實驗證明了半不連續(xù)復制。①實驗材料T4感染的E.coli：野生型phage–T4；mutantT4（連接酶突變）3DNA的復制與修復②實驗系統(tǒng)3H-dT標記phage-T4感染E.coli，分別進行脈沖標記實驗（pilse-labelingexperiment）和脈沖追蹤實驗（pulse-chaseexperiment），；密度梯度離心。檢測標記DNA在不同時間合成的情況。再分離提取T4噬菌體DNA，變性后，進行CsCl密度梯度離心，以檢測具放射性的沉降片段，判斷片段大小。3DNA的復制與修復③實驗結果：短時間內，首先合成較短的DNA片段（岡崎片段），接著出現(xiàn)較大的DNA分子。突變型連接酶T4中，大片段DNA很少或無。半不連續(xù)合成，放射性標記一半出現(xiàn)于短片段（岡崎片段），另一半出現(xiàn)在長片段DNA中。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復④結論：DNA復制是半保留半不連續(xù)復制。3DNA的復制與修復3.1.4.2半不連續(xù)復制在復制起點兩條鏈解開形成復制泡(replicationbubbles)，DNA向兩側復制形成兩個復制叉(replicationforks)。以復制叉移動的方向為基準，一條模板鏈是3’→5’，以此為模板的新生DNA鏈合成沿5’→3’方向連續(xù)進行，這條鏈稱前導鏈(leadingstrand)。3DNA的復制與修復另一條模板鏈的方向為5’→3’，以此為模板的新鏈合成方向也是5’→3’，但與復制叉前進方向相反，且是分段的不連續(xù)合成，這條鏈稱滯后鏈(laggingstrand)，合成的片段為岡崎片段(Okaxakifragments)。岡崎片段由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。3DNA的復制與修復前導鏈的連續(xù)復制和滯后鏈的不連續(xù)復制，稱為DNA合成的半不連續(xù)復制。3DNA的復制與修復3.1.5復制子DNA復制從起點開始雙向進行直到終點為止。①復制子(replicon)復制子（復制單元)是一個DNA復制起點（origin，ori）所控制的DNA序列。3DNA的復制與修復②原核生物中，只有一個復制原點，每個DNA分子上只有一個復制子；③真核生物中，每個DNA分子有多個復制子，每個復制子長約50-200kb；其DNA復制是由多個復制子共同完成的。每個細胞中，染色體DNA復制子一般只復制一次。大腸桿菌DNA復制1次需42min；人類復制叉前進100bp/s，復制整個基因體需8hr；果蠅復制整個基因體僅需3~4min。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復④染色體外遺傳元件的復制子染色體外遺傳元件包括：原核生物細胞中的質粒和噬菌體；真核生物細胞中的線粒體、葉綠體和病毒的DNA。染色體外遺傳元件一般為單復制子（只有一個origin），但為多次復制，為多拷貝。3DNA的復制與修復真核生物的線粒體和葉綠體復制一般與核DNA同步或稍滯后；原核生物的染色體DNA和質粒（噬菌體）一般不同步，但整合后同步。3DNA的復制與修復質粒整合前為θ式或滾筒式復制，整合后為一個復制子。質粒為雙向復制。3DNA的復制與修復E.coli溫敏型突變體在30℃復制正常，42℃時，E.coli復制起動受阻，而以質粒origin開始的單向復制。說明復制起始是受調控的。3DNA的復制與修復3.2原核生物DNA的復制3.2.1DNA的復制酶和相關蛋白3.2.2原核生物DNA復制的引發(fā)3.2.3DNA鏈的延伸3.2.4DNA復制的終止3.2.5DNA復制的保真機制3DNA的復制與修復3.2.1DNA的復制酶和相關蛋白DNA復制實際上就是DNA指導的DNA合成代謝，需要有DNA作為復制的模板。體外復制實驗證明，新合成DNA的特異性完全取決于事先加入的模板DNA。三磷酸核苷酸(dNTP)是合成原料。細胞內還有許多酶和蛋白質參與DNA的復制。3DNA的復制與修復3.2.1.1解旋酶(Helicase)DNA復制時，解旋酶在ATP的作用下可促使DNA母鏈不斷解開形成單鏈。DnaB利用ATP水解的能量解開雙螺旋，推動復制叉向前延伸。3DNA的復制與修復InE.coli,DnaBisahexamericproteinofsix471residuesubunits.DnaBhelicaseisa5'to3'helicasethattravelsalongthelaggingsinglestrandasitunwindsupstreamduplexDNA.3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3.2.1.2單鏈DNA結合蛋白(SSB)解旋酶沿復制叉方向推進產(chǎn)生了一段單鏈區(qū)，細胞內大量的單鏈DNA結合蛋白(singlestrandDNAbindingproteinSSB)能和單鏈DNA結合，防止其重新配對形成雙鏈DNA。3DNA的復制與修復單鏈結合蛋白通過與磷酸骨架結合使DNA單鏈相互分開，它們離開暴露的堿基，所以那些堿基可以作為DNA合成的模板。SSB與解旋酶不同，它不具備酶的活性。在E.coli細胞中主要SSB是177肽所組成的四聚體，可以和單鏈DNA上相鄰的32個核苷酸結合。T4噬菌體的單鏈結合蛋白是gp32，M13的單鏈結合蛋白是gp5。3DNA的復制與修復SSB的作用：使DNA單鏈保持一種伸展構象，作為模板；使解開的單鏈不形成發(fā)卡結構；保護DNA單鏈不受Dnase水解。3DNA的復制與修復SSB結合DNA單鏈有協(xié)同性(cooperativebinding)：一個SSB四聚體結合于單鏈DNA上可以促進其他SSB四聚體現(xiàn)相鄰的單鏈DNA結合。第一個gp32的結合會使下一個gp32與DNA單鏈的親和力提高1000倍。3DNA的復制與修復SSB可以重復使用，當新生的DNA鏈合成到某一位置時，該處的SSB便會脫落，并被重復利用。3DNA的復制與修復3.2.1.3DNA拓撲異構酶

(DNATopisomerase)拓撲異構體（topoisomer)：具有不同螺旋數(shù)的同一DNA分子兩種異構體。拓撲異構酶：可使DNA的兩種拓撲異構體互變的酶。DNA在細胞內以超螺旋狀態(tài)存在，DNA拓撲酶催化同一DNA分子不同超螺旋狀態(tài)之間的轉變。3DNA的復制與修復拓撲異構酶的功能：與DNA形成共價結合中間體，使DNA磷酸二酯鍵斷裂，形成DNAnick，DNA的一條鏈進行解旋，旋轉而改變DNA分子的拓撲狀態(tài)。3DNA的復制與修復拓撲異構酶可使DNA發(fā)生連環(huán)化（catenate）、脫連環(huán)化（decatenate）、打結（knot）和解結（unknot）。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復拓撲異構酶參與DNA的復制、轉錄的重組等過程。3DNA的復制與修復拓撲異構酶的種類分為Ⅰ型和Ⅱ型。原核拓撲構酶Ⅰ：MW=100kD，單肽鏈，含3~4個Zn。作用是暫時切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價中間物而使超螺旋DNA松弛，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來。每次改變一個連環(huán)數(shù)。E.Coli的拓撲構酶Ⅰ具有松弛負超螺旋作用，真核生物和古細菌的拓撲構酶Ⅰ具有松弛負超螺旋和正超螺旋的作用。3DNA的復制與修復原核拓撲構酶Ⅰ作用機制：①酶與DNA結合使雙鏈解旋；②使一條鏈切開，但酶與切口的兩端結合阻止了螺旋的旋轉；③酶使另一條鏈經(jīng)過缺口，然后再將兩斷端連接起來；④酶從DNA上脫落，兩條鏈復原，得到的DNA比原來少一個負超螺旋。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復拓撲異構酶Ⅱ拓撲異構酶Ⅱ也稱旋轉酶。廣泛存在于各種生物中。使正超螺旋轉化為負超螺旋，每次改變兩個連接數(shù)。3DNA的復制與修復拓撲異構酶Ⅱ催化模型3DNA的復制與修復1超螺旋DNA、2無酶、3–10酶量增加11缺ATP、12缺亞精胺、13缺MgCl2、14(同10)但缺ATP3DNA的復制與修復大多數(shù)天然狀態(tài)的雙鏈DNA均以負超螺旋的方式存在（極端嗜熱菌的DNA為正超螺旋），特別是進行半保留復制的DNA均以種種拓撲異構體的形式存在。負超螺旋是DNA復制的必需條件，負超螺旋可使DNA雙鏈堿基對打開所需要的能量降低4.1KJ/mol，因而，有利于DNA的雙鏈分開。3DNA的復制與修復真核生物拓撲異構酶酵母、兩棲類動物、昆蟲、哺乳動物和植物的Ⅰ拓撲異構酶的特性相似，但與原核的酶有明顯差異。Ⅰ型：MW=95kD，單體蛋白，不需ATP。Ⅱ型：MW=150~180kD，均為二聚體，需ATP和Mg2+。3DNA的復制與修復Ⅰ型拓撲異構酶Ⅱ型拓撲異構酶剪切一條鏈二條鏈機制酶非共價與DNA結合。一條鏈剪切，3’-P基團共價與激活位點的酪氨酸殘基結合。未剪切的鏈從缺口處通過。打斷的鏈重新連接。酶非共價與DNA結合。兩條鏈都剪切，5’-P基團共價與激活位點的酪氨酸殘基結合(這涉及對回旋酶和真核拓撲異構酶Ⅱ有4bp交錯)。未被切割的雙鏈通過構象改變從缺口通過。打斷的雙鏈重新連接。需要ATP不是大腸桿菌topoI(ω蛋白)、topoⅢ釋放負超螺旋回旋酶(topoⅡ)：誘導負超螺旋topoIV：去連接連鎖的環(huán)真核拓撲異構酶Ⅰ：釋放正和負超螺旋拓撲異構酶Ⅲ：釋放負超螺旋(弱活性)，不去連接拓撲異構酶Ⅱ：釋放正和負超螺旋拓撲異構酶Ⅳ：釋放負超螺旋，可能也能釋放正超螺旋3DNA的復制與修復3.2.1.4引發(fā)酶(Primase)引發(fā)酶以單鏈DNA為模板，利用核糖核苷酸合成RNA（10~12nt）作為DNA合成的引物。3DNA的復制與修復引物的意義在于減少致死突變。DNA合成中最初幾個核苷酸正確性遠比其后的低。引物RNA隨后被降解，從而減少了復制錯誤。3DNA的復制與修復DNA合成以RNA為引物的實驗證據(jù)Reiji以α-32P-dNTP標記＋未標記NTP為底物。引發(fā)合成后，用稀堿處理。3DNA的復制與修復32P出現(xiàn)在水解產(chǎn)物中（RNA水解），證明RNA為引物。3DNA的復制與修復引物的大小從野生型和突變型菌株中分離岡崎片段發(fā)現(xiàn)RNA引物用[32P]GTP和加帽酶標記岡崎片段中的完整引物a–d,DNase消化前e–h,DNase消化后a,e,RNaseH(-);b,f,DNApolⅠ(-)c,g,RNaseHandDNApolⅠ(-)d,h,wild-type3DNA的復制與修復引發(fā)酶催化引物RNA分子的合成，但它不同于RNA聚合酶。引發(fā)酶對rifampicin不敏感，而RNA聚合酶則敏感；引發(fā)酶只在復制起點處合成RNA引物而引發(fā)DNA的復制，而RNA聚合酶則是啟動DNA轉錄合成RNA從而將遺傳信息由DNA傳遞到RNA。3DNA的復制與修復大腸桿菌的引發(fā)酶由一條多肽鏈組成，MW為60kD（比RNA聚合酶小很多），每個細胞中有50~100個分子，由大腸桿菌的dnaG基因編碼。但在單鏈噬菌體M13DNA和質粒Co1E1DNA復制時，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌體T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引發(fā)酶的活性和具有大腸桿菌引發(fā)酶相似的功能。3DNA的復制與修復3.2.1.5DNA聚合酶(DNAPolymerase)有30多種蛋白共同參與E.coli的DNA復制，其中催化DNA合成的DNA聚合酶（Polymerase）在不同生物中也具有同源物。E.coli中存在3種DNA聚合酶。3DNA的復制與修復原核DNA聚合酶：DNApolymeraseⅠ、DNApolymeraseⅡ和DNApolymeraseⅢ3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復DNApol的發(fā)現(xiàn)1956年，Kornberg用無細胞E.coli系統(tǒng)證明DNA是模板合成。1958年發(fā)現(xiàn)DNApolⅠ。3DNA的復制與修復①大腸桿菌DNApolymeraseⅠ1958年ArthurKornberg發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，又稱Kornberg酶。此酶已經(jīng)研究清楚且代表了其他DNA聚合酶的基本特點。3DNA的復制與修復酶的性質DNApolⅠ由一條多肽鏈組成，約含1000個氨基酸殘基，MW為102KD。分子含有一個二硫鍵和一個SH基。每個分子中含有一個Zn2+，在DNA聚合反應起著很重要的作用。每個大腸桿菌細胞中含有約400個分子，每個分子37℃下能催化600nt/min摻入正在生長的DNA鏈。3DNA的復制與修復DNApolⅠ可被枯草桿菌蛋白酶裂解成2個片段，大片段稱為Klenow片段，具聚合酶和3’→5’外切酶的活性，由兩個結構域組成。小片段具有5’→3’外切酶活性。3DNA的復制與修復酶的活性中心位置上至少有6個結合位點：模板DNA結合位點；DNA生長鏈或引物結合位點；引物末端結合位點；脫氧核苷三磷酸結合位點；5’→3’外切酶活性位點，用以結合生長鏈前方的5’-端脫氧核苷酸并切除之；3’→5’外切酶活性位點，用以結合和切除生長鏈上未配對的3’-端核苷酸。3DNA的復制與修復酶的功能a.聚合作用在引物的3’-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個聚合上核苷酸。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結合位點后，可能使酶的構象發(fā)生變化，促進3’-OH與5’-PO4結合生成磷酸二酯鍵。3DNA的復制與修復b.3’→5’外切酶活性（校對作用）3’→5’外切酶活性是從3’→5’方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。錯誤核苷酸進入polⅠ的結合位點不能與模板配對，無法改變酶的構象而被3’→5’外切酶活性位點所識別并切除。3DNA的復制與修復在T4噬菌體突變株中分離得到的T4DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性很低，使DNA復制的真實性降低，而易發(fā)生突變。具有抗突變能力的T4突變株中的DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復制真實性好，變異率低。3’→5’外切酶活性的主要功能是校對作用。維持了DNA復制真實性。3DNA的復制與修復c.5’→3’外切酶活性（切除修復作用）：5’→3’外切酶活性是從5’→3’方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈。它只作用具切口的雙螺旋DNA，并在切口以外的配對區(qū)切割。3DNA的復制與修復5’→3’外切酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用。對岡崎片段5’-末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性（每次能切除10nt）。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復DNApolⅠ聚合酶活性和5’→3’外切酶活性協(xié)同作用雙鏈DNA上的單鏈切口可激活DNApolⅠ的5’→3’外切酶活力，從切口的5’-端切除舊鏈，同時從切口開始合成新鏈，可使DNA鏈上切口向前推進，產(chǎn)生缺口平移(nicktranslation)，即沒有新DNA合成，只有核苷酸交換。3DNA的復制與修復缺口平移可從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣棣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈為帶有同位素標記的DNA分子，可以用作探針進行分子雜交實驗。3DNA的復制與修復DNAPolⅠ在空間結構上近似球體，直徑約6.5nm，在酶的縱軸上有一個約2nm的深溝(cleft)，帶有正電荷，是酶的活性中心位置。3DNA的復制與修復SomeDNApolymeraseshaveacommonstructure.3DNA的復制與修復DNApolⅠ不是大腸桿菌中DNA復制的主要酶。在一些突變株中，polⅠ的活力只是野生型的1%，但DNA復制卻正常，但突變株對輻射和化學誘變劑卻高度敏感。DNApolⅠ在DNA修復中起著重要的作用。1971年ThomasKornberg和MalcolmGefter發(fā)現(xiàn)DNApolⅡ和polⅢ3DNA的復制與修復②大腸桿菌DNApolⅡ1971年發(fā)現(xiàn)DNApolⅡ，MW為120KD，每個細胞內約有100個酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。聚合作用：polⅡ催化DNA的聚合，它最適模板是雙鏈DNA而中間有小空隙(gap，50~200nt)的單鏈DNA部份。3DNA的復制與修復polⅡ具有3’→5’外切酶活性，但無5’→3’外切酶活性。polⅡ基因缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復制正常。表明polⅡ不是DNA復制的主要酶，它可能在DNA損傷修復中起一定作用。3DNA的復制與修復③大腸桿菌DNApolⅢDNApolⅢ的發(fā)現(xiàn)1969年，Cairns發(fā)現(xiàn)E.coli的一種突變體的細胞抽提液，雖然反應顯示﹤1%的DNApolⅠ活力，但該突變體能以正常速率繁殖。突變體對紫外輻射和化學誘變十分敏感，表明可能存在另一種DNApol。3DNA的復制與修復磷酸纖維素柱層析PolⅠ的存在掩蓋了polⅢN-乙烷基馬來酰亞胺抑制PolⅢ野生型缺失DNApolⅠ突變株3DNA的復制與修復E.coli突變株3DNA的復制與修復DNApolⅢ至少以10種亞基組成復合物（DNA聚合酶全酶）參與DNA復制。3DNA的復制與修復a、

及

亞基構成核心聚合酶(corepolymerase)。a具有聚合酶活性；

有3’→5’核酸外切酶的活力。a和有相互增進活性的作用

亞基有促進

活性等的作用3DNA的復制與修復blueandgreen,polIIIcoreorangeandred,ε-subunit.3H-labeledsyntheticDNAε-subunit3DNA的復制與修復

構成聚合酶的卡箍(clamp)，結合在DNA模板鏈上。3DNA的復制與修復polⅢ全酶的結構是一種非對稱二聚體。polⅢ在細胞內數(shù)量少（每個E.coli中只有10~20個酶分子），但催化dNTP摻入DNA鏈的速率高達1000nt/s（體外約為700nt/s）。polⅢ具有聚合酶和3’→5’外切酶活性。3DNA的復制與修復DNApolⅢ是細胞內DNA復制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(nonpermissivetemperature)內是不能生長的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入polⅢ則可以恢復其合成DNA的能力。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3.2.1.6DNA連接酶(DNAligase)DNA在隨后鏈上的復制是不連續(xù)的，合成的DNA片段需要連接酶連接。DNA連接酶的主要功能是借助ATP或NAD水解提供的能量，催化雙鏈DNA上的單鏈斷點的5’-端與3’-端生成磷酸二酯鍵，封閉DNA雙鏈上的斷點。3DNA的復制與修復DNA連接酶的作用條件①被連接的兩鏈必須與另一鏈（模板鏈）互補；②兩鏈相鄰；③每次只能連接一個切口；④使一條鏈的5’-P與另一鏈的3’-OH形成磷酸二酯鍵。⑤連接需要能量（細菌DNA連接酶依賴NAD，真核DNA連接酶利用ATP）。⑥缺口缺失核苷酸不連接。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復連接酶作用機制①NAD+或ATP將其腺苷酰基轉移到DNA連接酶的1個Lys殘基的ε-NH2上。②酶-腺苷酸中間物上的腺苷?；D移到DNA的5’-磷酸基端。③被激活的5’-磷?；撕虳NA的3’-OH端生成磷酸二酯鍵。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復DNA連接酶催化的連接反應是可逆的。逆反應過程可在AMP存在時，使共價閉環(huán)超螺旋DNA產(chǎn)生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的閉環(huán)DNA。大腸桿菌的DNA連接酶(MW75KD)被胰蛋白酶水解形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD（不是ATP）反應形成酶-AMP中間物，但不能繼續(xù)將AMP轉移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。3DNA的復制與修復大腸桿菌細胞中約有300個分子的DNA連接酶。與DNA聚合酶Ⅰ的分子數(shù)相近。連接酶在DNA復制、修復和重組中起重要作用，連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA復制、修復和重組。3DNA的復制與修復在真核生物細胞中的DNA連接酶，分為連接酶Ⅰ和Ⅱ，反應中利用ATP所提供的能量。DNA連接酶Ⅰ分子量約為200KD，主要存在于生長旺盛細胞中，DNA連接Ⅱ分子量約85KD，主要存在于生長于不活躍的細胞中(restingcell)。3DNA的復制與修復在DNA復制過程中還有許多蛋白質參與，如大腸桿菌細胞中就有三十多種蛋白質參與DNA復制，許多蛋白質的功能目前尚不明了。DNA復制過程中還有許多未知的因子參與，DNA復制過程中許多具體的細節(jié)尚不十分清楚。3DNA的復制與修復T4Ligase特性①催化雙鏈DNA或RNA的5'-磷酸末端和3'-羥基末端形成磷酸二酯鍵。②催化平滑末端或粘性末端DNA之間的連接，還可修復雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切口。T4Ligase可作為重組工具酶。3DNA的復制與修復3.2.2原核生物DNA復制的引發(fā)盡管原核生物是較簡單的單細胞生物體，但其復制過程很復雜，并且是一個順序性過程，涉及到多種酶和蛋白因子，是這些酶和蛋白因子協(xié)同作用的結果。3DNA的復制與修復對E.coliDNA復制機制的認識是利用E.coli突變體和φx174的復制進行初步研究的結果。研究方法：①獲得突變體，對突變基因研究獲得其功能；②反義RNA基因工程；③點突變基因工程。3DNA的復制與修復大腸桿菌復制基因3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復利用噬菌體研究原核DNA復制噬菌體DNA有線型、環(huán)型、單鏈、雙鏈，其復制機制可表明各種形式的DNA復制模式；噬菌體利用寄主的基因產(chǎn)物進行復制，復制行為與寄主相似。3DNA的復制與修復φX174和G4的DNA為模式底物，可以鑒定E.coilDNA復制體系中的重要組分：可用遺傳和生化方法，分離復制缺陷突變體，再用野生型蛋白對突變體提取物進行功能互補。用生化方法，分離純化所有必需組分，體外重組裝復制系統(tǒng)。3DNA的復制與修復3.2.2.1M13噬菌體復制的引發(fā)M13基因組為6407nt的單鏈環(huán)狀DNA分子，在5480~5820nt間有5個發(fā)夾結構，其中第3個最重要，有59個nt，此雙鏈區(qū)是一個復制起始的信號。3DNA的復制與修復M13利用宿主細胞的RNApol在發(fā)夾結構前6nt開始合成引物RNA。對于RNApol如何識別這個發(fā)夾結構作為起始位點的還不清楚，可能還涉及其他一些蛋白質。當RNA鏈合成到20~30nt時形成的RNA-DNA雜交體使發(fā)夾結構破壞，將另一半發(fā)夾結構釋放出來。因此，SSB就結合到這段序列上。3DNA的復制與修復DNApolIII以RNA為引物合成DNA鏈直到RNA引物的開始處。引物被RnaseH/DNApolI切除并補齊因RNA切除后形成的空缺，切口再由連接酶連接起來。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復G4噬菌體(5577nt)的復制與M13的不同之處在于它不是由RNA聚合酶起始復制，G4是由引發(fā)酶直接結合到其DNA的發(fā)夾結構上，合成一段約29nt的RNA引物，互補于發(fā)夾結構一條鏈的RNA。DNA鏈在RNA3’-OH上延長，此后的反應和M13是相同的。3DNA的復制與修復A：引物合成時不加dNTP；B：引物合成后加入dNTP；C：起始反應時加入dNTP和NTP3DNA的復制與修復M13的復制能被RNA聚合酶的抑制劑——利福平所抑制，而G4和φX174的復制則不被利福平所抑制。3DNA的復制與修復3.2.2.2φx174的復制φX174的復制比M13和G4復雜，需要更多的蛋白質因子參與，形成一個類似大腸桿菌中的復制引發(fā)體，并且可能在幾個位點起始DNA的合成，可作為岡崎片段合成起始的范例。3DNA的復制與修復φx174的復制模式Φx174的DNA復制除模板外，復制系統(tǒng)均由寄主提供。Φx174（+）鏈（SS）

合成φx174（-）鏈，形成RFφx174（SS→RF）

RF繁殖（RF→RF）

新的φx174（+）鏈產(chǎn)生（RF→SS）3DNA的復制與修復

X174的(－)鏈合成(SS→RF)①

xl74的(+)鏈進入寄主細胞，除分子中的發(fā)夾結構外，其它部分被SSB覆蓋。(－)鏈合成(SS→RF)需引物體(primosome)參與。3DNA的復制與修復在基因F和G間的70nt片段是引物體組裝位點(primosomeassemblysite，pas)，pas形成44nt組成的發(fā)夾結構可被PriA識別，在PriB和PriC參與下形成復合物。3DNA的復制與修復②由PriA、PriB和PriC組成的復合物與DnaT、DnaB和DnaC組裝成預引物體(preprimosome)。其中DnaB和DnaC形成由ATP穩(wěn)定化的B6C6復合物。預引物體與引發(fā)酶（DnaG）結合成引物體。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復③引發(fā)體在pas位點上形成，但引物合成是在很多位點上，表明引發(fā)體可沿著單鏈DNA引發(fā)位點移動。當引物合成后，PriA水解ATP引起DnaB變構而降低與單鏈DNA的親和性，移動到另一個起始位點，ADP又被ATP取代，引發(fā)酶能穩(wěn)定DnaB·ATP·ssDNA復合物，開始另一個引發(fā)反應。引發(fā)體至少含DnaB、PriA和引發(fā)酶。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復PriA可識別pas位點，并且還具有水解ATP和置換SSB的活性，這對引發(fā)體移動到其它位點進行引發(fā)非常重要。M13和G4僅有一個引發(fā)點。3DNA的復制與修復④DNAPolⅢ全酶從引物延伸合成DNA片段。引發(fā)體移動的方向同DNA鏈延長方向相反，這說明雙鏈DNA復制時，隨從鏈合成岡崎片段的情形。當復制叉向前移動時，在引發(fā)體前方就形成單鏈，每一次引發(fā)反應以后，引發(fā)體就沿著單鏈向前移動到下一個岡崎片段合成開始的位點。因此，引發(fā)物移動的方向同復制叉相同，同隨從鏈DNA合成方向相反。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復⑤切除RNA引物填補缺口，連接DNA片段。形成的雙鏈DNA稱為RF。⑥引物體繼續(xù)與DNA相結合以備參與(+)鏈的合成。

xl74(－)鏈合成是不連續(xù)的。3DNA的復制與修復

X174的(+)鏈合成(RF→SS)(+)鏈合成涉及噬菌體編碼的gpA和大腸桿菌的Rep。gpA（60kD）對(+)鏈原點具有專一性的核酸內切酶活力。gpA的功能是引發(fā)復制起始。3DNA的復制與修復①gpA借引物體結合于識別位點，專一性切割4305和4306間的磷酸二酯鍵產(chǎn)生切口。gpA通過其酪氨酸殘基與4306位5’端結合，保存鏈能。②Rep蛋白結合于gpA處的(－)鏈。Rep蛋白從(+)鏈使gpA復合物從(+)鏈的5’端開始使雙鏈DNA解鏈，分離出的(+)鏈被SSB保護。3DNA的復制與修復③polⅢ全酶從(+)鏈3’端使DNA鏈不斷延伸，形成環(huán)化的滾環(huán)結構(loopedrollingstructure)。而原來的(+)鏈在復制叉移動時仍與gpA相連，如同逐步被剝離。3DNA的復制與修復④復制繞(－)鏈超過完整一周后產(chǎn)生1個雙股復制原點，gpA在此再做專一切割，再與新形成的5’端共價結合，gpA的第2次切割產(chǎn)生單位長度的

X174DNA，它的3’-OH向gpA5’-P做親核攻擊形成環(huán)狀分子（+鏈）。3DNA的復制與修復每個gpA分子含2個活性酪氨酸，故可完成相繼地切割，并與5’-端相連。3DNA的復制與修復在由

x174感染的中期，每個新合成的(+)鏈指導(－)鏈合成從而形成RF。在感染的后期，新合成的(+)鏈通過噬菌體編碼的病毒成熟蛋白和衣殼蛋白(gpB、E、D、F、G和H)形成新的病毒粒子。3DNA的復制與修復φx174（-）鏈合成為隨后鏈復制模式?？捎糜谘芯縀.coli隨后鏈的合成機制，不連續(xù)合成。φx174（+）鏈合成為主導鏈復制模式?？捎糜谘芯縀.coli主導鏈的合成機制。連續(xù)合成。3DNA的復制與修復大腸桿菌基因組是雙股環(huán)形DNA，其復制是由單一原點（origin）開始的

式復制。origin處形成復制叉，經(jīng)過先導鏈的連續(xù)復制和滯后鏈的不連續(xù)復制，到達終點完成復制。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3.2.2.3E.coliDNA復制的引發(fā)E.coli的DNA復制起始指從origin（原點）開始的起始過程，這一過程不同于隨后鏈上岡崎片段的起始。DNA復制的引發(fā)包括：起始識別→解鏈→解旋→引發(fā)體組裝。3DNA的復制與修復復制原點（origin)DNA復制不是隨機的從DNA分子上的任何一點起始，而是從特定的區(qū)域開始。大腸桿菌的復制起始點(oriC)位于其基因組天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操縱子間。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復最小的oriC包含245bp（方括號內）3DNA的復制與修復ori的特性復制起點幾乎都是富含A-T的序列；已經(jīng)分離出大腸桿菌染色體DNA復制起點oriC。由245bp的DNA片段組成。3DNA的復制與修復oriC含有2個系列的重復單位，其中有3個13bp重復序列和4個9bp重復序列，均富含AT。富含AT、回文序列3DNA的復制與修復Ori在細菌復制起始位點中都是保守的很多細菌的ori區(qū)在結構上相似，序列上有相當?shù)谋Ｊ匦?，且在分類關系上愈接近的細菌間其同源性愈高。腸桿菌3DNA的復制與修復將一個復制起點連接到任一DNA上，都能支持其復制。9bp（A位點）為DnaA蛋白識別位點。3DNA的復制與修復引發(fā)體的形成復制開始的是形成引發(fā)體，這需要很多蛋白因子的參與。3DNA的復制與修復①足跡法證明DnaA蛋白識別起始序列并結合于oriC的9bp重復序列，形成oriC負超螺旋包裹在外，2~4個DnaA蛋白在內的復合物。3DNA的復制與修復引發(fā)復合物和復制泡的形成3DNA的復制與修復②HU蛋白參與并促進DnaA蛋白識別3個13bp串聯(lián)重復序列使DNA熔鏈形成開放復合物。用核酸酶P1（作用ssDNA）證明解鏈部分約為45bp。3DNA的復制與修復③DnaB和DnaC（引發(fā)體成員）蛋白進入解鏈區(qū)形成前引物復合體，DnaC可推動解旋酶DnaB與DNA的結合。3DNA的復制與修復④SSB結合在被解開的單鏈上，由DnaA、HU、DnaC、DnaB和拓撲異構酶等組成引發(fā)前體(preprimosome)。3DNA的復制與修復⑤引發(fā)前體進一步與引發(fā)酶(DnaG，primase)組裝成引發(fā)體(primosome)。3DNA的復制與修復⑥在SSB和旋轉酶（拓撲異構酶）的參與下，引發(fā)體可在單鏈DNA上移動，在DnaB亞基的作用下識別DNA復制起點位置。引發(fā)體先在前導鏈上由引發(fā)酶催化合成RNA引物，此過程稱為轉錄激活(transcriptionalactivation)。3DNA的復制與修復⑦DNApolⅢ組裝和復制叉上二聚體形成。3DNA的復制與修復⑧引發(fā)體在滯后鏈上沿5’→3’方向相對移動，并在模板鏈上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成滯后鏈的引物RNA，供DNA聚合酶Ⅲ合成岡崎片段使用。在RNA引物3’端DNA開始聚合。3DNA的復制與修復許多因子協(xié)同作用才使引發(fā)體在滯后鏈上移動，識別合適的引物合成位置，并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成RNA引物。在同一種生物體細胞中這些引物都具有相似的序列，表明引發(fā)酶要在DNA滯后鏈模板上比較特定的位置（序列）上才能合成RNA引物。3DNA的復制與修復E.coli的RNA引物通常10~12nt，序列以pppAG開始，對應于模板3’-GTC-5’a-d,beforeDNasedigestione-h,afterdigestionaande,RNaseHfpolIcandg,RNaseHpolIdandh,wild-type3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復RNA引物形成后，DNApolⅢ的亞基組裝成非對稱DNA聚合酶Ⅲ二聚體，它催化將第一個脫氧核苷酸按堿基互補原則加在RNA引物3'-OH端而進入DNA鏈的延伸階段。3DNA的復制與修復3.2.3DNA鏈的延伸3.2.3.1正超螺旋的消除解旋酶在復制叉處邊移動邊解開雙鏈，DNA聚合酶Ⅲ催化DNA新生鏈的合成。DNA解鏈時必產(chǎn)生正超螺旋，當達到一定程度后就會造成復制叉難以繼續(xù)前進而終止DNA復制。而細胞內DNA復制不會因出現(xiàn)拓撲學問題而停止。3DNA的復制與修復解除正超螺旋的機制①DNA在生物細胞中本身就是負超螺旋，當DNA解鏈而產(chǎn)生正超螺旋時，可以被原來存在的負超螺旋所中和。②DNA拓撲異構酶Ⅰ可打開一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉變成松弛狀態(tài)；同時DNA拓撲異構酶Ⅱ(旋轉酶)也可以在復制叉前方將負超螺旋引入雙鏈DNA。3DNA的復制與修復3.2.3.2復制體(replisome)的形成DNA復制體是在復制叉附近，由DNApolⅢ二聚體、引發(fā)體和DnaB等構成的類似核糖體大小的復合體。復制體在DNA前導鏈模板和滯后鏈模板上移動時便合成了連續(xù)的DNA前導鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈。不同系統(tǒng)（噬菌體、E.coli、動物、植物病毒）中的復制體組分雖有差異，但功能相似。3DNA的復制與修復復制體包括Ori的復制體（主導鏈和隨從鏈的是否相同）和復制起始后延伸過程的復制體兩種。延伸過程的復制體為非對稱的DNApolⅢ二聚體、DnaB、隨從鏈上的SSB和引發(fā)體等組成。3DNA的復制與修復3.2.3.3DNA鏈的延伸前導鏈和滯后鏈由同一polⅢ二聚體延伸。前導鏈的合成：由DnaG（primase）在復制起始位點附近合成1個RNA引物，然后由polⅢ把dNTP加到該引物上。3DNA的復制與修復滯后鏈的合成：產(chǎn)生Okazakifragments，消除RNA引物并由DNApol補上一小段DNA序列，由DNAligase把兩個片段相連。3DNA的復制與修復DNA滯后鏈與主導鏈合成的不同步。在DNA復制叉處由一個非對稱DNApolⅢ二聚體，同時分別進行復制DNA前導鏈和滯后鏈。3DNA的復制與修復當滯后鏈模板穿過全酶時，DNA合成就從RNA引物的3′端開始并逐步延伸，直至抵達另一個已合成的岡崎片段。這時環(huán)就松開，隨著先導鏈上DNA合成的繼續(xù)，新的滯后鏈模板又出現(xiàn)，它繼而回折成環(huán)并合成新的岡崎片段。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復通過電鏡對T4和T7噬菌體復制時觀察到的復制環(huán)。3DNA的復制與修復2008年，SamirM.Hamdan等實驗證明，當先導鏈上DNA開始合成以及復制叉向前移動時，位于滯后連的引發(fā)體，在合成引物后，滯后鏈的模板即繞聚合酶回折成環(huán)。并與聚合酶的另一個活性中心按先導鏈的走向聚合。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復

3DNA的復制與修復這樣，DNA的兩股鏈就通過聚合酶Ⅲ全酶共同被合成。由于在復制叉上，一套酶可以同時在兩條鏈上進行復制，所以先導鏈和滯后鏈的合成速度不會相差很多。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復當岡崎片段形成后，RnaseH/DNApolⅠ切除岡崎片段上的RNA引物；同時，利用后一個岡崎片段作為引物合成DNA。3DNA的復制與修復最后的單鏈斷點由DNAligase連接形成完整的滯后鏈。3DNA的復制與修復3.2.4DNA復制的終止3.2.4.1E.coliDNA復制的終點在DNA上存在著復制終止位點，復制叉在此位點相遇（forksmeet）。E.coli的DNA復制終點分別是一些22bp的短序列，TerA到TerF。3DNA的復制與修復終止位點的序列可被Tus蛋白（tus基因編碼，forterminusutilizationsubstance）識別，并結合于其上，它使復制叉在完成整個DNA復制前停頓在此。3DNA的復制與修復E.coli兩個復制叉分別由3個終止位點操控，TerE、TerD和TerA終止反時針方向復制叉；TerF、TerB和TerC終止順時針方向復制叉。3DNA的復制與修復當兩個復制叉同時到達終止區(qū)域后DNA復制終止，其間大約有50~100bp的DNA未被復制，復制停頓的DNA開始解鏈，進一步修復缺口，后形成兩個連鎖的子代DNA，在拓撲異構酶Ⅳ作用下解連鎖。3DNA的復制與修復大腸桿菌DNA復制起始的調控與DnaA對甲基化位點的識別密切相關。3DNA的復制與修復大腸桿菌在一個細胞周期中可能發(fā)動2次DNA復制。3DNA的復制與修復3.2.4.2DNA復制后的末端問題DNA復制時，當RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充。而線性DNA分子以5’→3’為模板的滯后鏈的合成，末端的RNA引物被切除后是無法被DNA聚合酶所填充的。3DNA的復制與修復①T7DNA復制方式T7DNA兩端的DNA序列區(qū)有160bp長的序列完全相同。T7DNA復制時，產(chǎn)生的兩個子代DNA的3’-端尾巴以互補結合。再由DNApolⅠ填充和DNA連接酶連接后，形成2個單位長度的T7-DNA分子。3DNA的復制與修復這樣復制下去，便可形成多個單位長度的T7DNA分子。這樣的T7DNA分子可被特異的內切酶切開，用DNApolⅠ填充，形成與親代DNA完全一樣的雙鏈T7DNA分子。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復②腺病毒(Adenovirus)DNA復制3DNA的復制與修復腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，基因組長35973bp，兩端各有反向重復序列103－162bp，兩末端各有50bp為復制起點。腺病毒的基因組以線性的雙鏈DNA形式存在，由蛋白VII和一種mu的小蛋白緊密地環(huán)繞在其周圍，起到類組蛋白樣的作用。蛋白V將這種DNA-蛋白復合物連接起來，并通過蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復在兩條鏈的5’端各以共價鍵結合著一個DNA末端蛋白（TP）復合物（DNA-TPC）的特化的結構，與腺病毒復制密切相關。腺病毒基因組的兩端各有一段的反向末端重復序列（ITR），是復制的起始位點。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復在腺病毒的成熟病毒DNA分子5’端共價連接一個55kD的蛋白。在腺病毒DNA復制鏈上的蛋白是80kD，稱為末端蛋白（Terminalprotein，TP）它比附著在成熟DNA上的要大。這種80kD蛋白實際上是起始復制的特異蛋白，但在成熟的病毒中，它被切成較小的蛋白保留在病毒中。3DNA的復制與修復腺病毒本身編碼一個80kD的蛋白，該蛋白和DNA聚合酶形成復合物。80kD蛋白末端絲氨酸＋dCTP→形成Protein-dCMP-OH其游離的3’-OH為DNApol延伸反應提供引物。而在模板的5’末端有一分子量55kD的末端蛋白供80kDa蛋白識別，按CG堿基配對。3DNA的復制與修復腺病毒感染細胞的過程：腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細胞表面的特異性受體，病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD與細胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結合，通過內吞作用將腺病毒內化到細胞中并進入溶酶體。在溶酶體中腺病毒衣殼的構象發(fā)生變化，從溶酶體中釋放出來。腺病毒顆粒轉位到細胞核，通過核孔將DNA釋放到細胞核內。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復病毒基因組進入細胞核，進行轉錄并啟動病毒基因組的復制。腺病毒雙鏈DNA的每條單鏈的5’端有TP蛋白結合，TP通過其Ser-OH與DNA5’端的dCMP5’磷酸間形成磷酸二酯鍵。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復腺病毒的DNA復制首先是以5’端結合有TP的dCMP作為引物，以3’端的末端反向重復序列為模板，進行鏈置換合成，置換出的單鏈分子可以自我退火環(huán)化，形成鍋柄樣環(huán)形分子，然后這種環(huán)形分子再以相同的機制合成出子代雙鏈DNA分子。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復環(huán)狀DNA的復制的末端終止階段則不存在問題。環(huán)狀DNA復制到最后，由DNA拓撲異構酶Ⅱ切開雙鏈DNA，將兩個DNA分子分開成為兩個完整的與親代DNA分子一樣的子代DNA。3DNA的復制與修復3.2.5DNA復制的保真機制在長期的進化中，DNA復制過程形成了一系列保真機制，保證復制準確和遺傳穩(wěn)定。E.coli每復制109~1010nt便出現(xiàn)1個誤差。由于E.coliDNA有4.5×106bp，這樣每1000個細胞經(jīng)過1次分裂會產(chǎn)生1個錯誤核苷酸。3DNA的復制與修復①堿基配對原則單純以堿基配對原則維持DNA復制準確性時，誤差出現(xiàn)頻率約為10-5。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復②DNA聚合酶的校對作用當新合成DNA中含錯配核苷酸時，DNApol的3’→5’外切酶激活，切除錯配核苷酸，重新聚合上正確的核苷酸。每個核苷酸的摻入有兩次被選擇機會，按堿基配對原則，錯誤核苷酸摻入機率約為10-5，DNA聚合酶本身的校對作用又可使錯誤核苷酸摻入的機率約為10-5。這樣每摻入一個核苷酸，發(fā)生錯誤的機會只有10-10。3DNA的復制與修復③RNA引物起始復制可減少復制錯誤DNA合成起始時及岡崎片段合成開始時都先合成一段未經(jīng)校對的RNA引物，RNA最終被切除可提高DNA復制的準確性。④修復系統(tǒng)有多種機制和酶。3DNA的復制與修復3.3真核生物的DNA復制3.3.1研究真核生物DNA復制機制的選材一般選用結構簡單的真核生物如：酵母、四膜蟲以及真核病毒為材料。真核病毒DNA復制機制與真核染色體DNA復制相同，如SV40。3DNA的復制與修復3.3.2真核生物的復制子復制時期在S期。3DNA的復制與修復①多復制起點真核和原核生物DNA復制的基本特征是相同的，但真核DNA比遠比原核DNA大，且大多數(shù)真核生物是由多細胞組成的，因此在DNA復制上有所不同。3DNA的復制與修復3DNA的復制與修復真核生物的每一個染色體皆含有許多個復制子(replicon)，復制叉的移動速度大約只有50bp/Sec。可能原因是真核生物的DNA與組蛋白構成核小體，對復制叉的前進造成阻礙。果蠅的復制整個基因體僅需3~4min。人類DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個復制起始位點，復制整個基因體需8h。3DNA的復制與修復②復制原點的特征接頭掃描突變3DNA的復制與修復酵母菌的復制起點稱為ARS(autonomouslyreplicatingsequence)，有100多個bp。ARS由2個功能域組成：A功能域為ARS的中心，可能是起始蛋白的結合位點。A的序列為15bp，其中11bp為保守序列：(T/A)AAATA(T/C)AAA(T/A)；3DNA的復制與修復啤酒酵母的ARS分布在100～200bp的DNA序列中，ARS包括一個共有序列(A)和附加元件(B1~B3)。A元件在芽殖酵母中高度保守，是復制起始所必需的。其中有富含AT的11bp序列是復制起始識別復合物（originrecognitioncomplex,ORC）結合復制起始位點所必需的，對起始因子在復制起始位點的組裝起基本作用。3DNA的復制與修復B1元件緊靠A元件，也是ORC的識別序列。B2元件的功能還不清楚，可能參與雙鏈DNA的解旋。B3元件是轉錄因子Abf1的結合位點，可促進DNA復制的起始。B功能域富含AT，可能是DNA熔鏈區(qū)。A元件決定哪一段DNA序列作為復制起始位點，B元件可以增加復制起始位點的效率。3DNA的復制與修復不同生物復制起始位點的共同特征多個短重復序列。重復序列被多亞基的復制起始位點結合蛋白識別，這些蛋白對于復制酶在復制起始位點的組裝起關鍵作用。復制起始位點附近一般都有富含AT的序列，以利于DNA雙鏈的解旋，產(chǎn)生DNA復制模板。3DNA的復制與修復ARS序列突變對復制有影響。真核生物Saccharomycescerevisiae有274個自主性復制序列（ARS）分布于16條染色體中。每一個復制子長約36kb。3DNA的復制與修復多細胞生物的復制起始位點有多個，在基因組中的分布也不是隨機的。在基因組復制過程中只有一些復制起始位點起作用，這可能與染色體結構、基因轉錄、生物發(fā)育過程和DNA甲基化等因素有關。例如在動物的發(fā)育過程中，細胞周期的S期在胚胎期可以只有幾分鐘，而在成熟組織中可以長達幾個小時。DNA復制在S期的及時完成主要取決于有效復制起始位點的增加，而不是復制叉移動速度的增加。3DNA的復制與修復復制起始位點可以決定基因組在S期復制的時間