MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座

多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（MLVA）分型技術(shù)和操作步驟

李偉中國(guó)CDC傳染病所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室PulseNetChina第一期培訓(xùn)-06-19

1MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第1頁(yè)病原菌分子分型目標(biāo)長(zhǎng)久研究病原菌遺傳進(jìn)化病原菌適應(yīng)來(lái)自宿主高選擇性壓力因點(diǎn)突變、重組（包含基因轉(zhuǎn)移）等遺傳變異

短期研究了解病原菌適應(yīng)性感染溯源2MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第2頁(yè)分子分型方法序列或分類資料為基礎(chǔ)等位基因：多位點(diǎn)序列分析（multilocussequencetyping，MLST）多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（Multiple-LocusVariable-numbertandem-repeatAnalysis,MLVA）

圖像分析：脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）核糖體分型（ribotyping）等3MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第3頁(yè)MLST

結(jié)果無(wú)偏性u(píng)nambiguousresults有對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)支持internationaldatabases區(qū)分度低，Lowdiscriminationpower高花費(fèi)，highcost:sequencing不適合常規(guī)檢測(cè)和暴發(fā)調(diào)查，unsuitableforroutinesurveillanceandepidemiologicalstudies4MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第4頁(yè)VNTRVNTR：可變數(shù)目出那里重復(fù)序列，VariableNumberofTandemRepeats

AACTTTACGTTCAAATTAACGTTCAAATTAACGTTCAAATTTACCTTG

側(cè)翼序列重復(fù)單元5MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第5頁(yè)18bp*3AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGCTGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGAVNTR產(chǎn)生原因：聚合酶滑鏈復(fù)制6MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第6頁(yè)

100bp200bp

300bpGelmigrationStrainCDC1551:5x15bpStrainH37Rv:4x15bpstrainCDC1551:230bpstrainH37Rv:215bp230bp215bp200bpPCRprimers:CTCCCACACCCAGGACAC

CGGCCTACCCAACATTCCPCR215bp230bp

TRF軟件（TandemRepeatsFindersoftware），://minisatellites.u-psud.fr/VNTR位點(diǎn)確實(shí)定測(cè)序分析7MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第7頁(yè)VNTR和等位基因atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgatPrimer-F上游序列VNTR重復(fù)下游序列重復(fù)拷貝數(shù)=擴(kuò)增大小-上下游序列重復(fù)單元大小Primer-R取整：就近取整或去除小數(shù)取整8MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第8頁(yè)串聯(lián)重復(fù)序列可變重復(fù)數(shù)目標(biāo)判定9MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第9頁(yè)MLVA方法多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)：VNTR：MLVA方法：即VNTR數(shù)組比如：MLVA1型735266210233136ST1++-MLVA1型別菌株血清型TR1TR2TR3TR4TR5TR6TR7TR8TR9MLST其它特征MLVA1410461531.719123026ST81---10MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第10頁(yè)分析軟件：BioNumerics

命名MLVA型：MT1-MT85評(píng)價(jià)各位點(diǎn)分辨力：Nei’sindex=1-Σ(allelefrequency)2

評(píng)價(jià)MLVA方法分辨力：

Simpson'sindex=1-Σ[nj(nj-1)]/[N(N-1)]聚類分析構(gòu)建最小生成樹(shù)11MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第11頁(yè)MLVA試驗(yàn)操作一、模板制備：DNA提取模板或水煮模板二、PCR擴(kuò)增多重PCR反應(yīng)三、擴(kuò)增條帶大小判斷：（一）毛細(xì)管電泳：1.引物標(biāo)識(shí)2.各種不一樣熒光染料標(biāo)識(shí)上游引物（FAM、HEX和TAMRA）3.ABI3730系統(tǒng)進(jìn)行分析，用內(nèi)標(biāo)（ABI自帶）（二）普通電泳分析（三）測(cè)序分析12MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第12頁(yè)MLVA試驗(yàn)步驟-PCR2個(gè)PCR體系/多重PCR體系：體系（20ul）指標(biāo)BufferdNTP上下游引物10uM（個(gè)ul）酶模板ulTm延伸時(shí)間循環(huán)數(shù)片段大小判斷方式A1TR2-FAM2.01.50.20.3u0.756℃40秒30毛細(xì)管電泳TR4-HEX0.3A2TR1-FAM2.01.50.20.3u0.757℃40秒30毛細(xì)管電泳TR3-HEX0.3模板制備：DNA提取模板

水煮模板13MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第13頁(yè)擴(kuò)增條帶大小判斷：

（一）毛細(xì)管電泳：1.引物標(biāo)識(shí)2.各種不一樣熒光染料標(biāo)識(shí)上游引物（FAM、HEX和TAMRA）3.ABI3730系統(tǒng)進(jìn)行分析，用內(nèi)標(biāo)（ABI自帶）（二）普通電泳分析（三）測(cè)序分析14MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第14頁(yè)用500liz內(nèi)標(biāo)標(biāo)定擴(kuò)增片段大小用genemap軟件分析毛細(xì)管電泳圖用毛細(xì)管電泳來(lái)判斷片段大小15MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第15頁(yè)MLVA聚類分析Bionumerics軟件（version4.64）效用均等分類資料分析方法（

UPGMA）(unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages)

等分權(quán)重分類圖/最小生成樹(shù)形式展現(xiàn)多態(tài)性指數(shù)：Simpson’sindex

16MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第16頁(yè)MLVA方法應(yīng)用Neisseriameningitidis(23)

Streptococcuspneumoniae(20),Streptococcusuberis(12),

SalmonellaEnteritidis(10),

Salmonellaenterica(5,35),

Listeriamonocytogenes(28,29,39),

Legionellapneumophila(33),Clostridiumperfringens(37),Leptospirainterrogan(38,38),

EscherichiacoliO157:H7(30,46),

Clostridiumdifficile(43),Burkholderiapseudomallei(42),

Pseudomonasaeruginosa(32),Shigellaspp(13)et.al..

17MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第17頁(yè)分型方法評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

區(qū)分度(discriminatorypower)數(shù)字化數(shù)據(jù)庫(kù)適合試驗(yàn)室間比對(duì)（comparebetweenlaboratories）重復(fù)性（Reproducible）流行病學(xué)相關(guān)性（epidemiologicalconcordance）

方便快速（convenienceandrapidity）穩(wěn)定性（stability）輕易解釋（easytointerpret）花費(fèi)技術(shù)難度18MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第18頁(yè)MLVA方法好處上述優(yōu)點(diǎn)含有彈性flexibility.不需要參考菌株作為參考19MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第19頁(yè)第二部分發(fā)展一個(gè)新MLVA方法20MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第20頁(yè)基于序列比較初篩多態(tài)性VNTR位點(diǎn)PCR判定和篩選核酸測(cè)序確定重復(fù)模式區(qū)分效能評(píng)價(jià)系統(tǒng)測(cè)試篩選多態(tài)性VNTR得分大于70，拷貝數(shù)大于3，同源性大于75%

選擇出114位點(diǎn)現(xiàn)實(shí)模板擴(kuò)篩選

33血清型和21個(gè)豬鏈球菌2型

36個(gè)電泳行為不一樣確認(rèn)重復(fù)序列和重復(fù)單元數(shù)14個(gè)確定指標(biāo)9個(gè)指標(biāo)MLVA策略21MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第21頁(yè)TRF軟件（TandemRepeatsFindersoftware）://minisatellites.u-psud.fr/串聯(lián)重復(fù)判定匹配賦2分不匹配-3分堿基缺失-5分最小匯報(bào)分值50分以豬鏈球菌為例：判定了750,749,790,784測(cè)序菌株基因組串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)比較菌株名稱血清型起源ST型GZ12(CP000837)ST1P1/72(www.sanger.ac.uk)ST105ZYH332(NC_009442)ST798HAH122(NC_009443)ST7SC842ST722MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第22頁(yè)串聯(lián)重復(fù)判定23MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第23頁(yè)串聯(lián)重復(fù)判定IndicesPeriod

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NumberConsensus

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IndelsScoreACGTEntropy

(0-2)1858865--1858900123.0127005236533251.791862974--1863158463.946784228222312401.891867321--1867363162.61670752252513341.9324MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第24頁(yè)串聯(lián)重復(fù)判定25MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第25頁(yè)26MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第26頁(yè)insertedasmallsegment

泳道1234567891011121314菌號(hào)SC22NJ2598029801GZ189-1591P1/7R735ATCC4376511611HASS-73SC061001SC0623806GZ115161718192021222324LN1GX2CQ1GZ2SC17SC8443800324380026RC4716Gx40727MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第27頁(yè)28MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第28頁(yè)各種重復(fù)模式IndicesPeriod

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IndelsScoreACGTEntropy

(0-2)217182--217298244.524611896271635211.94217182--217291158.114571877271735201.94217221--217313392.439941171251634231.95217185--217309129.712581487271634211.95TR229MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第29頁(yè)第三部分MLVA方法在豬鏈球菌分型中應(yīng)用30MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第30頁(yè)豬鏈球菌暴發(fā)疫情年-四川人感染豬鏈球菌暴發(fā)疫情215人感染、39人死亡涉及四川36個(gè)縣202個(gè)村莊

重慶，貴州，廣東，江西也發(fā)覺(jué)病例江蘇1998暴發(fā)疫情25感染/14死亡Yu,H.,H.Jing,Z.Chen,etal..HumanStreptococcussuisoutbreak,四川,China.Emerg.Infect.Dis.12:914-92031MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第31頁(yè)中國(guó)豬鏈球菌PFGE型別SmaI酶切：ST7型分為單一PFGE-01型，年和年中國(guó)ST7菌株：PFGE-01型Ye,etal..Emerg.Infect.Dis.32MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第32頁(yè)codeLocus§LocationinGZ1MatchesInGZ1%TandemrepeatsequenceTm℃Simpson’sindex%?TR1SSTR135_111bp_445_3u135784..13622864CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTTATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA604.7TR2SSTR218_39bp_210_2.7u218682..21889194AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG588.2TR3SSTR1675_102bp_287_2u1675611..167589788CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG605.9TR4SSTR1260_90bp_928_7u1259913..26084084ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGAAAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA558.3TR5SSTR69_49bp_352_2u69283..6963489AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT605.9TR6SSTR928_30bp_172_2u927971..928142100CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT607.0TR7SSTR127_10bp_134_4u127866..12799996AAAATATAGA587.1TR8SSTR260_231bp_677_2u260573..26124980CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAAGAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAAAAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGACTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA5522.7TR9SSTR709_5bp_354_38u709802..710155100GAGCA5896.1豬鏈球菌MLVA指標(biāo)和特征上游引物標(biāo)識(shí)：FAM/HEX/TAMRA.多重PCRsM1和M2用毛細(xì)管電泳M3用普通電泳法TR1~8低或中等變異度指標(biāo)TR9高變異度指標(biāo)(value0.96).

33MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第33頁(yè)指標(biāo)等位基因型34MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第34頁(yè)166株豬鏈球菌血清2型MLVA分型

35MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第35頁(yè)36MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第36頁(yè)37MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第37頁(yè)年江西豬鏈疫情分析冷庫(kù)搬運(yùn)工：JX1冷庫(kù)豬肉：Jxs1，Jxs2，Jxs3共同型別MLVA31.江西病豬起源于江蘇1998年三株江蘇菌株和年江蘇菌株也為MLVA31型。38MLVA分型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟專家講座第38頁(yè)輸入性人感染豬鏈球菌分析

年4月，泰國(guó)籍。我們?cè)囼?yàn)室判定，分離菌株（W2886）血清2型，ST1型。TR1TR2TR3TR4