細(xì)胞外組蛋白介導(dǎo)RAW264.7分泌TNF-α的機(jī)制及α-硫辛酸拮抗作用

細(xì)胞外組蛋白介導(dǎo)RAW264.7分泌TNF-α的機(jī)制及α-硫辛酸拮抗作用摘要：失控的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致膿毒癥患者器官損傷、衰竭的重要因素。細(xì)胞外組蛋白參與了膿毒癥的炎癥過程，但其機(jī)制尚不完全清楚。本研究主要探索組蛋白刺激巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的信號通路，以及α-硫辛酸（ALA）對組蛋白介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的拮抗作用和機(jī)制。方法：采用ELISA和westernblot方法分別檢測TNF-α和信號蛋白的磷酸化。應(yīng)用不同濃度細(xì)胞外組蛋白（0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml）同RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)12h。觀察組蛋白刺激對對TNF-a分泌以及MAPKs和NF-κB信號通路活化的影響。應(yīng)用SB203580、PD98059、PDTC分別抑制p38、ERK和NF-KB，觀察信號通路抑制對組蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響。此外，以α-硫辛酸（ALA）預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h后加入組蛋白,觀察ALA對組蛋白刺激Raw264.7細(xì)胞分泌TNF-α以及MAPKs和NF-κB通路活化的影響。結(jié)果：組蛋白可以顯著促進(jìn)TNF-α分泌，并且這種效應(yīng)具有濃度依賴性。此外，組蛋白還可以促進(jìn)信號蛋白p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化。ALA可以顯著抑制組蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-a以及介導(dǎo)信號蛋白p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化。結(jié)論：以上研究結(jié)果顯示細(xì)胞外組蛋白可以通過MAPKs和NF-κB通路介導(dǎo)TNF-α分泌，而ALA具有良好的拮抗作用，MAPKs和NF-κB通路是ALA抗炎的重要作用靶點。關(guān)鍵詞：細(xì)胞外組蛋白；α-硫辛酸；RAW264.7；腫瘤壞死因子膿毒癥是機(jī)體對于感染的失控反應(yīng)所導(dǎo)致可以威脅生命的器官衰竭。過度的炎癥反應(yīng)是膿毒癥以及后續(xù)的多器官功能障礙綜合征（MODS）最重要發(fā)生機(jī)制之一ADDINNE.Ref.{56E23F5E-8DA6-4FA4-AECC-5FB06C1E9FBD}[1]。細(xì)胞外組蛋白可通過誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放和損傷線粒體來導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，細(xì)胞凋亡和器官衰竭ADDINNE.Ref.{309996B5-C260-4961-9C7B-E7ED72CF3692}[2,3]。所以它被認(rèn)為是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要介質(zhì)ADDINNE.Ref.{EF253369-4620-45EC-9A02-71CE129A1722}[4]。近年來，研究證實α-硫辛酸（ALA）具有抗炎作用ADDINNE.Ref.{1B0D80A7-D5A6-4228-9068-F221D9FAEDB8}[5,6]。本研究通過使用RAW264.7細(xì)胞系來探究組蛋白介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制以及ALA對其的抗炎作用。1材料與方法1.1材料DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；α-硫辛酸、細(xì)胞外組蛋白、ERK抑制劑（PD98059)、NF-κB抑制劑（PDTC），p38抑制劑（SB203580）(美國sigma公司)；胎牛血清(FBS)(Gibco)和TNF-α試劑盒（上海依科塞公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、兔抗人p38、p-p38、ERK、PERK、NF-KBp-p65抗體、NF-KBp65抗體（CST公司）。1.2細(xì)胞株小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7（ATCC細(xì)胞庫）。1.2.1Raw264.7細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代用含10％的胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM。置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，細(xì)胞增殖至70％～80％匯合后進(jìn)行傳代，1～2d換液一次，4～6d傳代一次。1.2.2ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-α的分泌將RAW264.7細(xì)胞用0.25%胰酶消化，以1x106個/ml接種于六孔板內(nèi)。于第二天，用不同濃度組蛋白（0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml）刺激細(xì)胞，置5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞上清液,以及用組蛋白（50μg/ml)刺激細(xì)胞并在不同時間（4h、6h、12h、16h)收集上清液。為了阻斷ERK、p38、NF-κB通路以及明確ALA的作用，分別用ERK抑制劑、p38抑制劑、NF-κB抑制劑和ALA預(yù)處理1h后，再用組蛋白(50ug/ml)刺激細(xì)胞,置5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞上清液。ELISA檢測試劑盒測定TNF-α(采用雙抗體夾心ELISA法)。1.2.3Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)將不同條件下處理好的細(xì)胞，用冷的PBS洗2遍，加入150μlRIPA細(xì)胞裂解液并立即放在冰上裂解30min,用細(xì)胞刮快速刮下，轉(zhuǎn)移到離心管中，在4℃，14000r／min,離心10min，取上清。加入5×SDS上樣稀釋液，煮沸10min，將待檢測蛋白在10％的聚丙烯酰胺凝膠中電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5％胎牛血清蛋白或者脫脂奶粉中封閉，然后加入1:2000的第一抗體，4℃冰箱封閉過夜。第二天用TBST洗3遍，每遍15min后再分別加人l:8000的第二抗體。室溫孵育1h，ECL顯影。將曝光后的膠片，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。用QuantityOne圖像分析軟件進(jìn)行灰度值（即吸光度）分析。將各部分的灰度值與各總蛋白條帶灰度值的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。1.2.4MTT法檢測細(xì)胞增殖情況用MTT法檢測ALA對Raw264.7的細(xì)胞增殖作用。將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×109個／L，將1×104個細(xì)胞鋪于96孔板內(nèi)，置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于第二天用不同濃度ALA（0，10和25mg/L)刺激RAW264.7,共培養(yǎng)14h后，PBS洗兩遍，每孔加入MTT（5g/L)10μl,避光培養(yǎng)4h,棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL。震蕩10min，490nm波長處測定每孔吸光度值。3統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（`X±S）表示，采用單因素方差分析（one-wayANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni’s檢驗，P值小于0.05被認(rèn)為有意義。2結(jié)果2.1組蛋白誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的TNF-α分泌用組蛋白0μg/ml（正常對照組）、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml刺激RAW264.7細(xì)胞，用ELISA方法檢測其TNF-α分泌水平，發(fā)現(xiàn)組蛋白介導(dǎo)的TNF-α分泌有濃度依賴性(269.19±124.07,1757.38±421.63,2132.69±578.54,2780.87±1032.61,*P<0.05,**p<0.001)(表1）。表1不同濃度組蛋白對RAW264.7分泌TNF-α的影響Table1TheeffectofdifferentconcentrationofhistoneonthereleaseofTNF-αfromRAW264.7（`X±SD，n=3）細(xì)胞分組NTNF-α（pg/ml)正常對照組3269.19±124.08組蛋白10μg/ml31757.39±421.63*組蛋白25μg/ml32132.70±578.54*組蛋白50μg/ml32780.87±1023.61**Valuesarepresentedasmeans±SD.n=3,*p<0.05,and**p<0.001comparedtocontrol2.2組蛋白可導(dǎo)致p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化組蛋白能誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞激活p38、ERK和NF-κBp65通路，且呈時間依賴性，能在20min內(nèi)迅速激活（p<0.01)，并且p38和ERK通路在30min（p<0.001)達(dá)到高峰，NF-κB通路在60min（p<0.001)達(dá)到高峰，最后隨時間延長，組蛋白誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中的p38、ERK和NF-κBp65磷酸化水平逐漸降低。(圖1）。圖1組蛋白誘導(dǎo)p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化Fig1.Extracellularextracellularhistonesinducedphosphorylationofp38,ERKandNF-κBp65.（`X±SD，n=3）.2.3組蛋白通過ERK、p38和NF-κB信號通路誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的TNF-α分泌我們分別使用PD98059（ERK酶的抑制劑）、SB203580(p38的抑制劑）和PDTC（NF-κB的抑制劑）預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1小時后，再加入組蛋白共培養(yǎng)12h,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測細(xì)胞因子TNF-α的分泌水平。與組蛋白組相比，加入抑制劑組可明顯降低RAW264.7細(xì)胞的TNF-α分泌。圖2組蛋白通過ERK、p38和NF-κB通路誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α2.4ALA對RAW264.7細(xì)胞活力和TNF-α分泌的影響MTT法檢測不同濃度ALA（0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml）對RAW264.7活力的影響，結(jié)果顯示在此濃度范圍內(nèi)，ALA對RAW264.7活力沒有明顯改變，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。對于TNF-α分泌的影響，ALA可明顯降低組蛋白誘導(dǎo)的TNF-α的分泌。圖3ALA抑制組蛋白誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-αFig3ALAreducesextracellularhistones-inducedTNF-αreleasefromRaw264.7cells.***p<0.001,comparedtocontrol;##P<0.01,comparedtoextracellularhistones（`X±SD，n=3）2.5ALA抑制組蛋白引起的p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化Westernblot結(jié)果顯示用ALA預(yù)處理后，p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化較組蛋白組降低（p<0.05)。圖4ALA抑制組蛋白誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化Fig.4ALAdecreasethephosphorylationofp38、ERKandNF-κBp65ofRaw264.7cellsstimulatedbyextracellularhistones.(`X±SD，n=3).3討論炎癥反應(yīng)在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展及致死中發(fā)揮了重要作用。而TNF-α是重要的炎癥介質(zhì)，主要來自于單核巨噬細(xì)胞，其濃度的高低反映了機(jī)體炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，并與器官損傷具有顯著的相關(guān)性。故本研究以巨噬細(xì)胞系Raw264.7作為實驗載體，探明了細(xì)胞外組蛋白介導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的機(jī)制，以及硫辛酸的對組蛋白介導(dǎo)炎癥的拮抗效應(yīng)。既往已有研究證實在對膿毒癥患者觀察中發(fā)現(xiàn)同對照組相比，膿毒癥患者血清中組蛋白濃度明顯增加ADDINNE.Ref.{ADA63762-430F-41B9-9AFE-6C6E80F05BC3}[7]。相同結(jié)論在動物實驗研究中也得到證實，并且動物實驗進(jìn)一步證實細(xì)胞外組蛋白可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷ADDINNE.Ref.{9D53D0CC-1357-49CB-A72A-426DCE2F49DF}[2]，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)以及血栓形成，最終導(dǎo)致器官衰竭甚至死亡。而在對于急性腎損傷的研究中，Allam等ADDINNE.Ref.{24896222-9905-4C02-8551-B81F7B42A5E4}[8]人研究也證實組蛋白會導(dǎo)致小鼠的腎小管壞死甚至死亡，但予抗組蛋白抗體時可減少小鼠的死亡率。以上研究表明了細(xì)胞外組蛋白可能是一種新的炎癥介質(zhì)，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在組織損傷和器官衰竭中起著非常重要的作用。我們的研究結(jié)果也證實了細(xì)胞外組蛋白可體外誘導(dǎo)RAW264.7分泌TNF-a，這與之前zhang等ADDINNE.Ref.{D8E27504-BB66-4232-B366-2F8EF1FDEFE5}[3]人研究細(xì)胞外組蛋白刺激人肺上皮細(xì)胞分泌TNF-a的結(jié)果是一致的。但關(guān)于細(xì)胞外組蛋白可體外誘導(dǎo)RAW264.7分泌TNF-a的機(jī)制卻并不清楚。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)是真核細(xì)胞中一系列非常保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶，通過磷酸化其他細(xì)胞蛋白，并從胞漿移位至細(xì)胞核而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性。其中P38和ERK被認(rèn)為是MAPK家族中參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長、分化主要的成員ADDINNE.Ref.{51B75F0E-0CB2-42A6-8367-D7EE05C594C2}[9,10]。在本實驗中我們已經(jīng)表明，細(xì)胞外組蛋白激活RAW264.7中的p38和ERK通路。為了進(jìn)一步闡明在細(xì)胞外組蛋白誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)中這些信號通路的作用，我們用p38MAPK（SB203580）和ERK抑制劑（PD98059）預(yù)處理RAW264.7，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外組蛋白誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)下調(diào)約50%（圖2）。這表明，細(xì)胞外組蛋白調(diào)節(jié)TNF-α表達(dá)部分通過p38和ERK的活化。這些結(jié)果表明，兩個MAPK通路部分參與細(xì)胞外組蛋白介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。我們結(jié)果支持Hiroki等人ADDINNE.Ref.{710D68F1-0893-4DB6-B851-7F02A0EDA865}[11]報道的細(xì)胞外組蛋白通過MAPK信號通路介導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞分泌IL-8、IL-6。NF-κB是在淋巴細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子ADDINNE.Ref.{566EA3D9-94B8-4F06-99A9-942366EC4BC7}[12,13]。它存在于哺乳動物細(xì)胞中，主要參與組織損傷和應(yīng)激，機(jī)體防御反應(yīng)等過程。既往有研究證實細(xì)胞外組蛋白NF-κB的上游分子IkB-α來加重腎損傷ADDINNE.Ref.{C011B791-B086-4FA6-A854-3D01F28F6A8D}[8]，而我們結(jié)果也證實細(xì)胞外組蛋白通過NF-κB通路誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實NF-κB信號通過參與細(xì)胞外組蛋白介導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)，我們用NF-κB抑制劑（PDTC）預(yù)處理RAW264.7，發(fā)現(xiàn)TNF-α表達(dá)下調(diào)約50%（圖2）。這表明，細(xì)胞外組蛋白調(diào)節(jié)TNF-α表達(dá)部分通過的NF-κB活化。α-硫辛酸（α-lipoicacid，ALA）是一種硫氰化合物，屬于維生素B類。它天然存在于人類日常飲食的食物如馬鈴薯、菠菜、動物組織中。它主要功能是作為輔酶ADDINNE.Ref.{1C06BBFF-4387-4091-887E-CF8B4993591F}[14]，參與氧化還原反應(yīng)ADDINNE.Ref.{9BF3F714-0C47-4BBC-A9C7-1E34663A007A}[15,16]。近