GB∕T 18648-2020 非洲豬瘟診斷技術

B41中華人民共和國國家標準代替GB/T18648—2002非洲豬瘟診斷技術2020-12-14發(fā)布2020-12-14實施國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會Ⅰ前言 2規(guī)范性引用文件 3縮略語 4生物安全措施 5臨床診斷 5.1易感動物和宿主 5.4臨床診斷結果判定 6實驗室診斷樣品采集及處理 7普通PCR方法 7.5試驗成立條件 7.6普通PCR結果判定 8熒光PCR方法 8.3引物和探針 8.5試驗成立條件 8.6熒光PCR結果判定 9熒光RAA方法 Ⅱ 9.5試驗成立條件 9.6熒光RAA結果判定 10高敏熒光免疫分析法 10.4高敏熒光免疫分析結果判定 11夾心ELISA抗原檢測方法 11.4試驗成立條件 11.5夾心ELISA抗原檢測結果判定 12間接ELISA抗體檢測方法 12.4試驗成立條件 12.5間接ELISA抗體檢測結果判定 13阻斷ELISA抗體檢測方法 13.4阻斷率計算方法 13.5試驗成立條件 13.6阻斷ELISA抗體檢測結果判定 14夾心ELISA抗體檢測方法 14.4試驗成立條件 14.5夾心ELISA抗體檢測結果判定 15間接免疫熒光方法 Ⅲ15.4試驗成立條件 15.5間接免疫熒光結果判定 16綜合判定 附錄A（規(guī)范性附錄）樣品保存液的配制方法 附錄B（規(guī)范性附錄）聚合酶鏈式反應溶液的配制方法 附錄C（規(guī)范性附錄）酶聯(lián)免疫吸附試驗溶液的配制方法 Ⅴ本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準代替GB/T18648—2002《非洲豬瘟診斷技術》，與GB/T18648—2002相比，除編輯性修改外，主要技術變化如下：—增加了縮略語（見第3章—增加了生物安全措施（見第4章—增加了臨床診斷（見第5章—增加了實驗室診斷樣品采集及處理（見第6章—增加了熒光PCR方法（見第8章）、熒光RAA方法（見第9章）、高敏熒光免疫分析法（見第10章）、夾心ELISA抗原檢測方法（見第11章）、阻斷ELISA抗體檢測方法（見第13章）、夾心ELISA抗體檢測方法（見第14章）、間接免疫熒光方法（見第15章）等實驗室診斷方法；—增加了綜合判定（見第16章—增加了樣品保存液的配制方法（見附錄A)、聚合酶鏈式反應溶液的配制方法（見附錄B);—修改了酶聯(lián)免疫吸附試驗溶液的配制方法（見附錄C,2002年版的附錄C)。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本標準由中華人民共和國農業(yè)農村部提出。本標準由全國動物衛(wèi)生標準化技術委員會(SAC/TC181)歸口。本標準起草單位：中國動物衛(wèi)生與流行病學中心。1非洲豬瘟診斷技術本標準規(guī)定了ASF的臨床診斷，實驗室診斷樣品采集及處理，以及普通PCR方法、熒光PCR方法、熒光RAA方法、高敏熒光免疫分析法、夾心ELISA抗原檢測方法、間接ELISA抗體檢測方法、阻斷ELISA抗體檢測方法、夾心ELISA抗體檢測方法、間接免疫熒光方法等實驗室診斷方法。本標準適用于家豬和野豬ASF的診斷與監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求3縮略語下列縮略語適用于本文件。非洲豬瘟(非洲豬瘟病毒(焦碳酸二乙酯(乙二胺四乙酸(酶聯(lián)免疫吸附試驗(光密度(磷酸鹽緩沖液(聚合酶鏈式反應(重組酶介導的等溫核酸擴增技術(無特定病原體(四甲基聯(lián)苯胺(4生物安全措施進行ASF實驗室診斷時，如樣品處理、核酸提取等，應按照GB19489執(zhí)行。5臨床診斷5.1易感動物和宿主豬科動物是ASFV的易感動物。家豬和歐亞野豬對ASFV高度易感，且表現(xiàn)出相似的臨床癥狀和死亡率；而非洲野豬，例如疣豬、叢林豬、紅河豬和巨林豬，感染ASFV后很少或者不出現(xiàn)臨床癥狀，是2病毒的儲存宿主。5.2.1最急性：無明顯臨床癥狀突然死亡。有黏液膿性分泌物；嘔吐；便秘，糞便表面有血液和黏液覆蓋；或腹瀉，糞便帶血。共濟失調或步態(tài)僵直，呼吸困難，病程延長則出現(xiàn)癱瘓、抽搐等其他神經(jīng)癥狀。妊娠母豬流產。病死率可達100%。病程5.2.3亞急性：臨床癥狀與急性相同，但病情較輕，病死率較低。體溫波動無規(guī)律，一般高于40.5℃。仔豬病死率較高。病程5d~30d。5.2.4慢性：波狀熱，呼吸困難，濕咳。消瘦或發(fā)育遲緩，體弱，毛色暗淡。關節(jié)腫脹，皮膚潰瘍，跛足。死亡率低。病程2個月到15個月。5.3病理變化典型的病理變化包括漿膜表面充血、出血，腎臟、肺臟表面有出血點，心內膜和心外膜有大量出血點，胃、腸道黏膜彌漫性出血；膽囊、膀胱出血；肺臟腫大，切面流出泡沫性液體，氣管內有血性泡沫樣黏液；脾臟腫大，易碎，呈暗紅色至黑色，表面有出血點，邊緣鈍圓，有時出現(xiàn)邊緣梗死；頜下淋巴結、腹腔淋巴結腫大，嚴重出血。最急性型的個體可能不出現(xiàn)明顯的病理變化。5.4臨床診斷結果判定易感動物出現(xiàn)上述臨床癥狀和病理變化，可初步判定為疑似ASF病例。6實驗室診斷樣品采集及處理配制方法見附錄A的配制方法見甘油保存液配制方法見青霉素濃度為鏈霉素濃度為6.2.2容器：真空采血管（含EDTA抗凝劑）、離心管(2mL、10mL)、樣品保存管等。6.2.4采樣記錄用品：采樣單、記號筆、防水標簽等。6.3樣品采集采集病死豬或發(fā)病豬、同群豬的口鼻拭子樣品。用醫(yī)用棉簽在口腔或鼻腔轉動至少3圈，采集口腔、鼻腔的分泌物；蘸取分泌物后，立即將拭子浸入1mL50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，蓋緊3離心管蓋，密封后冷藏或冷凍保存。6.3.2全血樣品采集在發(fā)病豬群中，使用真空采血管（含EDTA抗凝劑）采集一定數(shù)量發(fā)病豬、同群豬全血各5mL,密封后冷藏或冷凍保存。6.3.3血清樣品采集在每一發(fā)病豬群中，采集發(fā)病豬、同群豬全血各5mL,室溫放置12h~24h,分離血清，裝入離心管中，密封后冷藏或冷凍保存。采集病死豬或撲殺發(fā)病豬的組織樣品。首選脾臟，其次為扁桃體、淋巴結、腎臟、骨髓等。脾臟、腎臟采集約3cm×3cm大小，扁桃體整體采集，淋巴結選取出血嚴重的整體采集，骨髓采集長度約3cm。將所采集樣品放入50%甘油-PBS保存液中。6.4樣品處理口、鼻拭子標記樣品編號，立即進行ASF病原檢測或冷凍儲存?zhèn)溆谩?.4.2全血樣品處理全血標記樣品編號，立即進行ASF病原檢測或冷凍儲存?zhèn)溆谩?.4.3血清樣品處理血清標記樣品編號，立即進行ASFV抗體檢測或冷凍儲存?zhèn)溆?。取適量采集的組織樣品置于組織勻漿器中充分研磨，加入終濃度為1000IU/mL的青霉素、的鏈霉素滅菌的制備組織勻漿液。離心處理10min。取上清液，標記編號，立即進行ASF病原檢測或冷凍儲存?zhèn)溆谩７椒?.1.1DNA提取試劑盒。預混液的7.1.4TAE緩沖液，配制方法見B.2和B.3。7.1.52%的瓊脂糖凝膠，配制方法見B.4。7.1.66×上樣緩沖液。47.2.2PCR擴增儀。7.2.3臺式低溫高速離心機（最大離心力12000g以上）。7.2.4穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽。7.2.7無核酸酶離心管與吸頭。7.2.8PCR擴增管。引物針對上游引物下游引物擴增產物大小為7.4試驗程序采用DNA提取試劑盒提取各類樣本中的病毒核酸，或用自動化核酸提取儀提取各類樣本中的病毒核酸。如在2h內檢測可將提取的核酸置于冰上保存，否則應置于-20℃冰箱保存。每次抽提核酸，應至少包括一個陽性對照和一個陰性對照。陽性對照樣品應為ASFV核酸陽性樣本（血清、全血、10%組織勻漿或細胞培養(yǎng)上清液陰性對照樣品應為無核酸酶水或者ASFV核酸陰性樣本（血清、全血、10%組織勻漿或細胞培養(yǎng)上清液）。每個樣品配制22μLPCR反應混合液，組成如下：無核酸酶水7.5μL預混液(將22μLPCR反應混合液加入每個0.2mLPCR擴增管；將3μLDNA模板加入PCR擴增管中。每次進行普通PCR擴增時均應設立陽性、陰性及空白對照。陽性對照應用陽性對照樣品所提取核酸作為模板，陰性對照應用陰性對照樣品所提取核酸作為模板，空白對照應用無核酸酶水作為模板。加入模板后，密封反應管，瞬時離心。將所有PCR擴增管放在PCR儀中。按7.4.2.2條件運行擴增程序。預變性變性退火延伸個循環(huán)終延伸7min。7.4.2.3PCR擴增產物電泳將5μL的6×上樣緩沖液加入PCR產物中，混勻后取8μL加入到使用1×TAE緩沖液配制的2%瓊脂糖凝膠中，電泳30min~40min。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀中觀察結果。7.5試驗成立條件陽性對照應有大小為257bp的特異性擴增條帶，且陰性對照和空白對照應無任何擴增條帶。57.6普通PCR結果判定符合7.5的條件，被檢樣品有大小為257bp的特異性擴增條帶，且與陽性對照條帶分子量大小相符，則該樣品判為ASFV核酸陽性；被檢樣品無特異性的擴增條帶，則判為ASFV核酸陰性。8熒光PCR方法8.1.1DNA提取試劑盒。熒光預混液(8.2.1熒光PCR擴增儀。8.2.2臺式低溫高速離心機（最大離心力12000g以上）。8.2.4無核酸酶離心管與吸頭。8.2.5PCR擴增管。8.3引物和探針引物和探針針對基因的保守序列設計。上游引物下游引物′;探針每個樣品配制18μL熒光PCR反應混合液，組成如下：無核酸酶水5.9μL熒光預混液(將18μL熒光PCR反應混合液加入PCR擴增管；將2μLDNA模板加入每個PCR擴增管中。每次進行熒光PCR擴增時均應設陽性、陰性及空白對照。陽性對照應用陽性對照樣品所提取核酸作為模板，陰性對照應用陰性對照樣品所提取核酸作為模板，空白對照應用無核酸酶水作為模板。加入模板后，密封PCR擴增管，瞬時離心。將所有PCR擴增管放入熒光PCR儀中。按8.4.2.2運行擴增程序。6孵育預變性變性退火延伸個循環(huán)在每一循環(huán)的58℃時收集FAM熒光信號。8.5試驗成立條件陽性對照的Ct值<30且出現(xiàn)特異性擴增曲線，陰性對照無Ct值或陰性對照Ct值≥40且無特異性擴增曲線，試驗結果有效；否則應重新進行試驗。8.6熒光PCR結果判定符合8.5的條件，被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，則判為ASFV核酸陽性；當無Ct值或Ct值≥40,則判為ASFV核酸陰性；當38<Ct值<40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，則判為疑似。對疑似樣品，模板量加倍(4μLDNA模板）進行1次復檢，做3個重復；有2個重復Ct值<40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV核酸陽性，否則判為ASFV核酸陰性。9熒光RAA方法9.1.1DNA提取試劑盒。9.1.3RAA反應預混液。9.1.4RAA熒光基礎反應單元：包含重組酶，單鏈結合蛋白，DNA聚合酶的凍干粉。乙酸鎂。9.2.1恒溫熒光基因檢測儀。9.2.2臺式低溫高速離心機（最大離心力12000g以上）。9.2.4無核酸酶離心管與吸頭。引物和探針針對基因的保守序列設計。上游引物探針(THF)(BHQ1-dT)CCCGTGGCTTCAAAG。9.4試驗程序7每個樣品配制42.5μL熒光RAA反應混合液，組成如下：預混液將42.5μL熒光RAA反應混合液加入RAA熒光基礎反應單元中；將5μLDNA模板加入每個反應管中，將2.5μL乙酸鎂加在反應單元管蓋上。每次進行熒光RAA擴增時均應設立陽性、陰性及空白對照。陽性對照應用陽性對照樣品所提取核酸作為模板，陰性對照應用陰性對照樣品所提取核酸作為模板，空白對照應用無核酸酶水作為模板。加入模板后，密封反應管，放入恒溫振蕩混勻儀。完成混勻收集后，將所有反應管放入熒光恒溫檢測儀中。按9.4.2.2運行擴增程序。擴增溫度39℃,擴增時間15min,每隔20s收集熒光信號。9.5試驗成立條件陽性對照起峰時間≤1.67min且出現(xiàn)特異性起峰曲線，陰性對照無起峰時間或陰性對照起峰時間＞10min且無特異性起峰曲線，試驗結果有效；否則應重新進行試驗。9.6熒光RAA結果判定符合9.5的條件，被檢樣品起峰時間≤10min且出現(xiàn)特異性起峰曲線，則判為ASFV核酸陽性；被檢樣品無起峰時間或被檢樣品起峰時間＞10min且無特異性起峰曲線，則判定為ASFV核酸陰性。10高敏熒光免疫分析法配制方法見10.1.3ASFV抗原高敏熒光檢測試劑卡（檢測卡）。等不同規(guī)格10.2.4臺式低溫高速離心機（最大離心力12000g以上）。8全血需經(jīng)過抗凝處理，血清、血漿無需處理。取豬組織（優(yōu)先采集脾或淋巴結組織）4g加入勻漿機，加入1mL0.1mol/LPBS(pH7.4)緩沖液，打碎攪拌成勻漿、離心，取上清液待檢。待檢樣本和檢測卡從2℃~8℃取出，平衡到室溫(25℃左右高敏熒光分析儀開機。用微量可調移液器吸取樣本40μL加入檢測卡，然后加入50μL稀釋液，從加樣開始靜置免疫反應15min后讀值。用微量可調移液器吸取樣本50μL加入檢測卡，5min后加入50μL稀釋液，接著再加入50μL稀釋液沖洗。從加樣開始靜置免疫反應15min后讀值。用微量可調移液器吸取樣本40μL加入檢測卡，然后加入50μL稀釋液，從加樣開始靜置免疫反應15min后讀值。避光層析15min后，將檢測卡放入高敏熒光分析儀，點擊“診斷”讀值。10.4高敏熒光免疫分析結果判定讀值與ASFV抗原含量成正比。被檢樣品讀值<12,則判定為ASFV抗原陰性；被檢樣品讀值≥16,則判定為ASFV抗原陽性；12＜被檢樣品讀值<16,則判定為可疑。10.4.2可疑樣品復測判定可疑樣品讀值<12,則判定為ASFV抗原陰性；可疑樣品讀值≥12,則判定為ASFV抗原陽性。911夾心ELISA抗原檢測方法11.1.2酶標抗體：辣根過氧化物酶標記的P30蛋白單抗（針對P30蛋白的不同表位）。11.1.3對照：ASFV陽性對照（純化的桿狀病毒表達P30蛋白）、ASFV陰性對照(SPF豬血清）。微量可調移液器(2P30蛋白單克隆抗體用包被緩沖液1:200倍稀釋后，每孔100μL包被96孔酶標板，37℃飽和濕度下吸附2h,用洗滌緩沖液洗板4次后拍干，300μL/孔加入封閉緩沖液，37℃飽和濕度下吸附2h,用洗滌緩沖液洗板4次后拍干。11.3.2夾心ELISA抗原檢測操作步驟在所有孔中加入稀釋液，25μL/孔。酶標板上對照和待檢樣品的分布圖，見圖1。在A1、B1孔中加入陽性對照，25μL/孔；在C1、棄去反應孔中的液體，每孔用洗滌緩沖液清洗4次，洗滌緩沖液300μL/孔?？追跤龡壢シ磻字械囊后w，每孔用洗滌緩沖液清洗4次，洗滌緩沖液300μL/孔。每孔加入底物溶液，50μL/孔，室溫避光作用10min。每孔中加入50μL終止液，終止反應。11.3.2.8用酶標儀在450nm123456789APBPCNDNEFGH說明：P—陽性對照孔；N—陰性對照孔；—待檢樣品孔，其余類推。圖1樣品加樣記錄表（推薦模式）11.5夾心ELISA抗原檢測結果判定則判定該待檢樣品為ASFV抗原陰性。12間接ELISA抗體檢測方法12.1.1包被抗原：桿狀病毒表達的ASFVP30重組蛋白。12.1.2酶標抗體：辣根過氧化物酶標記的羊抗豬二抗。12.1.3對照：ASFV陽性對照血清、ASFV陰性對照血清。12.1.8TMD底物溶液，配制方法見C.5。用包被緩沖液將ASFVP30重組蛋白稀釋至終濃度0.3μg/mL,每孔100μL包被96孔酶標板奇數(shù)條作為檢測孔，使用抗原稀釋液包被96孔酶標板偶數(shù)條作為對照孔，37℃飽和濕度下吸附2h,用洗滌緩沖液洗板4次后拍干，300μL/孔加入封閉緩沖液，37℃飽和濕度下吸附2h,用洗滌緩沖液洗板4次后拍干。12.3.2間接ELISA抗體檢測操作步驟12.3.2.1待檢血清與陰性、陽性對照血清使用樣品稀釋液做40倍稀釋。酶標板上對照和待檢樣品的分布圖，見圖2。50μL/孔，在A1、A2和B1、B2孔中加的陽性對照血清，在C1、C2和D1、D2孔中加入稀釋后的陰性對照血清，在E1、E2等其余孔加入稀釋后棄去反應孔中的液體，每孔用洗滌緩沖液清洗4次，洗滌緩沖液300μL/孔?？追跤龡壢シ磻字械囊后w，每孔用洗滌緩沖液清洗4次，洗滌緩沖液300μL/孔。每孔加入底物溶液，50μL/孔，室溫避光作用10min。每孔中加入50μL終止液，終止反應?！?1)式中：123456789APPBPPCNNDNNEFGH說明：P—陽性血清對照孔；N—陰性血清對照孔；—待檢血清孔，其余類推。圖2樣品加樣記錄表（推薦模式）12.4試驗成立條件12.5間接ELISA抗體檢測結果判定在試驗成立的前提下，待檢樣品OD450差＞0.2,則判定該待檢樣品為ASFV抗體陽性；待檢樣品OD450差≤0.2,則判定該待檢樣品為ASFV抗體陰性。13阻斷ELISA抗體檢測方法13.1.1包被抗原：桿狀病毒表達的ASFVP30重組蛋白。13.1.2酶標抗體：辣根過氧化物酶標記的抗ASFVP30蛋白單抗。13.1.3對照：ASFV陽性對照血清、ASFV陰性對照血清。13.1.8TMD底物溶液，配制方法見C.5。用包被緩沖液將ASFVP30重組蛋白稀釋成終濃度為0.3μg/mL,每孔100μL包被96孔酶標板，37℃飽和濕度下吸附2h,用洗滌緩沖液洗板4次，300μL/孔加入封閉緩沖液，37℃飽和濕度下吸附2h,用洗滌緩沖液洗板4次后拍干。13.3.2阻斷ELISA抗體檢測操作步驟酶標板上對照和樣品的分布圖，見圖3。每孔加入50μL的稀釋液，在A1、B1孔加入50μL陽性對照血清，在C1、D1孔加入50μL陰性對照血清，在E1、F1孔加入50μL稀釋液，其余每的血清樣品孵育棄去反應孔中的液體，每孔用洗滌緩沖液清洗5次，洗滌緩沖液300μL/孔。用稀釋緩沖液將酶標孔孵育棄去反應孔中的液體，每孔用洗滌緩沖液清洗5次，洗滌緩沖液300μL/孔。每孔加入底物溶液孔室溫避光作用每孔中加入100μL終止液，終止反應。13.3.2.7用酶標儀在450nm的波長下測定各孔OD值，計算阻斷率。123456789APBPCNDNECmFCmGH說明：P—陽性血清對照孔；N—陰性血清對照孔；—待檢血清孔，其余類推。圖3樣品加樣記錄表（推薦模式）13.4阻斷率計算方法阻斷率按式(2)~式(4)計算： 式中：BRS—待檢血清樣品阻斷率；—陰性對照血清阻斷率；BRPC—陽性對照血清阻斷率；13.5試驗成立條件陽性對照阻斷率＞70,且陰性對照阻斷率<30,試驗結果有效；否則，應重新進行試驗?？贵w檢測結果判定在試驗成立的前提下，待檢樣品阻斷率＞50,則判定為ASFV抗體陽性；待檢樣品阻斷率≤50,則判定為ASFV抗體陰性?？贵w檢測方法14.1.2酶標抗原：辣根過氧化物酶標記的重組P54蛋白。14.1.3對照：ASFV陽性對照血清、ASFV陰性對照血清。14.1.8TMD底物溶液，配制方法見C.5。ASFV重組P54蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為0.1μg/mL,按每孔100μL的量包被96孔酶標板，37℃飽和濕度下吸附2h,用洗滌緩沖液洗板4次后拍干，300μL/孔加入封閉緩沖液，37℃飽和濕度下吸附2h,用洗滌緩沖液洗板4次后拍干。14.3.2ELISA操作步驟酶標板上對照和樣品的分布圖，見圖4。在A1和B1孔加入ASFV陽性對照血清各50μL,在C1和D1孔加入ASFV陰性對照血清各50μL;剩余孔中加入待檢樣品血清50μL。輕輕振勻孔中樣品勿溢出孵育甩干ASFV抗原包被板孔中的液體，每孔加入300μL洗滌緩沖液，洗滌5次，在洗滌和加入下一個試劑前，避免孔壁變干。每孔加入的酶標抗原(孵育甩干ASFV抗原包被板孔中的液體，每孔加入300μL洗滌緩沖液，洗滌5次，在洗滌和加入下一個試劑前，避免孔壁變干。每孔加入避光孵育每孔加入50μL終止液終止顯色反應；使用酶標儀測定450nm波長處的OD值。123456789APBPCNDNEFGH說明：P—陽性血清對照孔；N—陰性血清對照孔；—待檢血清孔，其余類推。圖4樣品加樣記錄表（推薦模式）14.4試驗成立條件14.5夾心ELISA抗體檢測結果判定CutOff值按式(5)計算：式中：值則判為抗體陰性值則判為抗體陽性。15間接免疫熒光方法15.1.1制備抗原板：感染ASFV的細胞或者感染重組病毒（表達ASFV蛋白）的細胞固定于固相載體。15.1.2對照血清：ASFV陽性對照血清、ASFV陰性對照血清。熒光二抗羊抗豬微量可調移液器(215.2.6與移液器匹配的吸頭。選擇合適細胞鋪制24孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長至80%時，進行細胞計數(shù)。按合適的病毒量接種ASFV種毒或表達ASFV蛋白的重組病毒，37℃維持培養(yǎng)約48h。每孔加入200μL預冷細胞固定液將細胞固定10min,棄去固定液，將細胞培養(yǎng)板晾干。晾干后儲存于-20℃冰箱備用。15.3.2間接免疫熒光檢測操作步驟將固定的抗原板從-20℃冰箱中取出，每孔用洗滌緩沖液清洗3次，洗滌緩沖液1000μL/孔?？乖迳蠈φ蘸蜆悠返姆植紙D，見圖5。棄去反應孔中的液體，在A1孔加入200μL陽性對照血清，在B1孔加入200μL陰性對照血清，其余每孔加入200μL的待檢血清樣品，37℃孵育60min。123456APBNCD說明：P—陽性血清對照孔；N—陰性血清對照孔；—待檢血清孔，其余類推。圖5樣品加樣記錄表（推薦模式）棄去反應孔中的液體，每孔用洗滌緩沖液清洗3次，洗滌緩沖液1000μL/孔。用稀釋緩沖液將熒光二抗稀釋至工作濃度，200μL/孔，37℃孵育50min。棄去反應孔中的液體，每孔用洗滌緩沖液清洗3次，洗滌緩沖液1000μL/孔。15.3.2.6熒光顯微鏡觀察結果。15.4試驗成立條件陽性對照出現(xiàn)特異性綠色熒光，且陰性對照無特異性綠色熒光，試驗結果有效；否則，應重新進行試驗。15.5間接免疫熒光結果判定在試驗成立的前提下，待檢樣品出現(xiàn)特異性綠色熒光，則判定待檢樣品為ASFV抗體陽性。待檢樣品無特異性綠色熒光，則判定待檢樣品為ASFV抗體陰性。待檢樣品出現(xiàn)非特異性綠色熒光或熒光信號較弱，則判定待檢樣品為ASFV抗體可疑，建議重新檢測血清樣品或用不同的方法重新檢測。16綜合判定RAA方法（見第9章）任一項檢測出ASFV核酸陽性的，或經(jīng)高敏熒光免疫分析法（見第10章）、夾心ELISA抗原檢測方法（見第11章）任一項檢測出ASFV抗原陽性的，可診斷為ASF病例。如經(jīng)普通PCR方法（見第7章）檢測出ASFV核酸陰性的，或經(jīng)高敏熒光免疫分析法（見第10章）、夾心ELISA抗原檢測方法（見第11章）檢測出ASFV抗原陰性的，仍需經(jīng)熒光PCR方法（見第8章）、熒光RAA方法（見第9章）進行再檢，任一項檢出ASFV核酸陽性的，可診斷為ASF病例。16.2無明顯臨床癥狀的易感動物，經(jīng)普通PCR方法（見第7章）、熒光PCR方法（見第8章）、熒光RAA方法（見第9章）任一項檢測出ASFV核酸陽性的，或經(jīng)高敏熒光免疫分析法（見第10章）、夾心ELISA抗原檢測方法（見第11章）任一項檢測出ASFV抗原陽性的，可診斷為ASFV感染；如經(jīng)普通PCR方法（見第7章）檢測出ASFV核酸陰性的，或經(jīng)高敏熒光免疫分析法（見第10章）、夾心ELISA抗原檢