高中生物選修1 知識點復習總結（缺pcr技術）

選修1知識點總結

1.1果酒和果醋的制作

一、實驗原理

1.酒精發(fā)酵的原理：

附

①酵母菌進行有氧呼吸大量繁殖，表達式為：aHM6+02-C02+H20+能量

酶

②酵母菌進行無氧呼吸產(chǎn)生酒精和二氧化碳，表達式為：CMQ-C2H50H+C0z+能量

③酵母菌的營養(yǎng)代謝類型為異養(yǎng)兼性厭氧型。在有氧時，酵母菌大量繁殖，但是不起到

發(fā)酵效果；在無氧時，繁殖速度減慢，但是此時可以進行發(fā)酵。在利用酵母菌發(fā)酵時最

好是先通入足夠的無菌空氣在有氧環(huán)境下一段時間使其繁殖，再隔絕氧氣進行發(fā)酵。20°C

左右最適合酵母菌繁殖，酒精發(fā)酵的最佳溫度是在18c?25℃,pH最好是弱酸性。

2.醋酸發(fā)酵的原理：

①醋酸菌是好氧型細菌，當缺少糖源時和有氧條件下，可將乙醇（酒精）氧化成醋酸。

醐

表達式為：CJfcOH+GfCHsCOOH+HzO；

當氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸。

醋酸菌生長的最佳溫度是在30℃~35℃

二、實驗步驟

1.對發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機、盛葡萄汁的器皿等實驗用具進行清洗并消毒。先用溫水

反復沖洗幾次,再用體積分數(shù)為75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。

2.取葡萄500g,去除枝梗和腐爛的子粒。

3.用清水沖洗葡萄1?2遍除去污物，注意不要反復多次沖洗。

4.用榨汁機榨取葡萄汁后，將其裝入發(fā)酵瓶中或將葡萄打成漿后，用潔凈的紗布過濾

至發(fā)酵瓶中，蓋好瓶蓋。如果沒有合適的發(fā)酵裝置，可以用500mL的塑料瓶替代，但注

入的果汁量不要超過塑料瓶總體積的2/3。

5.將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度下發(fā)酵。

6.由于發(fā)酵旺盛期COz的產(chǎn)量非常大，因此需要及時排氣，防止發(fā)酵瓶爆裂。如果使用

簡易的發(fā)酵裝置，如瓶子（最好選用塑料瓶），每天要擰松瓶蓋2?4次，進行排氣。

7.10d以后，可以開始進行取樣檢驗工作。例如，可以檢驗酒味、酒精的含量、進行

酵母菌的鏡檢等工作。

8.當果酒制成以后，可以在發(fā)酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后將裝置轉移至30?35℃

的條件下發(fā)酵，適時向發(fā)酵液中充氣。如果找不到醋酸菌菌種或醋曲，可嘗試自然接種，

但效果不是很好。如果沒有充氣裝置，可以將瓶蓋打開，在瓶口蓋上紗布，以減少空氣

中塵土等的污染。

三、注意事項

請分析此裝置中的充氣口、排氣口和出料口分別有哪些作用。為什么排氣口要通過

一個長而彎曲的膠管與瓶身連接？結合果酒、果醋的制作原理，你認為應該如何使用這

個發(fā)酵裝置？

充氣口排氣口

出料口

答：充氣口是在醋酸發(fā)酵時連接充氣泵進行充氣用的；排氣口是在酒精發(fā)酵時用來

排出C02的；出料口是用來取樣的。排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身連接，其目

的是防止空氣中微生物的污染。使用該裝置制酒時，應該關閉充氣口；制醋時，應將充

氣口連接氣泵，輸入氧氣。

1.2腐乳的制作

一、實驗原理

1.參與豆腐發(fā)酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多種，其中起主要作用的是毛霉.

2.毛霉是一種絲狀真菌，營養(yǎng)代謝類型為異養(yǎng)需氧型，最適生長溫度為15-18C,常見

于土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有發(fā)達的白色菌絲。

3.毛酶等微生物產(chǎn)生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶

可將脂肪分解成甘油和脂肪酸。

二、實驗步驟

1.將豆腐切成3cmX3cmXlcm的若干塊。所用豆腐的含水量為70%左右，水分過多則腐

乳不易成形。

2.將豆腐塊平放在鋪有干粽葉的盤內(nèi)，粽葉可以提供菌種，并能起到保溫的作用。每塊

豆腐等距離排放，周圍留有一定的空隙。豆腐上面再鋪上干凈的粽葉。氣候干燥時，將

平盤用保鮮膜包裹，但不要封嚴，以免濕度太高，不利于毛霉的生長。

3.將平盤放入溫度保持在15~18°C的地方。毛霉逐漸生長，大約5d后豆腐表面叢生

著直立菌絲。

4.當毛霉生長旺盛，并呈淡黃色時，去除包裹平盤的保鮮膜以及鋪在上面的粽葉，使豆

腐塊的熱量和水分能夠迅速散失，同時散去霉味。這一過程一般持續(xù)36h以上。

5.當豆腐涼透后，將豆腐間連接在一起的菌絲拉斷，并整齊排列在容器內(nèi)，準備腌制。

6.長滿毛霉的豆腐塊（以下稱毛坯）與鹽的質(zhì)量分數(shù)比為5：lo將培養(yǎng)毛坯時靠近平盤

沒長直立菌絲的一面統(tǒng)一朝向玻璃瓶邊，將毛坯分層盤立擺放在容器中。分層加鹽，并

隨層加高而增加鹽量，在瓶口表面鋪鹽厚些，以防止雜菌從瓶口進入。約腌制8d。

（注：加鹽可以析出豆腐中的水分，有利于腐乳成型；鹽能夠抑制微生物的生長，并且

可以調(diào)味。用鹽腌制時，注意鹽都用量。鹽的濃度過低，不足以抑制微生物生長，可能

導致豆腐腐敗變質(zhì)；鹽的濃度過高，會影響腐乳的口味。）

7.將黃酒、米酒和糖，按口味不同而配以各種香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、

姜、辣椒等）混合制成鹵湯。鹵湯酒精含量控制在12%左右為宜。

（注：酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時間的長短有很大關系。酒精含量越高，對蛋白

酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白

質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。）

8.將廣口玻璃瓶刷干凈后，用高壓鍋在100℃蒸汽滅菌30min。將腐乳咸坯擺入瓶中，

加入鹵湯和輔料后，將瓶口用酒精燈加熱滅菌，用膠條密封。在常溫情況下，一般六個

月可以成熟。

三、注意事項

1.釀造腐乳的主要生產(chǎn)工序是將豆腐進行前期發(fā)酵和后期發(fā)酵.前期發(fā)酵所發(fā)生的主要

變化是毛霉在豆腐（白坯）上的生長。發(fā)酵的溫度為15?18℃,此溫度不適于細菌、

酵母菌和曲霉的生長，而適于毛霉慢慢生長。毛霉生長大約5d后使白坯變成毛坯。前

期發(fā)酵的作用，一是使豆腐表面有一層菌膜包住，形成腐乳的“體”；二是毛霉分泌以

蛋白酶為主的各種酶，有利于豆腐所含有的蛋白質(zhì)水解為各種氨基酸。后期發(fā)酵主要是

酶與微生物協(xié)同參與生化反應的過程。通過腌制并配入各種輔料（紅曲、面曲、酒釀）,

使蛋白酶作用緩慢，促進其他生化反應，生成腐乳的香氣。

課題

1.3制作泡菜并檢測亞硝酸鹽含量

一、實驗原理

1.制作泡菜所用微生物是乳酸桿菌其代謝類型是異養(yǎng)厭氧型。

在無氧條件下，將糖分解為乳酸，分裂方式是二分裂。

反應式為：C6Hl2c3H6。3+能量

含抗生素牛奶不能生產(chǎn)酸奶的原因是抗生素能殺死細菌和放線菌。常見的乳酸菌有乳

酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產(chǎn)酸奶。

2.亞硝酸鹽為白色粉末，易溶于水，在食品生產(chǎn)中用作食品添加劑。

膳食中的亞硝酸鹽一般不會危害人體健康，國家規(guī)定肉制品中不超過30mg/kg,醬腌

亞

菜中不超過20mg/kg,嬰兒奶粉中不超過2mg/kg。亞硝酸鹽被吸收后隨尿液排出體外，

但在適宜pH、溫度和一定微生物作用下形成致癌物質(zhì)亞硝胺。

3.一般在腌制10天后亞硝酸鹽含量開始降低，故在10天之后食用最好

4.測定亞硝酸鹽含量的原理是在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化

反應后，與N-1-蔡基乙二胺鹽酸鹽結合形成玫瑰紅色染料，與已知濃度的標準顯色液目

測比較，估算泡菜中亞硝酸鹽含量。

殍時間(d)

2.1微生物的實驗室培養(yǎng)

一、基礎知識

1.培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，

是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎。

(1)培養(yǎng)基的分類：

?培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。

在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂(是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作

凝固劑)后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。

微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷

是哪一種菌。

液體培養(yǎng)基應用于工業(yè)或生活生產(chǎn)，固體培養(yǎng)基應用于微生物的分離和鑒定，半固體

培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。

?按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基“

合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學物質(zhì)配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微

生物的分離鑒定。

天然培養(yǎng)基是用化學成分不明的天然物質(zhì)配制而成，常用于實際工業(yè)生產(chǎn)。

?按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。

選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長，促進所

需要的微生物的生長。

鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的,

用以鑒別不同類別的微生物。

(2)培養(yǎng)基的成分：培養(yǎng)基的化學成分包括水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子等。

?碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如C02、NaHCO3等無機碳源；糖類、石

油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

?氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、N03-、NH4+（無機氮源）蛋

白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白凍（有機氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

?培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。

例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至

酸性，培養(yǎng)細菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無氧的

條件

2.無菌技術

a.獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：

①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。

②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。

③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。

④實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

b.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？

答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。

c.消毒與滅菌的區(qū)別

①消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的

微生物（不包括芽胞和抱子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（對于一些不耐高

溫的液體）還有化學藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。

②滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽抱和獨子。滅菌

方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。

d.常用器具的滅菌方法：

①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；

②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；

③培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。

④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

比較項理化因素的作用強度消滅微生物的數(shù)量芽他和抱子能否被消

滅

消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能

滅菌強烈全部微生物能

3.實驗操作

(1)制作牛肉膏蛋白陳固體培養(yǎng)基

①方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。

②倒平板操作：

a.將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

b.右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過火焰。

c.用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基

(約10?20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

d.等待平板冷卻凝固，大約需5?lOmin。然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、

皿底在上。

?倒平板操作的討論

①培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50C左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培

養(yǎng)基的溫度？

提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就

可以進行倒平板了。

②為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

③平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒

置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造

成污染。

④在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能

用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板

培養(yǎng)微生物.

(2)純化大腸桿菌

①微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

②平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步

稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼

可見的子細胞群體，這就是菌落。

③稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布

到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

④用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細

胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。

(3)平板劃線法操作步驟：

①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。

②在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。

③將試管口通過火焰。

④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。

⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。

⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條

平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。

⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復以

上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。

⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

?平板劃線操作的討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然

需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次

劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，

接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時

菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘

留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？

答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，

能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌

落。

(4)涂布平板操作的步驟:

①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。

②取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。

③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8?10s。

④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。

?涂布平板操作的討論

1.涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求,

想一想，第二步應如何進行無菌操作？

提示：應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管

頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。

(4)菌種的保存

(1)對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。

①臨時保藏方法

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當菌落長成后，將試

管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3?6個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉移到新

鮮的培養(yǎng)基上。

②缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。

(2)對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉移到甘油瓶中，與甘

油充分混勻后，放在一20℃的冷凍箱中保存。

(5)疑難解答

①生物的營養(yǎng)

營養(yǎng)是指生物攝取、利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程。營養(yǎng)物質(zhì)是指維持機體生命活動，保證發(fā)

育、生殖所需的外源物質(zhì)。

人及動物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。

植物的營養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類。

微生物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、碳源、氮源及特殊營養(yǎng)物質(zhì)五類。

②確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法

將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1?2天，無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的,

否則需要重新制備O

2.2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

尿素：是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當土壤中的細菌

將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們

能合成服酶。尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的

一、篩選菌株：

(1)實驗室中微生物的篩選應用的原理：

人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其

他微生物生長。

(2)選擇性培養(yǎng)基

在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長

的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。

(3)配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)

根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質(zhì)以達到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基

中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固

氮的微生物；加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。

二、統(tǒng)計菌落數(shù)目

(1)測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法利顯微鏡直接計數(shù)?

(2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理

當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個

活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結

果準確，一般設置3?5個平板，選擇菌落數(shù)在30?300的平板進行計數(shù)，并取平均值。

統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來

表示。

三、設置對照

設置對照的主要H的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的

可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照

試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應的結果。

四、實驗設計

實驗設計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安

排等的綜合考慮和安排。

(1)土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含

有機質(zhì)的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH七7的土壤中取樣。

鏟去表層土，在距地表約3?8cm的土壤層取樣。

(2)樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實際操作中，

通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計數(shù)

的平板。

測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用10\10\106

測定放線菌的數(shù)量，一般選用10\10\105

測定真菌的數(shù)量，一般選用10\10\104

(3)微生物的培養(yǎng)與觀察

不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。

細菌30?37℃1?2天

放線菌25?28℃5?7天

霉菌25?28℃3?4天

每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，這樣可以防

止因培養(yǎng)時間不足而導致一樓菌落的數(shù)目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培

養(yǎng)基、唯獨及培養(yǎng)時間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、

顏色

五、疑難解答

(1)如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？

統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個以上平板，計算出平板菌落數(shù)的平

均值

每克樣品中的菌落數(shù)=(C/V)*M

其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋

液的體積(ml),M代表稀釋倍數(shù)

2.3分解纖維素的微生物的分離

一、纖維素與纖維素酶

纖維素：一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物

質(zhì)。

(1)棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。

(2)纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖

昔酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素

最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。

二、纖維素分解菌的篩選

(1)篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。

(2)剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理

剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復合物，但并不和水

解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，

剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅一

纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，

我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

三、分離分解纖維素的微生物的實驗流程

土壤取樣f選擇培養(yǎng)(此步是否需要，應根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定)一

梯度稀釋f將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上一挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

(1)土壤采集：選擇富含纖維素的環(huán)境。

(2)剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟：倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板

(3)剛果紅染色法種類：

一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果

紅。

四、課題延伸

對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的

是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵

和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生

的葡萄糖進行定量的測定。

五、疑難解答

(1)為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？

由于生物與環(huán)境的相互依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對

提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。

(2)將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋進土壤多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設置纖維素分解菌生存

的適宜環(huán)境.一般應將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。

(3)兩種剛果紅染色法的比較

方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；其

優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。

方法二的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁

中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉醐的微生物出現(xiàn)假陽性反應。但這種只產(chǎn)生

淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因為培養(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與

纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，

它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。

(4)為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？

在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而

那些不適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。

專題4酶的研究與應用

課題一果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用

(1)果膠

①作用：植物細胞壁以及胞間層的主要組成成分之一;在果汁加工中，會影響

出汁率并使果汁渾濁。

②成分：由半乳糖醛酸聚合而成的一種高分子化合物。

③特點：不溶于水。

(2)果膠酶

①成分：是分解果膠的一類酶的總稱，包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠分解酶和

果膠酯酶等。

②作用：果膠果膠辭可溶性半乳糖醛酸

(3)酶的活性及其影響因素

［含義：指酶傕化一定化學反應的能力

①酶的活性《表示方法：單位時間內(nèi)，單位體積中反應物

I的減少量或生成物增加量

②影響酶活性的因素：溫度、迎和酶的用量等。

1.探究影響果膠酶活性因素實驗的分析

（1）實驗原理：果膠酶活性受溫度、pH或酶抑制劑的影響,在最適溫度或pH時，其

活性最高，果肉的出汁率、果汁的澄清度都與果膠酶的活性大小呈正相關。

（2）實驗原則：遵循單一變量原則、對照原則,嚴格控制變量，盡量減少無關變量的

影響。

（3）設計實驗：探究最適溫度時，pH為不變量（無關變量），最好是最適pH；探究最適

pH時，溫度為不變量（無關變量），最好是最適溫度。

2.三個實驗的變量分析

實驗名稱（目的）自變量因變量注意事項

①底物和酶在混合時的溫度是相

探究溫度對果膠酶同的;②溫度梯度越小，實驗結果

活性的影響溫度果汁量（澄清度）越精確；③蘋果泥和果膠酶用量在

各個試管應相同;④pH應為最適

PH

①溫度應為最適溫度；②pH梯度

探究pH對果膠酶

EH果注量（澄清度）可用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié):⑶用玻璃

活性的影響

棒攪拌使反應充分進行

①制備蘋果勻漿后迅速加熱，使蘋

探究果膠酶的用量果膠酶的用量果汁量（澄清度）果勻漿中的果膠酶變性;②溫度、

pH應為最適且保持不變

［特別提醒I

在探究溫度或pH的影響時，不同的溫度梯度之間或不同的pH梯度之間構成了相互

對照，通過相互對照可確定果膠酶活性的溫度或pH的最適值。

（5）探究果膠酶的最適用量

①實驗流程

|過濾后測域果汁體積|

②實驗結果分析

如果隨著酶濃度的增加，過濾得到的果汁體積也增加，說明酶的用量不足；當

酶的濃度增加到某個值后，再增加酶的用量,過濾得到的果汁的體積不再改變,

說明酶的用量已經(jīng)足夠，這個值就是酶的最適用量。

（教材P44旁欄思考題解答）（1）為什么在混合蘋果泥和果膠酶之前，要將

果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理？

提示將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理，可以保證底物和酶在混

合時的溫度是相同的，避免了果泥和果膠酶混合時影響混合物的溫度，從而影

響果膠酶活性的問題。

（2）在探究溫度或pH對酶活性的影響時，是否需要設置對照？如果需要，

是如何設置的？

提示需要設置對照實驗，不同的溫度梯度之間或不同的pH梯度之間就可以

作為對照，這種對照稱為相互對照。

課題2探討加酶洗衣粉的洗滌效果

(1)加酶洗衣粉：指含醒制劑的洗衣粉。

(2)酶制劑的種類與洗滌原理

種類洗滌原理洗滌的物質(zhì)種類

蛋白質(zhì)~小分子肽或

蛋白酶血漬、奶漬等

氨基酸

食品的油漬、人體皮脂、

脂肪酶脂肪f甘油和脂肪酸

口紅等

淀粉酶淀粉f麥芽糖、葡萄糖來自面粉等的污垢

使纖維的結構變得蓬

纖維素酶棉紡品的表面浮毛

松

(3)對加酶洗衣粉的洗滌效果的探究方法

①判斷加酶洗衣粉洗滌效果的方法：可在洗滌后比較污物的殘留狀況，如已消

失、顏色變淺、面積縮小等。

②加酶洗衣粉的洗滌效果的探究方法:實驗設計遵循的原則是對照原則和單二

變量原則,其變量分析如下表。

實驗自變量因變量無關變量

探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉種類(普通和加洗滌效水的用量，污物的

洗衣粉的洗滌效果酶)果量，實驗用布的質(zhì)

探究不同種類加酶洗衣地與大小，不同洗

加酶洗衣粉中酶的種類

粉的洗滌效果衣粉的用量，攪

拌、洗滌時間等

探究不同溫度對加酶洗

溫度

衣粉洗滌效果的影響

C深挖教材

(1)使用加酸洗衣粉時宜用開水、溫水還是涼水浸泡？

提示酶的催化作用需要適宜的溫度，用溫水浸泡衣物可以縮短衣物的浸泡時

間，加快洗滌。

(2)(教材P48“練習.2”解答)某同學打算用絲綢作實驗材料探討含蛋白酶

洗衣粉的洗滌效果，合適嗎？為什么？

提示不合適。因為絲綢的主要成分是蛋白質(zhì)，它會被加酶洗衣粉中的蛋白酶

分解，損壞衣物。

課題3酵母細胞的固定化

課題背景

1、問題：酶對環(huán)境條件敏感，易失活；溶液中的酶很難回收，不能再次利用，提高了生

產(chǎn)成本；反應后的酶會混合在產(chǎn)物中，如不除去，會影響產(chǎn)品質(zhì)量。

設想：將酶固定在不溶于水的載體上。

優(yōu)點：使酶既能與反應物接觸，又能與產(chǎn)物分離,同時，固定在載體上的酶還可以反

復利用。

2、問題：一種酶只能催化一種化學反應，而在生產(chǎn)實踐中，很多產(chǎn)物的形成都是通過一

系列的酶促反應才能得到的。

設想：將合成酶的細胞直接固定。

優(yōu)點：成本更低,操作更容易。

一、基礎知識

(-)固定化酶的應用實例

1、高果糖漿是指果糖含量為您左右的糖漿，能將葡萄糖轉化為果糖的酶是葡弱髓構

酸。

2、使用固定化酶技術，將這種酶固定在一種顆粒狀的載體上,再將這些酶顆粒裝到一個

反應柱內(nèi)，柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板。酶顆粒無法通過篩板的小孔，而反

應溶液卻可以自由出入。生產(chǎn)過程中，將葡萄糖溶液從反應柱的上端注入，使葡萄糖

溶液流過反應柱，與固定化葡萄糖異構酶接觸,轉化成果糖，從反應柱的下端流出。

反應柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量。

(二)固定化細胞技術

1、固定化酶和固定化細胞是利用物理或化生方法將酶或細胞固定在一定空間內(nèi)的技術,

包括包埋法、化學結合法和物理吸附法。

2、一般來說，酶更適合采用化學結合法和物理吸附法固定,而細胞多采用包埋法固定化。

這是因為細胞體積比酶分子的體積大；體積大的細胞難以被吸附或結合,而個小的酶

容易從包埋材料中漏出。

3、包埋法法固定化細胞，即將微生物細胞均勻地包埋在不溶于水的不溶于水的載體中。

常用的載體有明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺等。

二、實驗操作

(-)制備固定化酵母細胞

1.酵母細胞的活化

活化就是處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復正常的生活狀態(tài)。

2.配制物質(zhì)的量的濃度為0.05mol/L的CaCk溶液

3.配制海藻酸鈉溶液

加熱溶化海藻酸鈉時要注意小火間斷加熱,重復幾次,并不斷攪拌,直到海藻酸鈉

融化為止。如果加熱太快，海藻酸鈉會發(fā)生焦慢。

4.海藻酸鈉溶液與酵母菌細胞混合

將海藻酸鈉溶液冷卻至室遢，加入已活化的海藻酸鈉溶液，進行充分攪拌，使其混

合均勻,在轉移至注射器中。

5.固定化酵母細胞

以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到剛配制好的CaCL溶液中，并浸泡

30min（時間）左右。

（二）用固定化酵母細胞發(fā)酵

1.將固定好的酵母細胞（凝膠珠）用蒸鐳水沖洗2-3次。

2.將10%葡萄糖溶液轉移至錐形瓶中，加入固定好的酵母細胞，置于藥℃下發(fā)酵

24h（時間）。

三、結果分析與評價

（-）觀察凝膠珠的顏色和形狀

如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉濃度濃度傀低，該種凝膠珠包

埋的酵母細胞數(shù)目少，影響實驗效果；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海

藻酸鈉濃度濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。

（二）觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液

利用固定的酵母細胞發(fā)酵產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生了很多氣泡，同時會聞到遭味。

四、課題延伸

工業(yè)生產(chǎn)中，細胞的固定化技術是在嚴格無菌的條件下進行的。

【教材答案】

練習

1.答：直接使用酶、固定化酶和固定化細胞催化的優(yōu)缺點如下表所示。

類型優(yōu)點不足

對環(huán)境條件非常敏感，容易失渣；溶液中的酶很難

直接使用酶催化效率高,低耗能、低污染等?；厥?不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應后

酶會混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。

酶既能與反應物接觸,又能與產(chǎn)一種酶只能催化二種化學反應，而在生產(chǎn)實踐中，

固定化酶物分離,同時，固定在載體上的很多產(chǎn)物的形成都通過一系列的酶促反應才能得

酶還可以被反復利用。到的。

固定后的酶或細胞與反應物不容易接近，可能導致

固定化細胞成本低，操作更容易。

反應效果下降等。

3.提示：可以從酶的結構的多樣性，對理化條件的敏感程度等角度思考。

I歸納提煉I

(1)直接使用酶的三大缺點

①對環(huán)境條件非常敏感，容易失活。

②溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本。

③反應后酶會混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。

(2)固定化酶與固定化細胞的比較

固定化酶固定化細胞

固定酶的種類一種一系列

適用方法化學結合法、物理吸附法包埋法

酶既可與反應物結合，又可與產(chǎn)物分離，固成本低，操作容

優(yōu)點

特點定在載體上的酶可反復利用易

可能導致反應

缺點一種酶只能催化一種或一類化學反應

效率下降

固定化酵母細

實例固定化葡萄糖異構酶

胞

(1)海藻酸鈉溶液的濃度對包埋酵母細胞數(shù)量的影響

①海藻酸鈉溶液濃度過高，將很難形成凝膠珠。

②濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細胞數(shù)量少。

(2)配制海藻酸鈉溶液注意事項

①對海藻酸鈉溶化時要小火或間斷加熱，避免海藻酸鈉發(fā)生焦糊。

②將溶化后的海藻酸鈉先冷卻至室溫，再與酵母細胞混合，避免高溫殺死酵母細胞。

③固定化酵母細胞時，應將海藻酸鈉酵母細胞的混合液用注射器緩慢滴加到CaCl2

溶液中，而不是注射，以免影響凝膠珠的形成。

(3)CaCb溶液的作用：使海藻酸鈉膠體發(fā)生聚沉，形成凝膠珠。

專題五DNA和蛋白質(zhì)技術

課題一DNA的粗提取與鑒定

?提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

?DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點？要使DNA溶解，需要使用什么濃度？要

D

使DNA析出，又需要使用什么濃度？N

篇

解

在0.14mol/L時溶解度最?。惠^高濃度可使DNA溶解；0.14mol/L可使

度

DNA析出。

0.14

NaCl濃度(aol/L)

?在溶解細胞中的DNA時，人們通常選用2moi/LNaCl溶液：將DNA分子析C

出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸儲水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種

常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精(特別是95%冷卻酒精)，但細胞中蛋白質(zhì)可溶

于酒精。

從理論上分析，預冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降

解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減

少斷裂。

?采用DNA不溶于酒精的原理，可以達到什么目的？

將DNA和蛋白質(zhì)進一步分離。

?提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應選用

怎樣的酶和怎樣的溫度值？

蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會對DNA產(chǎn)生影響。溫度值為

60?80℃,因為該溫度值蛋白質(zhì)變性沉淀，而DNA不會變性。

補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術

中DNA變性溫度在95℃。

?洗滌劑在提取DNA中有何作用？

洗滌劑將細胞膜上的蛋白質(zhì)，從而瓦解細胞膜。

?當鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時，需要使用什么指示劑進行鑒定？

在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍色。

原理總結：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA,可以從細胞中提取和提純

DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開來，達到提純的目的；最后利用二苯胺試

劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。

實驗材料的選取

不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應本著DNA含量高、材料易得、便

于提取的原則。

本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材

料易得：二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離

心，對設備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。

雞血細胞破碎以后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少

DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。

破碎細胞，獲取含DNA的濾液

?若選用雞血和洋蔥作實驗材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？

在雞血細胞液中加入一定量蒸餛水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入

一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。

?為什么加入蒸儲水能使雞血細胞破裂？

答：蒸儲水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞

脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂（細胞膜和核膜的破裂），從而

釋放出DNA?

?在以上實驗中，加入蒸儲水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過濾時應當選用（濾

紙、尼龍布）。血細胞在蒸鐳水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細胞膜；食鹽溶解DNA

物質(zhì)；選用尼龍布進行過濾。

?在處理植物組織時需要進行研磨，其目的是什么？研磨不充分產(chǎn)生什么結果？

破碎細胞壁，使核物質(zhì)容易溶解在NaCl溶液中：研磨不充分會使DNA的提取量減少，影

響實驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。

。具體做法。10mL雞血+20mL蒸鐳水一同方向攪拌一3層尼龍布過濾一濾液

去除濾液中的雜質(zhì)

為什么反復地溶解與析出DNA,能夠去除雜質(zhì)？

用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA

析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復溶解與析出DNA,就能夠除去與

DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，需要進一步提純DNA。

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分

解蛋白質(zhì)，不分解DNA；方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。

方案二與方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用

的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。

析出與鑒定

?在濾液中仍然含有一些雜質(zhì)，怎樣除去這些雜質(zhì)呢？得到的DNA呈何顏色?

濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2?3分鐘，析出

的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。

?怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢？

具體做法。試管2支，編號甲乙一各加等量5mLNaCl溶液一

甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解一各加4mL二苯胺，混合均

勻一沸水浴5minf觀察顏色變化

實驗操作

制備雞血細胞液.......加檸檬酸鈉，靜置或離心

破碎細胞，釋放DNA…加蒸儲水，同一方向快速通方向攪拌

I-過濾，除去細胞壁、細胞膜等。

溶解核內(nèi)DNA........加入NaCl至2moi/L,同一方向緩慢攪拌

DNA析出............加蒸儲水至0.14mol/L,過濾，在溶解到2moi/L溶液中

I-除去細胞質(zhì)中的大部分物質(zhì)。

DNA初步純化.......與等體積95%冷卻酒精混合，析出白色絲狀物

If除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鑒定............二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍色

注意事項：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細胞懸液濃度；使

用塑料燒杯；使用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢（細胞破裂快速

攪拌）；玻棒不要碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。

五、課題延伸

本課題使用的洗滌劑是多組分的混合物,在嚴格的科學實驗中很少使用。實驗室提

取高純度的DAN時，通常使用十六烷基三甲基溪化錢（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）

或吐溫等化學試劑。

【教材答案】

（-）旁欄思考題

1.為什么加入蒸儲水能使雞血細胞破裂？

答：蒸儲水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞

脹裂,加上攪拌的機械作用,就加速了雞血細胞的破裂（細胞膜和核膜的破裂），從

而釋放出DNA。

2.加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？

答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜,有利于DNA的釋放;食鹽的主要成分是

NaCl,有利于DNA的溶解。

3.如果研磨不充分，會對實驗結果產(chǎn)生怎樣的影響？

答：研磨不充分會使細胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結果，

導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。

4.此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細胞成分？

答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。

5.為什么反復地溶解與析出DNA,能夠去除雜質(zhì)？

答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA

析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復溶解與析出DNA,就能夠除

去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

6.方案二與方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白,從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利

用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性,與DNA分離。

課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段

1、PCR：（多聚酶鏈式反應）。PCR儀實質(zhì)上是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器（可用3

個恒溫水浴鍋替代）。

2、原理:DNA的熱變性、DNA復制。

3、PCR與體內(nèi)復制的區(qū)別

①無解旋酶；②需耐高溫（Taq）DNA聚合酶；③用加熱代替ATP。

4、PCR的反應過程：變性（90℃）f復性（50℃）f延伸（72℃）

5、引物：

DNA的羥基（一0H）末端稱為3',而磷酸集團的末端稱為5'。引物總是以自己的5'

端與模板的3'端配對，DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸（即脫氧核甘酸

從引物的3'端連接）。

6、為避免污染，使用的儀器和試劑必須進行高壓滅菌。

7、PCR所用的緩沖液和酶應分成小份，在一20℃儲存。在冰塊上緩慢融化。

8、DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰。

計算公式：DNA含量（uL/mL）=50X（260nm的讀數(shù)）X稀釋倍數(shù)

課題3血紅蛋白的提取和分離

（1）方法及原理

方法原理

凝膠色譜法根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)

利用了各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身大小、形狀

電泳法

的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度進行分離

（2）實驗操作程序

樣品處理：紅細胞的洗滌一血紅蛋白的釋放一分離血紅蛋白溶液

粗分離：用透析法除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)

純化：用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離和純化

純度鑒定：用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電脈法來測定蛋臼質(zhì)的相對分子質(zhì)量,即對血紅蛋

白進行純度鑒定

1.凝膠色譜法

(1)結合上圖，根據(jù)凝膠色譜法的分離原理，填表分析不同大小的分子洗脫后的次序。

相對分子質(zhì)量大相對分子質(zhì)量小

直徑大小較大較小

運動方式垂直向下運動無規(guī)則的擴散運動

運動路程較短較長

運動速度較快較慢

洗脫次序先流出后流出

(2)結合上圖，分析為什么相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)會先從色譜柱中洗脫出來？

答案相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部，而被滯留；相對分

子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過。

(3)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時通過一次洗脫能否將所需蛋白質(zhì)與其他雜質(zhì)徹底分離？

答案不能。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠顆粒內(nèi)部，移動距離較近，移動

速度較快，先洗脫出來；但相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)可能進入凝膠顆粒內(nèi)部，也可能

不進入，導