《飼料及飼料原料中T-2毒素的快速篩查 膠體金快速定量法》

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DB36

江西省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB36/TXXXX—XXXX

飼料及飼料原料中T-2毒素的快速篩查

膠體金快速定量法

ScreeningofT-2ToxininFeedingStuffs

——RapidQuantitativeMethodofColloidalGoldTechnique

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XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

江西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DBXX/TXXX—XXX

目??次

前??言.............................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3原理...............................................................................1

4試劑和材料.........................................................................1

5儀器和設(shè)備.........................................................................1

6試樣制備與保存.....................................................................2

7分析步驟...........................................................................2

8結(jié)果表述...........................................................................2

9重復(fù)性.............................................................................2

附錄A（資料性附錄）膠體金免疫層析快速篩查組件試劑配制與技術(shù)要求.....................4

I

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飼料及飼料原料中T-2毒素的快速篩查膠體金快速定量法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用膠體金免疫層析法快速篩查測定飼料及飼料原料中T-2毒素，為定量篩查方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于大麥，玉米，玉米蛋白粉，燕麥，高粱，大豆粉，小麥等原料及飼料中T-2毒素的快

速定量篩查。檢測限為50μg/kg(ppb)，檢測范圍為50μg/kg(ppb)-10000μg/kg(ppb)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T20195動物飼料試樣的制備

GB/T27404實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測

3原理

本方法應(yīng)用了免疫層析原理。試樣提取液中的T-2毒素與檢測條中膠體金微粒發(fā)生反應(yīng)，T-2毒素與

膠體金微粒的結(jié)合物以及膠體金微粒在側(cè)流作用下移動，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測線時，檢測上包被的抗原與膠體金

微粒結(jié)合發(fā)生呈色反應(yīng)，顏色深淺與試樣中T-2毒素含量相關(guān)。用讀數(shù)儀測定檢測條上檢測線和質(zhì)控線

顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置曲線計算出試樣中T-2毒素含量。

4試劑和材料

除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682二級水的規(guī)定。

4.1膠體金免疫層析快速篩查組件（參見附錄A）。

4.1.1T-2毒素檢測試紙條：符合附錄A規(guī)定的檢測條產(chǎn)品，技術(shù)要求參考GB/T27404，按說明書要

求冷藏保存。

4.1.2稀釋緩沖液：與膠體金檢測條配套提供，或按照其說明書配制。

4.2提取液：70%（v/v）甲醇溶液或膠體金檢測條配套的提取液。

5儀器和設(shè)備

5.1天平:分度值0.01g。

5.2粉碎機(jī)：可使試樣粉碎后全部通過20目篩。

5.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。

5.4渦旋振蕩器。

5.5孵育器：可調(diào)節(jié)時間、溫度,控溫精度±1℃。

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5.6讀數(shù)儀：可測定并顯示膠體金定量檢測條的測定結(jié)果。

6試樣制備與保存

6.1試樣制備

按GB/T20195要求制備試樣。

6.2試樣保存

將試樣于-10℃～-20℃下避光保存。

7分析步驟

7.1樣品提取

7.1.1取有代表性的樣品500g，粉碎機(jī)（5.2）粉碎至全部通過20目篩,混勻。

7.1.2準(zhǔn)確稱取10.00g試樣于100mL具塞錐形瓶中，加入20.0mL試樣提取液（4.2），密閉，用渦旋

振蕩器（5.4）振蕩1min～2min，靜置后用濾紙過濾，或取1mL～1.5mL混合液于離心管中，用離心機(jī)

（4000r/min）（5.3）離心至少10秒。取濾液或離心后上清液100μL于另一離心管中，加入1.0mL

稀釋緩沖液（4.1.2），充分混勻待測。

7.1.3不同廠家的T-2毒素膠體金快速定量條所用的樣品制備方法不同，如提供T-2毒素膠體金快速

定量檢測條使用說明，則按照使用說明中規(guī)定的方法進(jìn)行操作。

7.2樣品測定

7.2.1將T-2毒素膠體金檢測條（4.1.1）從冷藏狀態(tài)（2℃-8℃）取出放置至室溫。將孵育器（5.5）

預(yù)熱至孵育溫度45℃。將檢測條（5.7）平放在孵育器（5.5）凹槽中，打開加樣槽。

7.2.2準(zhǔn)確移取300μL待測溶液（7.1.2），加入檢測條加樣孔中，關(guān)閉孵育器（5.5）蓋。

7.2.3孵育10min后，取出檢測條（4.1.1）觀察質(zhì)控線和檢測線顯色情況，必須出現(xiàn)清晰齊整的質(zhì)控

線即C線。若出現(xiàn)下述情況，視為檢測條無效：

a)C線（質(zhì)控線）不出現(xiàn)、彌散或嚴(yán)重不均勻；

b)T1或T2線（檢測線）嚴(yán)重不均勻；

c)待測溶液掩蓋或模糊了T1、T2線或C線；

d)膠體金顯色微粒沒有通過T1、T2線或C線。

7.2.4無效的檢測條（4.1.1）不要放入讀數(shù)儀（5.6）進(jìn)行測定。

7.2.5選取讀數(shù)儀（5.6）T-2毒素檢測頻道中“基質(zhì)00”（MATRIX00）樣品測定類型進(jìn)行測定，測定

需在2min內(nèi)完成，讀數(shù)儀（5.6）顯示樣品中T-2毒素的含量。

7.2.6若讀數(shù)儀（5.6）顯示“+250”，需將樣品稀釋后，讀數(shù)儀（5.6）設(shè)定為“基質(zhì)01”（MATRIX01）

樣品測定類型重新進(jìn)行測定。稀釋方法為：移取100μL稀釋提取液（7.1.2）于離心管中，加入1.0mL

稀釋緩沖液后混勻，按7.2.1-7.2.4重新測定。

8結(jié)果表述

T-2毒素含量以微克每千克（μg/kg，等同于ppb）表示，由讀數(shù)儀直接顯示和讀取。

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9重復(fù)性

在同一實驗室，由同一操作者使用相同儀器，按相同的測定方法，并在短時間內(nèi)對同一被測試對象

相互獨立進(jìn)行測試獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值大于算術(shù)平均值20%的情況不超過5%。

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AA

附錄A

（資料性附錄）

膠體金免疫層析快速篩查組件試劑配制與技術(shù)要求

A.1樣本稀釋液配制（根據(jù)說明書填寫）

磷酸二氫鉀0.2g

十二水合磷酸氫二鈉2.9g

氯化鈉8.0g

氯化鉀0.2g

Tween-200.5mL

加水定容至1000mL。

A.2基本要求

A.2.1工作環(huán)境要求

氣溫：23℃～25℃。

A.2.2抗原要求

T-2毒素半抗原與載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，能夠達(dá)到包被要求。

A.2.3抗體要求

用T-2毒素抗原免疫小鼠，制備針對T-2的特異性單克隆抗體，能夠達(dá)到檢測要求。

A.3原材料要求

A.3.1樣品墊：玻璃纖維或無紡布。

A.3.2金釋放墊：玻璃纖維片，免疫金釋放時間小于10min，釋放效率大于90%。

A.3.3反應(yīng)膜：硝酸纖維素膜，孔徑為0.45μm，4cm浸潤時間不小于140s。

A.3.4吸水紙。

A.3.5塑料卡盒：丙烯腈、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物。

A.4準(zhǔn)確度

采用100μg/kg（100ppb）、500μg/kg（500ppb）和1000μg/kg（1000ppb）三個濃度水平的陽性樣

品，每個濃度水平測定不低于6次，通過偏差來表達(dá)，3個濃度水平的偏差均應(yīng)控制在-20%～+20%之間。

A.5精密度