飼料中異噻唑啉酮類藥物的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 編制說明

1《飼料中異噻唑啉酮類化合物的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》編制說明（公開征求意見稿）唑啉酮類藥物的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》國家標(biāo)準(zhǔn)制定工作（計劃號：），服液）中檢出噻霉酮（1,2-苯并異噻唑啉-3-酮，BIT，C），份飼料添加劑中檢出甲基氯異噻唑啉酮（5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮，CIT，號：2682-20-4）。2023年，于7份飼料添加劑和復(fù)合添加劑預(yù)混合飼料中再次表12023年異噻唑啉酮類藥物的檢出情況2料肝病死亡[3-6]，部分國家或地區(qū)已對農(nóng)藥、化妝品等多種產(chǎn)品中異噻唑啉酮類藥定BIT最大殘留限量（MRL）為0.05～0.5mg/kg。GB9683NOSNOS（ab）圖13種異噻唑啉酮類藥物結(jié)構(gòu)式：（a）甲基異噻唑啉酮（MIT）；（b）甲基氯異噻唑啉酮（CIT）；（c）噻霉酮（BIT）2024年1月，上海市動物疫病預(yù)防控制中心（上海市獸藥飼料檢測所）、表2標(biāo)準(zhǔn)編制組成員與分工姓名職稱承擔(dān)任務(wù)黃士新推廣研究員項目主持人，負(fù)責(zé)項目的全面工作曹瑩正高級畜牧師標(biāo)準(zhǔn)方法技術(shù)論證樊霞研究員文本和編制說明修改完善嚴(yán)鳳高級畜牧師文本和編制說明修改完善張婧畜牧師檢測方法研究、標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明修改完善吳雨珊助理畜牧師檢測方法研究、標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明修改完善吳劍平高級畜牧師標(biāo)準(zhǔn)方法技術(shù)驗證王博畜牧師樣品采集、數(shù)據(jù)匯總處理商軍高級獸醫(yī)師標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明修改完善李俊研究員文本和編制說明修改完善谷旭研究員文本和編制說明修改完善42023年11月～2023年12月，標(biāo)準(zhǔn)編制組2024年5月，方法經(jīng)浙江省動物疫病預(yù)防控制中心、江蘇省獸藥飼料質(zhì)量方法各項技術(shù)指標(biāo)較好，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢出限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲5和編制說明進(jìn)行了修改完善，形成了標(biāo)準(zhǔn)文提出如下修改意見：1.建議標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“飼料中異噻唑啉酮類化合物的測增加精料補(bǔ)充料，并在編制說明中補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)據(jù)。3.優(yōu)化基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液線性范圍。4.補(bǔ)充添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑的高濃度（5000意見1：建議標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“飼料中異噻唑啉酮類化合物的測定液相色甲基氯異噻唑啉酮（CIT）、噻霉酮（BIT）均為異噻唑啉酮類化合物。原標(biāo)準(zhǔn)名6此，根據(jù)專家建議將標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“飼料中異噻唑啉酮類化合物的測定液相料中三種異噻唑啉酮類化合物的測定，標(biāo)準(zhǔn)適用具體結(jié)果見“2.1線性范圍”。添加劑的高濃度（5000μg/kg）添加回收試驗，具體結(jié)果見“2.6添加劑預(yù)混合7GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：2制定后的方法性能夠滿足相關(guān)飼料標(biāo)準(zhǔn)和飼料質(zhì)量安全監(jiān)3制定后的方法性具科學(xué)性、可靠性及普遍本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑和水，在沒有注明其他要求時，均指分析純試劑和GB/T6682中規(guī)定的一級水。試驗中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時，均指水溶200g，按照GB/T20195制備樣品，粉碎后過0ESI+離子化模式下，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測得各目標(biāo)物碎片離子情況選擇響應(yīng)較高的116.1>71.0和116.1>101.1作為MIT的定性離子對，其中8圖2異噻唑啉酮類藥物的二級碎片質(zhì)譜圖a）MITb）CITc）BIT依次優(yōu)化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜上鞘氣、輔助氣、掃吹氣、電離電壓、源溫度——采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM采集離子對信息見表39表3采集離子對信息注：帶“*”為定量離子對。表4液相梯度洗脫程序時間流速（mL/min）A相水B相甲醇（%）06.57.47.50.37070703090903030圖3不同流動相色譜圖（a）乙腈：水=30:70（V:Vb）甲醇：水=30:70（V:Vc）乙腈：0.01%甲酸=30:70（V:Vd）乙腈：0.05%甲酸=30:70（V:Ve）乙腈：0.1%甲酸=30:70（V:V）考慮到飼料基質(zhì)復(fù)雜的情況，在方法研制過程中，實驗比較了WatersHSS18圖4不同流動相色譜圖a）WatersHSST3(100mm×2.1mm，1.8μm)色譜柱b）PhenomenexKinetexXB-C18（100mm×2.1mm，2.6μm）色譜柱c）WatersACQUITYBEHC18(100mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱；（d）AgilentSB-C18(100mm×3.0mm,1.8μm)參考優(yōu)化后的色譜柱和流動相，確定液相條件如下。色譜柱：圖5基于SB-C18柱的標(biāo)準(zhǔn)品（異噻唑啉酮類化合物濃度15ng/mL）離子質(zhì)量色譜圖實驗向空白維生素預(yù)混合飼料添加劑基質(zhì)中添加3種異噻唑啉酮類化合如表5所示，結(jié)果表明，當(dāng)提取劑有甲醇時，飼料中MIT的提取效率較低；當(dāng)采用乙腈提取時，提取效率最優(yōu)。因此，實驗表5不同提取劑對飼料中三種異噻唑啉酮類化合物的提取效率（n=3）水在高于20mL后提取效果不再提升，故選擇20mL提取液。再分別將10mL、表6不同提取劑對飼料中三種異噻唑啉酮類化合物的提取效率（n=3）5表7不同提取劑時間對飼料中三種異噻唑啉酮類化合物的提取效率（n=3）5），率大體越來越差。同時，氮吹后的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品若超過30min未及時復(fù)溶，則MIT和CIT的回收率會進(jìn)一步降低。以上結(jié)果說明，MIT和CIT可能易在高溫圖6氮吹水浴加熱不同溫度下的影響mg/3mL）及使用前對HLB加入3mL甲醇淋洗活化（后稱為“活化H藥物不能很好在柱上保留，部分被洗脫導(dǎo)致?lián)p失；當(dāng)使用EMR時，MIT和BIT回收率較低；當(dāng)使用HLB（60mg/3mL）或活化HLB（60mg/3mL）時，BIT回收率較低，因此均不采用。當(dāng)采用直接稀釋法、PrimeHLB（60mg/3mL）和和重現(xiàn)性更好，因此，實驗選擇PrimeHLB（60mg/3mL）表8不同凈化條件對飼料中三種異噻唑啉酮類化合物的提取效率（n=3）基質(zhì)效應(yīng)可通過公式ME（%）=基質(zhì)溶液中分析物峰面積/純?nèi)軇┲蟹治鑫颩E低于85%時，則認(rèn)為基質(zhì)對目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；當(dāng)ME高于115%時，則認(rèn)為基質(zhì)對目標(biāo)化合物的響應(yīng)存在增強(qiáng)作用。如圖7所示，目標(biāo)藥圖7不同飼料基質(zhì)對目標(biāo)藥物的基質(zhì)效應(yīng)表9不同飼料基質(zhì)中目標(biāo)物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)r2圖8空白飼料試驗色譜圖（a）空白配合飼料b）空白濃縮飼料c）空白添加劑預(yù)混合飼料；（d）空白混合型飼料添加劑圖9配合飼料添加試驗色譜圖（a）配合飼料中添加10μg/kgb）配合飼料中添加30μg/kg圖10濃縮飼料添加試驗色譜圖（a）濃縮飼料中添加10μg/kgb）濃縮飼料中添加30μg/kg圖11添加劑預(yù)混合飼料添加試驗色譜圖（a）添加劑預(yù)混合飼料中添加10μg/kgb）添加劑預(yù)混合飼料中添加30μg/kg圖12混合型飼料添加劑試驗色譜圖（a）混合型飼料添加劑中添加10μg/kgb）混合型飼料添加劑中添加30μg/kg~~表10配合飼料中三種異噻唑啉酮類化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）批內(nèi)RSDRSD123123121.02.63.31.11.43.63123123190.322312316.23.623123表11濃縮飼料中三種異噻唑啉酮類化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）率RSD123123123123123123表12添加劑預(yù)混合飼料中三種異噻唑啉酮類化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）12312312312312312377.5279.1787.8573.9572.7785.211231231237.38.16.69.89.28.8表13混合型飼料添加劑中三種異噻唑啉酮類化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）123123123123123123123123123取配制好的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1mg/mL）于-1于2℃~8℃保存，分別在剛配制完、1個表14標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果36表15標(biāo)準(zhǔn)工作溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果藥物名稱相對偏差RD%13酯、丙酮、酸性甲醇和堿性甲醇進(jìn)行提取來表16不同提取劑對精料補(bǔ)充料中目標(biāo)藥物的提取效率（n=3）水//提取后，準(zhǔn)確取上清2mL分別考察以下方法凈化效果：HLB（60mg/3mL）、采用PrimeHLB（60mg/3mL）作為凈化用的固相色譜小柱效果更優(yōu)。綜表17不同凈化條件對精料補(bǔ)充料中三種異噻唑啉酮類化合物的凈化效果（n=3）//表18不同飼料基質(zhì)中目標(biāo)物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)r2圖13精料補(bǔ)充料試驗色譜圖（a）空白精料補(bǔ)充料b）精料補(bǔ)充料中添加10μg/kgc）精料補(bǔ)充料中添加30μg/kg~~結(jié)果均符合GB/T23182-2008《表19精料補(bǔ)充料中三種異噻唑啉酮類化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）123123123123123123123123123分別向空白的添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑中添加高濃度（5000μg/kg）的三種目標(biāo)物對照品，每個濃度平行測定5次，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。如表20所示，添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑中三表20添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑中高濃度目標(biāo)物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）12312312經(jīng)上述方法學(xué)驗證，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的線性范圍為0.25~50ng/mL，不同類飼料中三種異噻唑啉酮類藥物各濃度的批內(nèi)回收率在61.65%~106.60%添加劑預(yù)混合飼料及混合型飼料添加劑中三種和GB/T20195《動物飼料試樣的無藥使用。國標(biāo)委下達(dá)的制定計劃：飼料中異噻唑啉酮類藥異噻唑啉酮（CIT）、噻霉酮（BIT）均為異噻唑啉酮類[1].王磊,武紹峰與顧學(xué)斌,異噻唑啉酮類殺菌劑的應(yīng)用研究.工業(yè)微生物,2015.45(05):第60-64頁.[2].曲振斌,異噻唑啉酮類殺菌劑的應(yīng)用探究.化工設(shè)計通訊,2016.42(09):第103頁.[3].馬黎等,甲基異噻唑啉酮在健康人群和化妝品接觸性皮炎患者中引起皮膚反應(yīng)的限量研究.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2021.20(01):第24-27頁.[4].呂鵬等,甲基異噻唑啉酮對斑馬魚胚胎的急性毒性和機(jī)制研究.生態(tài)毒理學(xué)報,2017.12(05):第260-269頁.[5].Aerts,O.,etal