飼料中恩拉霉素的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法 編制說明

1《飼料中恩拉霉素的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法》編制說明（公開意見征求稿）（一）工作簡況2023年國家標準化管理委員會發(fā)布通知（國標委發(fā)），檢測所、通威股份有限公司和河南省農(nóng)畜水產(chǎn)品檢驗技術研飼料監(jiān)察所）共同承擔。本標準由全國飼料工業(yè)標準化技術委員會（SAC/TC76）恩拉霉素，又名恩來霉素、恩霉素、安來霉構成環(huán)狀多肽結構，脂肪酸位于多肽結構末端。根據(jù)其為恩拉霉素A(C107H138Cl2N26O31)和恩拉霉素于甲醇、含水乙醇，難溶于乙醇和丙酮，不溶于醋酸、氯素標準品對恩拉霉素A和恩拉霉素B的含量占比在商品說明恩拉霉素在飼料中具有很高的穩(wěn)定性，在室恩拉霉素對革蘭氏陽性菌有很強的活性，特別是力很強。長期使用后不容易產(chǎn)生抗藥性，因它改變了腸豬、雞對飼料中營養(yǎng)成分的利用率，促進豬、雞增重。4部公告第168號曾批準恩拉霉素預混劑可在飼料中長號，該文件規(guī)定自2020年1月1日起，退出除劑品種，其中包括恩拉霉素預混劑，并規(guī)定自2020年7月1168號和第220號廢止。2019年12量標準，注銷相關獸藥產(chǎn)品批準文號和進口獸藥注冊證書微生物學法》為微生物學法，采用大孔吸附樹脂進行凈素產(chǎn)生抑菌圈的大小來測定飼料中恩拉霉素含量。方法項目組接到標準修訂任務后，成立了工作組負責本標準的起草工作。對該標在2020年8月至9月期間通過大量查閱國內外有關文獻，熟練掌握了恩拉霉素的化學結構、理化特性等，并制定實施方案。2020年10月至2020年12月，針對飼料中恩拉霉素的檢測方法、儀器條件、方法線性、靈敏度和精確度等進行探索，并在實驗室進行了多次實驗，建立了恩拉霉素在不同飼料基質中的前處理方法，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)本方法能很好滿足飼料中恩拉霉素的檢測要求，2021年1月到6月批量2021年7月至2022年4月分別委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全監(jiān)督檢驗測試中心（寧波）、北京英太格瑞檢測技術有限公司、上海市獸藥飼料檢測所三家單位進行了復核試驗，不同實驗室間兩種藥物的平均回收率均在60%～120%范圍內，量與標準檢測技術研究所、中國農(nóng)業(yè)大學等25家涉及國內科研、教學和管理等領域的有關單位的教授、專家和技術人員征求意見。發(fā)函單位共計25個，回函單位20個，未回函單位5個；提出意見單位20采納93條，部分采納或不采納27條。然后對意見進行匯總處理，進一步對標準文2024年4月29日，上海市動物疫病預防控制中心（上海市獸藥飼料檢測審查。專家組由李云、李俊玲、樊霞、李宏、吳銀良、周煒、王金榮七位專家組成。在聽取起草專家匯報的基礎上?專家組審查了1.建議將方法檢出限和定量限統(tǒng)一為0.05m2.建議進一步完善2種標準系列溶液的制備方法及基質匹配標準系列溶液的采納。已在標準文件中細化標準系列溶液及基質匹配標準系列溶液的制備過采納。已補充相關數(shù)據(jù)。采用1mg/ml標準儲備液按照凈化步驟處理，最后將進樣濃度稀釋至100ng/mL，同時與標準儲備液直接稀釋至100ng/mL，通過峰面積比較兩者之間的偏差范圍在1.5%~3.48%，未發(fā)現(xiàn)固相萃取柱存在明顯過載效應，重復12341234720240619r1F2 7.88e6100790.5>1089(enramycinB 7.88e62.004.0020240619r1F2100790.5>95(enramycinB)%%5.142.64e6%%2.004.0020240619r1F1100785.7>1089(enramycinA) 2.004.0020240619r1F15.124.15e6100785.7>95(enramycinA5.124.15e60Time2.004.0020240619std100ngmlF2100790.5>10 20240619std100ngmlF2100790.5>95(enramy%%%%20240619std100ngmlF1100785.7>1089(enram 20240619std100ngmlF1100785.7>95(enramy0Time100785.7>95(enramy0Time（二）標準編制原則、主要內容及其確定依據(jù)用標準溶液在全掃描方式下，優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓、源度、脫溶劑氣流速8>1089.0、785.8＞95.1和785.8＞122.1，其中離子對785.8＞1089.0雖然響應不是94.88100-/785.17%% 179.06770.81687.41687.41/.w-.…M---·94.88100-/790.62% 108.93%/776.27 193.06688.20/393.24673.73I/393.24673.73I9（m/z）分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、恩拉霉素的響應影響，結果表明水相中加入易收到雜質干擾，最終選擇甲醇-0.1%甲酸水作為流動相。不同流動相下恩拉霉素15:55:47Enramycin0407-014.654.65%%aa1.002.00Enramycin0407-01100 %4.60%1.002.0016:52:08Enramycin0407-05100 %c%1.002.00Enramycin0407-051001.82 %%1.002.0016:28:49Enramycin0407-04 1002.24 2.192.36% 2.132.702.792.48% 2.132.702.79 3.203.554.161.002.00Enramycin0407-042.122.12 2.24%% 2.873.043.573.835.561.002.0017:22:16Enramycin0407-08%d%1.002.00Enramycin0407-082.872.87%%1.002.00：：0552.1.3.1配合料、濃縮料和精料補充考察了2%甲酸甲醇、1%三氟乙酸甲醇、0.1mol/L恩拉霉素A和恩拉霉素B標準品于試料中，加入20mL提對恩拉霉素的凈化條件進行考察，參考相關文獻，結水甲酸乙酸乙酯水醇ENV柱為反相固相萃取柱，需控制過柱液有機相比例。我們對配合料的提取溶液進行進一步優(yōu)化。考慮恩拉霉素易溶于稀鹽酸，并且甲醇-0.1mol甲醇-0.1mol/L鹽酸溶液（55對提取方法進行考察，比較了只超聲和超聲后渦旋振采用RetainPEP柱作為凈化柱，提取液宜5min。準確移取1mL上清液，加入0.1mol/L鹽酸溶液10mL，渦旋混勻，作為備用酯淋洗，抽干2min。加6mL0.1mol/L鹽酸甲醇溶液洗脫，抽干2.1.4.2預混合飼料、混合平行做兩份試驗。稱取試樣2g（精確至0.01g），于50mL離心管中，加入2%移取適量備用液通過RetainPEP固相萃取峰信噪比（S/N）都在3:1以上；③試樣色譜峰保留時間應與標準溶液的一致，容許偏差為±2.5%;④檢測到的離子豐度比應與標準溶液的一致，容許偏差達到歐基質效應值介于0.85和1.15之間表明無明顯基質效應，大于1.15是基質增強，小于應B20ZJ08122，純度為95%，恩拉霉素B貨號為B20ZJ08121，純度為8分別準確稱取恩拉霉素A和恩拉霉素B對照品各10mg（精確至0.01mg）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。準確吸取恩拉霉素A和恩拉霉素B標準儲備液各1詳見圖15和圖16。采用高效液相色譜-紫外檢測法考察標準溶液穩(wěn)定性，經(jīng)考察，恩拉霉素A標準儲備液穩(wěn)定性偏差為2.8取空白樣品，按提取凈化步驟處理得到空白基質溶液，精密量取適量混合標供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。以定量離子質量色譜峰面積為縱坐標，基質匹配標從表中可以看出在不同飼料基質中，恩拉霉素A和恩拉霉素B在2ng/mL~200Y=906.88X+18.9363Y=654.45X+2.1954Y=566.571X+12.5171Y=412.441X+29.7995Y=849.706X+23.7266Y=563.234X+0.08494Y=472.029X-99.0224Y=778.77X+123.938Y=485.327X+123.673Y=915.646X+55.331料Y=612.729X-17.0736Y=195.543X+9.37413Y=83.3961X+43.3276Y=317.427X+671.767料Y=187.373X+626.195Y=252.195X+95.6556Y=1026.61X+23.8751Y=880.481X+9.78548空白試樣按相同的步驟處理后，測定結果表明：在相應的保留時間，空白試）：料、豬濃縮料和預混合飼料中的添加回收情況。參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ1ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ12345512345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ1Ⅰ12345ⅠⅡⅢⅠ5.943.52ⅡⅢ5ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ14523ⅠⅡⅢⅠ85.990.78.575.78ⅡⅢⅠⅡⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠ85.894.980.996.096.496.891.487.194.189.886.897.687.889.291.583.784.688.391.995.897.45.813.983.043.6012345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ1ⅠⅡⅢⅠ4.605.08ⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ14523ⅠⅡⅢⅠ97.788.895.499.398.697.1ⅡⅢ1ⅠⅡⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠ12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ1ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ96.486.887.487.089.696.586.595.191.090.794.391.496.287.186.289.988.788.895.286.593.885.789.696.595.392.990.790.094.787.295.687.786.690.093.592.594.285.591.491.493.488.496.087.793.093.389.690.291.289.590.891.591.691.23.025.073.175.272.755.764.393.501.824.014.523.16ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ85.486.892.794.792.095.788.793.487.386.892.396.594.492.089.785.296.893.696.993.087.192.193.792.189.987.486.285.192.992.486.486.289.297.092.390.791.289.789.687.888.287.585.289.388.589.190.991.791.190.490.889.291.889.35.622.943.864.173.433.505.423.983.304.143.464.2412345ⅠⅡⅢⅠ98.487.391.493.687.779.081.983.194.778.894.882.479.296.583.784.487.188.683.399.789.486.087.088.68.328.616.578.647.49ⅡⅢ80.496.690.082.392.292.898.687.091.192.090.590.17.236.176.91ⅠⅡⅢⅠ88.687.684.789.089.682.881.195.781.698.396.480.380.794.283.993.181.196.093.8100.584.391.888.091.75.216.987.618.317.18ⅡⅢ85.384.784.684.493.582.278.889.594.986.387.485.47.673.177.08ⅠⅡⅢⅠ98.179.398.385.896.684.783.588.195.782.980.199.590.282.379.797.193.585.587.486.894.882.985.891.53.242.918.916.957.93ⅡⅢ96.785.493.278.783.092.395.799.393.589.892.489.15.928.636.87說明該方法對不同飼料樣品中，不同含量的測定均有較好的準確度。各種基質的Enramycin-20220323-1012:MRMof3ChannelsES+3.03100790.687>1089.09(EnramycinB)1.64e43.031004.174.102.022.274.104.403.75 0.822.754.403.75 0.822.755.005.7801.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-1011:MRMof3ChannelsES+1002.79785.84>1089.04(EnramycinA) 3.83e4 4.044.24 1.992.112.223.063.70 4.044.240Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-492:MRMof3ChannelsES+ 4.18e31001.822.082.184.25790.687>1089.09 4.18e33.822.244.311.694.43 0.811.524.75 1.752.743.822.244.311.694.43 0.811.524.75001.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-491:MRMof3ChannelsES+ 4.154.265.38e31004.23785.84>1089.04 4.154.265.38e32.094.104.302.212.012.613.664.051.761.764.410.820.821.5400Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-1072:MRMof3ChannelsES+1003.05790.687>1089.09(EnramycinB) %%2.032.1 1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-1071:MRMof3ChannelsES+1002.79785.84>1089.04(EnramycinA) 3.77e4%% 0Time0Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-332:MRMof3ChannelsES+1003.01790.687>1089.09(EnramycinB) 1.87e43.8302.102.373.763.8301.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-331:MRMof3ChannelsES+1002.77785.84>1089.04(EnramycinA) 1.39e50Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-252:MRMof3ChannelsES+1004.174.24790.687>1089.09(EnramycinB) 1.892.243.153.804.08 1.892.243.153.804.084.332.272.27 1.693.101.661.664.42 0.84 0.841.604.675.181.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-251:MRMof3ChannelsES+ 4.265.59e31004.18785.84>1089.04(EnramycinA)4.064.064.293.131.882.032.282.793.994.363.134.504.850Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-372:MRMof3ChannelsES+790.687>1089.09(EnramycinB)%% 1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-371:MRMof3ChannelsES+1002.77785.84>1089.04(EnramycinA) %%0Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-732:MRMof3ChannelsES+790.687>1089.09(EnramycinB)%% 1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-731:MRMof3ChannelsES+1002.79785.84>1089.04(EnramycinA) 2.28e4%%2.092.262.983.0Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-652:MRMof3ChannelsES+3.821002.16790.687>1089.09(EnramycinB)2.33e33.821002.16 2.062.223.013.784.252.000 0.213.013.784.252.0001.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-651:MRMof3ChannelsES+1002.172.503.644.24785.84>1089.04(EnramycinA) 1.34e32.731.90 1.973.334.10 1.34e32.731.903.285.280.811.234.493.285.280.811.234.49 0.171.575.366.026.216.7300Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-742:MRMof3ChannelsES+1003.04790.687>1089.09(EnramycinB) 8.48e33.822.432.623.784.1902.432.623.784.190