SNT 1196-2012 轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 玉米檢測(cè)方法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)玉米檢測(cè)方法2012-12-12發(fā)布2013-07-01實(shí)施本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草?！黾恿髓b定檢測(cè)玉米品系范圍，補(bǔ)充了MON863、NK603、TC1507、MON88017、59122、本標(biāo)準(zhǔn)參照ISO標(biāo)準(zhǔn)和歐盟聯(lián)合研究中心轉(zhuǎn)基因食物及飼料參考實(shí)驗(yàn)室(Communityreference法實(shí)時(shí)熒光PCR方法。12Cry9C:insecticidal-activeftruncatedproductidenticaltothatofCry9CgeneofBacillusthurIVR:invertase1genefrommaize,玉米的轉(zhuǎn)化酶1基因IVS2:intronfromthemaizealcoholdehydrogenasegene,玉米乙醇脫氫酶基因的基因內(nèi)區(qū)2mEPSPS:maize5-enolypyruvylshikimate-3-phosphatesynthase,來(lái)源于玉米的莽草酸羥基乙酰轉(zhuǎn)NOS:terminatorofnopaliPactin1:thepromoterderivedfromtherice(Oryzasativa)actin1gene,來(lái)源于玉米肌動(dòng)蛋白1PAT:phosphinothricinacetyltransferasegPCR:polymerasechainreTris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,36.2.970%乙醇。6.2.17UNG酶(UracilN-glycosylase)。6.4.2模板DNA提取4PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1,每個(gè)樣品各做兩個(gè)平行管。加樣時(shí)應(yīng)使樣品DNA溶液完全落入反應(yīng)液中，50μL反應(yīng)體系10×PCR緩沖液dNTP(含dUTP)引物模板DNA~6μg/L注：表中DNA模板為原料的模板量，加工產(chǎn)品可視加工程度適當(dāng)增模板量；也可根據(jù)具50℃PCR前去污染2min,94℃預(yù)變性2chin。94℃變性40s,55℃~58℃退火60s,72℃延伸用電泳緩沖液(1×TBE或TAE)制備%瓊脂糖凝膠(其中在55℃~60℃左右加入EB或其他染用針對(duì)玉米內(nèi)源基因IVR基因(或Zein基因)設(shè)計(jì)的引物對(duì)玉米DNA提取液進(jìn)行PCR測(cè)試，待測(cè)樣品應(yīng)被擴(kuò)增出226bp(或173bp)的PCR產(chǎn)物。如未見(jiàn)有該P(yáng)CR產(chǎn)物擴(kuò)增，則說(shuō)明DNA提取質(zhì)對(duì)玉米樣品DNA提取液進(jìn)行外源基因的PCR測(cè)試，如果陰性目標(biāo)DNA對(duì)照和擴(kuò)增試劑對(duì)照未5TC1507、MON863、NK603、Bt10的結(jié)構(gòu)特異性基因或品系特異性基因，以確定是何種轉(zhuǎn)基因玉米見(jiàn)6.4.1。7.4.2模板DNA提取見(jiàn)6.4.2。6終濃度μL/反應(yīng)10×PCR反應(yīng)緩沖液5MgCI,(25mmol/L.)51111UNG酶(1U/μL)111Taq酶(5U/μL)DNA模板(40ng/μL～50ng/μL)5 注：表中DNA模板為原料的模板量，加工產(chǎn)品可視加工程度適當(dāng)增加模板量；也可根據(jù)具表3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系(2)終濃度μL/反應(yīng)TaqManUniversalPCRMasterMix(2×)DNA模板(40ng/μL～50ng/μL)注：表中DNA模板為原料的模板量，加工產(chǎn)品可視加工程度適當(dāng)增加模板量；也可根據(jù)具實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)為：50℃PCR前去污染2min;預(yù)變性95℃10min;95℃15s,7按預(yù)先設(shè)定的樣品擺放順序?qū)CR反應(yīng)管依次擺放(上機(jī)前應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器),開(kāi)始運(yùn)行儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束并分析結(jié)果后，應(yīng)設(shè)置無(wú)效基線范圍。無(wú)論采用任何熒光通道(FAM或TET),基線范圍選擇在3～15個(gè)循環(huán)，如果有強(qiáng)陽(yáng)性樣本，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過(guò)正常陰性目標(biāo)DNA對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值=40為準(zhǔn)。擴(kuò)增試劑對(duì)照：外源基因檢測(cè)Ct值大于或等于40,內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值大于或等于40。若篩選檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，則需進(jìn)一步鑒定檢測(cè)MON810、Bt11、Bt176、T14/T25、CBH351、GA21、待測(cè)樣品外源基因檢測(cè)Ct值大于或等于40,內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值小于或等于24,設(shè)置的對(duì)照結(jié)果待測(cè)樣品外源基因檢測(cè)Ct值小于或等于36,內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值小于或等于24,設(shè)置的對(duì)照結(jié)果待測(cè)樣品外源基因檢測(cè)Ct值在36～40之間，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct89(規(guī)范性附錄)表A.1檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)、外源基因所需的引物信息類別引物序列內(nèi)源內(nèi)源5’-ccgctgtatcacaaggg5'-ggagccggtgtagagcatgacgate-3”5'-gatagtgggatigtgcgtca-3’5'-tcatccctacgtcagtggag-3’5'-ttatcctagtttgcgcgcta-3’5'-attgcgggactctaatcata-3’5'-cgccttgagcctggcgaacag5'-gtcgcatgtctctggagag/3’5'-gcaadcaaccaagggtatc-3’5'-actcggccgtccagtegta3’5'-ctgggaggccaaggtatctaat-3’5'-gctgctgtagctggcctaatct-3’5'-tcgaaggacgaaggactctaacg-3’5'-tccatctttgggaccactgtcg-3’5'-gatgttgggttgttgtccat-3’5’-ctctcgccgttcatgttcgt-3’5'-ggtcaggctcaggctgatgt-3’5'-atggtggatggcatgatgttg-3’5'-tgagcgaaaccctataagaaccc-3’內(nèi)內(nèi)源基因篩選檢測(cè)篩選檢測(cè)篩選檢測(cè)篩選檢測(cè)篩選檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)任選其一任選其一任選其一品系表A.1(續(xù))類別引物序列5'-ccttcgcaagaccctcctctata-3’5’-agatcatcaatccactcttgtggtg-3’5'-gtagctgtcggtgtagtcctcgt-3’5'-tactacatcgaccgcatcga-3’5'-cctaattcccttatctggga-3’5'-tctcgatctttggccttggta-3’5'-tgcagcccagcttatcgtcta-3’5'-acggtggaagagttcaatgtatg-3’5'-tctccttatgggctgca-3’5'-cttgtggtgtttgtggctct-3’5'-tggctcctccttcgtatgt-3’5'-gcactcaaagacctggcgaatga-3’5'-ccatctttgggaccactgtcg-3’5'-atgaatgacctcgagtaatcttgttaa-3’5'-aagagataacaggatccactcaaacact-3’5-gggaataagggcgacacgg-3’鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)鑒定檢測(cè)引物序列5’標(biāo)記FAM;3'標(biāo)記TAMRA或Eclipse適用范圍(內(nèi)源基因)5'-tgaacccatgcatgcagt-3’5’-ggcaagaccattggtga-3’任選其一(內(nèi)源基因)5'-cgtcgtttcccatctcttcctcc-3’5'-aatcagggctcattctcgctcctca-3’5'-cgacagtggtcccaaaga-3’5'-aagacgtggttggaacgtcttc-3’5'-tggacccccacccacgaggagcatc-3’5'-atcgttcaaacatttggca-3’5'-attgcgggactctaatcata-3’5'-acaagcacggtcaacacc-3’5'-actcggccgtccagtcgta-3’5'-ccgagccgcaggaaccgcaggag-3’5'-gtcgacatgtctccggagag-3’5’-gcaaccaaccaagggtatc-3’5'-tggccgcggttgtgatatcgttaa-3’表A.2(續(xù))引物序列5’標(biāo)記FAM;3”標(biāo)記TAMRA或Eclipse適用范圍BTl1品系BT176品系TC1507品系NK603品系59122品系MIR604品系MIR162品系5’-gcacgaggaagcggtca-3’5'-cgcgactggatcaggtaca-3’5'-tggggaacaggctcacgat-3’5'-tgtgtggccatttatcatcga-3’5'-gacttcagcctgccggtact-3’5'-gtgcatcaatggaggagagaac-3’5'-cgttctgggaaggatagaatcgtc-3’5'-cttatcgttatgctatttgcaactttaga-3’5'-gatgccttctccctagtgttga-3’5'-ggatgcactcgttgatgtttg-3’5'-tgttacggcctaaatgctgaact-3’5'-ttctccatattgaccatcatactcatt-3’5'-cggtatctataataccgtggtttttaaa-3’5'-tagtcttcggccagaatgg-3’5'-ctttgccaagatcaagcg-3’5'-atgaatgacctcgagtaagcttgttaa-3’5'-aagagataacaggatccac5'-acaagcgtgtcgtgctccac-3’5’-cacacaggagattattatagggttactca-3’5'-acacggaaatgttgaatactcatactct-3’5'-gagcaggacctgcagaagct-3’5'-tccggagttgaccatcca-3’5'-gggataagcaagtaaaagcgctc-3’5'-ccttaattctccgctcatgatcag-3’5'-ggtcataacgtgactcccttaattct-3’5'-caccttcagcaacccgaacta-3’5'-cacccagccggccacagtcgat-3’5'-ccgccgcgagctgaccctgaccgtg-3’5'-ttccatgaccaaaatcccttaacgtgagt-3’5'-agataccaagcggccat5'-tggaacacccatccgaacaagtagggtca-3’5'-atccccggaaattatg5'-tggtaccacgcgacacacttccactc-3’5'-tcattgagtcgttccgccattgtcg-3’5'-aataaccctgataaatgcttca-3’5'-tcccgccttcagtttaaacagagtcgggt-3’5'-tttaaactgaaggcggg5'-aggcgggaaacgacaatctgatcatg-3’5'-gtcctcgtcgctgcccttcacct-3’品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定表A.2(續(xù))引物序列5'標(biāo)記FAM;3’標(biāo)記TAMRA或Eclipse適用范圍DBT418品系LY038品系3272品系DP98140品系5'-gtcatttcaggaccaggattcac-3’5'-cctctattctggatgttgttgcc-3’5'-tgggttcagtctgcgaatgtt-3’5'-aggaattcgatatcaagcttatcga-3’5'-tcatcagaccagattctcttatgg-3’5'-cgtttcccgccttcagtta-3’5'-ctctatcgatccccctctttga-3’5'-gactcccttaattctccgctca-3’5’-ggaggcgacttggttaggctgaattcttc-3’5'-cgagcggagtttatgggtcgacgg-3’5'-actgctgacgcggccaaacactg-3’5'-tcagattgtcgtttcccgccttcagt-3’品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系鑒定品系名稱轉(zhuǎn)入的外源基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)基因P-35不PSP-mt,UbiQNOS,NOS,NOS,NOS不詳[1]Protocolforevent-specificquantitationofBtllinmaize,EU-CRL.[2]Foodstuffs-Methodsofanalysisforthedetectionofderivedproducts-qualitativenucleicacidbasedmethods,prENISO21570.[3]Event-specificmethodforthequantitati[4]Event-specificmethodforthequantitationofmaizelineMON863us[5]Event-specificMethodfortheQuantificationofMaize[6]Event-specificmethodforthequantitationofmaizeli[7]Event-specificmethodforthequan[8]Event-specificmethodforthequantitation[10]Event-specificmethodforthequantit[11]Event-specificmethodfo[12]Long,N.,Pulliam,D.,Bottoms,J.,Meghji,M.,Ha