豬鏈球菌病診斷技術(shù) 編制說明

1鏈球菌病相關國標和行標（GB/T1試驗操作規(guī)程；GB/T19915.2－2005豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程；GB/T-2005豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法；GB/T19915.8－2005豬鏈球菌2型的《豬鏈球菌病診斷技術(shù)》標準。為此，由南2341、標準編制遵循“先進性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的原則，注重2、標準編制格式符合GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)3、本次標準的修訂主要以原國家《GB/T19試管凝集試驗操作規(guī)程》、《GB/T19915.2－2005豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程》、《GB/T19915.3－2005豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術(shù)》、《GB/T19915.4-2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測方法》、《GB/T19915.5－2005豬鏈球菌2型多5保存與運輸，馬鏈球菌獸疫亞種、豬鏈球菌等主要致病菌普通和熒光PCR方法、主要內(nèi)容包括技術(shù)指標、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則等。要求，之前的規(guī)范和標準已不能適應新形勢球菌獸疫亞種的檢測，除了PCR方法，還增加了敏感性控技術(shù)研究與示范》（200803016）和《豬鏈球菌病防控技術(shù)研究與示范》（201303041）項目，圍繞豬鏈球菌病應急防控、流行病學調(diào)查、致病機制、檢學技術(shù)二等獎，山東省農(nóng)牧漁業(yè)豐收獎成果獎二等獎、四川省科學技術(shù)三等獎，6——增加了豬鏈球菌通用PCR試驗（見5——增加了豬鏈球菌7型PCR試驗（見6——增加了豬鏈球菌9型PCR試驗（見6——增加了豬鏈球菌通用熒光PCR試驗（見5——增加了豬鏈球菌2型熒光PCR試驗（見6——增加了豬鏈球菌7型熒光PCR試驗（見6——增加了豬鏈球菌9型熒光PCR試驗（見6——增加了馬鏈球菌獸疫亞種PCR試驗（見6——增加了馬鏈球菌獸疫亞種熒光PCR試驗（見57Diseasesofswine,2019:934-950.）等文獻方法，同時依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《豬鏈球菌病監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（NY/T《豬2型鏈球菌病防治技術(shù)規(guī)范》（DB51/T1103—2018）等標準中的相關描述，Streptococcosis[J].Diseasesofswine,2019:934-950.）等文獻方法，同時參考發(fā)現(xiàn)疑似鏈球菌病病例時，應在同一豬群的不同個體或同一個體不同組織中分離；因該菌在健康豬肺中存在，故患敗血癥的病豬應優(yōu)先從采取肺臟以外的其它組織進行分離；患有腦膜炎病豬，應采取腦脊液進行分離培養(yǎng)。8（1）采樣前的準備。采樣人員應具備相應的專業(yè)知識和采樣的基本技能；Streptococcosis[J].Diseasesofswine,2019:934-950.《伯杰氏系統(tǒng)細菌學ManualofSystematicBacteriology,SecondEdition,VolumeThree,TheFirmicutes[M].Heidelberg:Springer.2009：655-710.《獸醫(yī)微生物學》第六版（陸承平，劉永杰.2021.獸醫(yī)微生物學[M].第6版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版，9分離豬鏈球菌時采用THB選擇性增菌液培養(yǎng)基和THB綿羊血平板選擇性培養(yǎng)基。個卵圓形，在液體培養(yǎng)中才呈短鏈狀。馬鏈球菌獸疫亞種菌株大部分菌株形成左右，產(chǎn)生明顯的β溶血。革蘭氏染色均為陽性鏈狀球菌，固體培養(yǎng)基中呈短鏈排列，液體中細菌呈8~12節(jié)長鏈狀排列。2014-2015年在廣州周邊地區(qū)共采集488份屠宰豬群扁桃體樣品和）；病的仔豬氣管中分離出1株豬鏈球菌強毒株，命名為SS2011GZ（畜牧與獸）；）；其分解或利用糖類等，建立其生化鑒定方法。方法建立的主要參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》，第二版，第三卷（2009年VosPD,GarrityGM.,JonesD.,etal.Bergey’sManualofSystematicBacteriology,SecondEdition,VolumeThree,TheFirmicutes[M].Heidelberg:Springer.2009：655-710.）；《獸醫(yī)微生物學》第六版（陸承平，劉永杰.2021.獸醫(yī)微生物學[M].第6版.北京：中國生化反應是定性反應，結(jié)果以陽性（+陰性（-）和產(chǎn)氣（O）顯示。微量生化試驗可用于鏈球菌的細菌鑒定，并己積累了大量的經(jīng)驗，但鏈球菌生驗最好還是與血清學、PCR等鑒定方法結(jié)合起來。大多豬鏈球菌菌株具有下述特性：在富含淀粉的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生淀粉酶，VP反應陰性，6.5%NaCl抑制其生長，不能還原0.1%的美藍，能發(fā)酵菊粉和棉子糖，七葉苷水解陽性，粉的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生淀粉酶，V-P反應陰性，6.5%Nacl抑制其生長，不見表4-1，目前已開發(fā)出商業(yè)化鑒定系統(tǒng)用于臨床鏈球菌分離株的鑒定，見表4-2。但由于鏈球菌生化特征變化較大，所以只能作菌種D--G--C--S.dysgalactiaessp.equis--C--S.equissp.zooepidemicusS.equissp.equisimilisC類豬鏈球菌S.ρorcinusD-----肺炎鏈球菌S.pneumoniae---化膿鏈球菌S.pyogenesA--R、S---+bioMerieuxbioMerieuxbioMerieux），條和全自動生化分析儀對各代次之間進行了比較鑒定，結(jié)果表明傳代穩(wěn)定性好）；）；GottschalkM.AnupdateonStreptococcussuisidentification[J].JournalofVeterinaryDInvestigation,1990,2(3):249-25作為抗原進行多次重復免疫清潔級新西蘭白兔，可獲得豬鏈球菌2型、7型和9型參考菌株的高免血清（與濃度為4×109cfu/mL的參考菌株進行試管凝集，效價應清的制備及應用》，應用該特異性定型建立了豬鏈球菌2型、123456789NCTC10446NT77Pathogens2016,5(3).編本試驗對豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、多動物鏈球菌、嗜（M：Trans2Kmark；1：豬鏈球菌；2：馬鏈球菌氣單胞菌；6：肺炎克雷伯菌；7：停乳鏈參考文獻（OkuraM,etal.,:GeneticanalysisofcapsularpolysaccharidesynthesisgeneclustersfromallserotypesofStreptococcusforgenerationofcapsularvariation.Appliedandenvironme因的479-483bp位置序列為5’-CCTGG-3’，可被限制性核酸內(nèi)切酶MvaI識別，進行豬鏈球菌2型的鑒定，以cpsK基因片段的限制性核圖7-2豬鏈球菌2型cpsK片段經(jīng)酶切試驗 對實驗室收集的378份屠宰場健康豬扁桃體進行豬鏈球菌的分離培養(yǎng)及血通過分子雜交技術(shù)對比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關基因簇的GenBank公布的豬鏈球菌cps7H基因序列（JX986796.1設計了針對豬鏈球菌cps7H基因的特異性引物，并通過優(yōu)化引物濃度、退火溫度等反應體系和條件，建立了cps7HPCR檢測方法，并對該方法的敏感性、特異性等性能菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌2型及豬鏈球菌9bp2000250bp另外實驗室從廣州周邊地區(qū)健康豬群及屠宰豬群采集的共計體樣本中，共分離到豬鏈球菌222株，用建立的PCR方法鑒定bp2000750250通過分子雜交技術(shù)對比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關基因簇公布的cps9H基因序列（JX986798.1設PCR檢測方法，并對該方法的敏感性、特異性等性能進行了評估，可用于豬鏈bp2000250bp750500250另外實驗室從廣州周邊地區(qū)健康豬群及屠宰豬群共計758中，分離到豬鏈球菌222株，用建立的PCR方法鑒定出豬鏈球bp2000250本方法以豬鏈球菌種屬特異性基因recN作為靶基因，可用于豬鏈球菌所有Pathogens2016,5(3).編recN熒光PCR檢測方法，并對該方法37(10).通過分子雜交技術(shù)對比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關基火溫度等反應體系和條件，建立了cps2J熒光PCR檢測方法，并對該方法的參考文獻（Smith,H.E.,etal.,RapidPCRtestforStreptococcussuisserotype7.型菌株莢膜多糖合成相關基因簇的基因序列，發(fā)現(xiàn)莢膜多糖合成相關基因簇的重復性好、操作便捷等優(yōu)點，被廣泛應用于動物疫病診斷與監(jiān)測。本研究根據(jù)37(10).通過分子雜交技術(shù)對比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關基參考馬清霞等.豬鏈球菌病雙重PCR診斷方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學,2007,37(8):700-704.；DB3中是高度保守的，而且在馬鏈球菌獸疫亞種無gcagccctcttggttggtgtggcagctgtatcagcagattctgttgagtcagctaagcctgtagcagtttagatagtgaagccgcagctacaaaggcagaagctgatctagttgctgcaaaagcagacctagcagccaatcacagctgcaaaagctgaatttgacaccgctcaagcagacttagctaccgctgaagctactataaaaaatggctgagttagaaagcaaaattcaagaaaagcaaaaagagctagaggacatcattcgtaaaccatgcagctatcggtggtcgtaatggagacgctM、DL-2000Marker；1~13equiSubspecieszooepidemic列（CP002904.1設計了針對SzM基鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株有特異性擴增曲構(gòu)建的含SzM基因目的片段的陽性質(zhì)粒，分光果顯示標準品起始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)具有良好2型等主要致病菌是一種非常重要的人獸共患病原菌，對豬鏈球菌病的有效控制本標準將提高了我國豬鏈球菌病診斷能力，預期培訓國內(nèi)外診斷技術(shù)人員10000余人次，提高豬鏈球菌病疫情研判效率，減少由豬鏈球菌病造成的生豬患上述標準中，主要涉及豬鏈球菌2型分離鑒定、血清抗體檢測、PCR檢測和節(jié)炎等為主要臨床癥狀的豬傳染性疾病，其主要病原是豬鏈球菌的某些血清型（主要為2、7和9型）和馬鏈球菌獸疫亞二是部分內(nèi)容填補了國內(nèi)標準的空白。本標準增鑒定”中馬鏈球菌獸疫亞種生化鑒定、“9豬鏈球菌通用PCR試驗”、“11豬鏈球“15豬鏈球菌7型熒光PCR試驗”、“16豬鏈球菌9型熒光PCR試驗”、“17馬鏈球“6豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種的分離培養(yǎng)”中的豬鏈球菌分離培養(yǎng)、“7生化鑒定”中豬鏈球菌生化鑒定、“8豬鏈球菌鏈球菌2型PCR試驗”、“14豬鏈球菌2型熒光PCR試驗”等6部分雖與上述7項標準相似，但具有明顯的先進性，以下就每項內(nèi)容與國內(nèi)標準“4.4.2分離培養(yǎng)”中使用的普通瓊脂綿羊血平板，使豬鏈球菌的生長緩慢，培養(yǎng)周期長，本標準“6.3.2分離培養(yǎng)”中使用的THB綿羊血平板，可減少其本標準“6.3.2分離培養(yǎng)”中使用的THB綿羊血平板從血液、關節(jié)液、病料分離培化鑒定”中七葉苷發(fā)酵反應不穩(wěn)定，假陽性率和假陰性率高，本標準“6.3.4豬鏈球菌生化鑒定”去除了七葉苷發(fā)酵反應，避免錯誤判定；國內(nèi)標準“4.4.6豬鏈球菌2型定型PCR檢測”僅能對2型進行PCR鑒定，本標準“9豬鏈球菌種特異性PCR規(guī)程》，本標準是對豬鏈球菌2型、7型和9型的菌株進行血清學檢測，而不是對對比標準文件《GB/T19915.3－2005豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術(shù)》、率；標準《GB/T19915.4－2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測方法》將2型莢膜基因（cps2）、溶菌酶釋放蛋白基因（mrp）和orf2三個毒力基因作為致病菌株的對比標準文件《GB/T19915.6－2005豬鏈球菌2型通用熒光PCR檢測方法》方法》（GB/T19915.6-2005）和《豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法》（GB/T19915.7-2005）建立過程中能夠參考的豬鏈球菌的靶標基因序列為300而本標準參