GB-T 38132-2019 轉(zhuǎn)基因植物品系定量檢測(cè)數(shù)字PCR法

ICS07.080A40中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因植物品系定量檢測(cè)數(shù)字PCR法QPCR2019-10-18發(fā)布2019-10-18實(shí)施國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局ⅠGB／T38132—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由全國生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC387)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院、蘇州百源基因技術(shù)有限公司、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、中國測(cè)試技術(shù)研究院生物研究所、甘肅國研檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司、四川出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、中國科學(xué)院上海高等研究院。1GB／T38132—2019轉(zhuǎn)基因植物品系定量檢測(cè)數(shù)字PCR法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因植物品系的數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于種子及物理加工種子樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系、MON89034品系、MIR162品系，轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2品系，轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻品系，轉(zhuǎn)基因棉花GHB119品系，轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的數(shù)字PCR法定量檢測(cè)。本方法的定量檢測(cè)限為0.質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣方法SN/T4853（所有部分）轉(zhuǎn)基因大米定量檢測(cè)數(shù)字PCR法3術(shù)語和定義、縮略語下列術(shù)語和定義適用于本文件。品系特異序列外源DNA片段插入受體作物基因組后重組產(chǎn)生的鄰接區(qū)序列。下列縮略語適用于本文件。玉米乙醇脫氫酶基因(乙醇脫氫酶基因(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(磷脂酰膽堿磷脂水解酶基因(數(shù)字PCR其技術(shù)原理是通過將原始PCR反應(yīng)體系進(jìn)行分割，進(jìn)而對(duì)所有小的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增并后續(xù)檢測(cè)。通過對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行有限的分割，從而使整個(gè)反應(yīng)體系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速地對(duì)痕量的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定。2GB／T38132—2019目前數(shù)字PCR包括芯片式數(shù)字PCR和微滴式數(shù)字PCR兩種。芯片式數(shù)字PCR通過微流控芯片實(shí)現(xiàn)對(duì)原始反應(yīng)體系的分割，這種分割方式具有穩(wěn)定性好、均一性好的優(yōu)點(diǎn)，但試驗(yàn)成本相對(duì)較高；微滴式數(shù)字PCR通過產(chǎn)生微小油包水體系實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的分割，這種分割方式反應(yīng)速度快，分割成本更低。為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物品系數(shù)字PCR定量檢測(cè)，本標(biāo)準(zhǔn)通過數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)直接得出轉(zhuǎn)基因植物外源基因（品系特異序列）和植物內(nèi)源基因的拷貝數(shù)含量。樣品DNA中的外源基因和內(nèi)源基因的拷貝數(shù)的比值（百分?jǐn)?shù)）即為樣品中相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物品系的相對(duì)百分含量。5試劑和材料除另有說明，本方法使用的試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1植物基因組DNA提取試劑盒：推薦針對(duì)不同的樣品選取不同的基因組提取試劑盒。數(shù)字聚合酶的數(shù)字PCR專用預(yù)混試劑，推薦按照不同的數(shù)字PCR儀說明書選擇。5.3引物及探針：檢測(cè)不同植物品系的引物探針序列具體信息見表1。擴(kuò)增序列的信息參見附錄A。表1轉(zhuǎn)基因植物外源基因及內(nèi)源基因的引物和探針序列靶標(biāo)類別名稱序列玉米MON810品系特異序列外源上游引物GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGA下游引物GGATGCACTCGTTGATGTTTG探針FAM-AGATACCAAGCGGCCATGGACAACAA-BHQ1玉米MON89034品系特異序列外源上游引物TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT下游引物CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA探針FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGB玉米MIR162品系特異序列外源上游引物CACCTTCAGCAACCCGAACTA下游引物GCTTAGCCTCCACGATCATCTT探針FAM-GTCCTCGTCGCTGCCCTTCACCT-BHQ1玉米基因內(nèi)源上游引物CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC下游引物CCACTCCGAGACCCTCAGTC探針VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1大豆GTS-40-3-2品系特異序列外源上游引物TAGCATCTACATATAGCTTC下游引物GACCAGGCCATTCGCCTCA探針FAM-ACAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGA-BHQ1大豆基因內(nèi)源上游引物GCCCTCTACTCCACCCCCA下游引物GCCCATCTGCAAGCCTTTTT探針VIC-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1水稻克螟稻品系特異序列外源上游引物TCCGCAATGTGTATTAAGTTGTCTAA下游引物CCGATATGCCTGCCCATCT探針FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCCG-BHQ13GB／T38132—2019靶標(biāo)類別名稱序列水稻基因PLD內(nèi)源上游引物TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT下游引物CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC探針VIC-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1棉花GHB119品系特異序列外源上游引物CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA下游引物GAAATTGCGTGACTCAAATTCC探針FAM-CCTGCAGGTCGACGGCCGAGTAC-BHQ1棉花基因Adhc內(nèi)源上游引物CACATGACTTAGCCCATCTTTGC下游引物CCCACCCTTTTTTGGTTTAGC探針FAM-TGCAGGTTTTGGTGCCACTGTGAATG-BHQ1油菜RT73品系特異序列外源上游引物CCATATTGACCATCATACTCATTGCT下游引物GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA探針FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-BHQ1油菜基因PEP內(nèi)源上游引物CCCTTGTGAAGCTCGACATC下游引物CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT探針FAM-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-BHQ16儀器與設(shè)備6.1數(shù)字PCR儀。6.3生物安全柜。6.4核酸定量?jī)x。6.5渦旋振蕩儀。移液槍量程量程量程量程7操作步驟按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。7.3DNA模板制備按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。4GB／T38132—20197.4DNA模板濃度控制采用熒光定量試劑盒或其他具有等效結(jié)果的核酸定量?jī)x或方法測(cè)定DNA溶液的濃度，具體操作步驟參照相關(guān)儀器或試劑盒說明書。然后根據(jù)植物基因組的相對(duì)分子質(zhì)量大小計(jì)算DNA的拷貝數(shù)濃度。濃度要求符合SN/T4853的規(guī)定。7.5數(shù)字PCR擴(kuò)增方法7.5.1數(shù)字PCR反應(yīng)體系轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系、MON89034品系、MIR162品系，轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2品系，轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻品系采用雙重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系見表2。轉(zhuǎn)基因棉花GHB119品系，轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系采用單重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系見表3。數(shù)字PCR反應(yīng)體系的總體積可根據(jù)不同廠家、型號(hào)的數(shù)字PCR儀做相應(yīng)調(diào)整，并保持各引物探針組分終濃度不變。每個(gè)DNA模板應(yīng)進(jìn)行3個(gè)平行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)。表2雙重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)試劑終濃度體積內(nèi)源基因探針(5數(shù)字PCR預(yù)混液1×DNA模板 —表3單重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)試劑終濃度體積數(shù)字PCR預(yù)混液1×DNA模板— 7.5.2數(shù)字PCR反應(yīng)程序數(shù)字PCR反應(yīng)程序如表4和表5所示。5GB／T38132—2019表4微滴數(shù)字PCR的反應(yīng)程序步驟時(shí)間和溫度循環(huán)數(shù)熱激活及變性1退火延伸變性酶失活1表5芯片數(shù)字PCR反應(yīng)程序步驟時(shí)間和溫度循環(huán)數(shù)熱激活及變性1退火延伸變性退火延伸1注：不同芯片平臺(tái)可根據(jù)說明書對(duì)除退火延伸外步驟中的溫度和時(shí)間做相應(yīng)調(diào)整。7.5.3對(duì)照數(shù)字PCR反應(yīng)的設(shè)定試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。用含品系特異序列的轉(zhuǎn)基因植物品系基因組DNA做陽性對(duì)照，含相同內(nèi)源基因的非轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA做陰性對(duì)照，以水作為空白對(duì)照。各對(duì)照PCR反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及PCR反應(yīng)條件與7.5.1和7.5.2相同。8結(jié)果分析與表述根據(jù)數(shù)字PCR結(jié)果中陰性對(duì)照的終點(diǎn)熒光值設(shè)定閾值限，該閾值限應(yīng)將同一樣品中陰性反應(yīng)微小單元和陽性反應(yīng)微小單元有效區(qū)分。陰性對(duì)照有內(nèi)源基因擴(kuò)增且陰性對(duì)照和空白對(duì)照均無外源基因擴(kuò)增。擴(kuò)增平行重復(fù)測(cè)試結(jié)果（轉(zhuǎn)基因品系百分含量）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于或等于25%。以上要求其中一條不符合，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)，重新進(jìn)行的試驗(yàn)應(yīng)從制備測(cè)試樣品開始。按照式（1）計(jì)算測(cè)試樣品的轉(zhuǎn)基因品系百分含量：式中：犘—轉(zhuǎn)基因植物品系的百分含量；犃—轉(zhuǎn)基因植物品系外源基因拷貝數(shù)；犅—轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)源基因拷貝數(shù)。6GB／T38132—20198.3.1檢出物種內(nèi)源基因，但未檢出品系特異序列，結(jié)果表述為“樣品未檢出×品系轉(zhuǎn)基因成分。定量方法的檢測(cè)限為0.8.3.2檢出物種內(nèi)源基因，同時(shí)也檢出品系特異序列，結(jié)果表述為“樣品中×品系轉(zhuǎn)基因成分的含量GB／T38132—2019附錄A（資料性附錄）轉(zhuǎn)基因植物品系特異性擴(kuò)增序列A.1轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系特異性序列GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGACCAGTGTTACTCACATAGTCTTTGCTCATTTCATTGTA.2轉(zhuǎn)基因玉米MON89034品系特異性序列ACGGTATTATAGATACCGA.3轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系特異性序列CACCTTCAGCAACCCGAACTACGCCAAGGTGAAGGGCAGCGACGAGGACGCCAAGATGATCGTGGAGGCTAAGCA.4轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2品系特異性序列AGAACTGTTTGAGGCGAATGGCCTGGTCA.5轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻品系特異性序列