GB-T 38132-2019 轉基因植物品系定量檢測數(shù)字PCR法

ICS07.080A40中華人民共和國國家標準轉基因植物品系定量檢測數(shù)字PCR法QPCR2019-10-18發(fā)布2019-10-18實施國家市場監(jiān)督管理總局ⅠGB／T38132—2019本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由全國生化檢測標準化技術委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本標準起草單位：上海市計量測試技術研究院、蘇州百源基因技術有限公司、中國檢驗檢疫科學研究院、中國農業(yè)科學院生物技術研究所、中國測試技術研究院生物研究所、甘肅國研檢驗檢測有限公司、四川出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心、中國科學院上海高等研究院。1GB／T38132—2019轉基因植物品系定量檢測數(shù)字PCR法本標準規(guī)定了轉基因植物品系的數(shù)字PCR定量檢測方法。本標準適用于種子及物理加工種子樣品中轉基因玉米MON810品系、MON89034品系、MIR162品系，轉基因大豆GTS-40-3-2品系，轉基因水稻克螟稻品系，轉基因棉花GHB119品系，轉基因油菜RT73品系的數(shù)字PCR法定量檢測。本方法的定量檢測限為0.質量分數(shù)）。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T19495.1轉基因產品檢測通用要求和定義GB/T19495.3轉基因產品檢測核酸提取純化方法GB/T19495.7轉基因產品檢測抽樣和制樣方法SN/T4853（所有部分）轉基因大米定量檢測數(shù)字PCR法3術語和定義、縮略語下列術語和定義適用于本文件。品系特異序列外源DNA片段插入受體作物基因組后重組產生的鄰接區(qū)序列。下列縮略語適用于本文件。玉米乙醇脫氫酶基因(乙醇脫氫酶基因(聚合酶鏈式反應(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(磷脂酰膽堿磷脂水解酶基因(數(shù)字PCR其技術原理是通過將原始PCR反應體系進行分割，進而對所有小的反應體系進行擴增并后續(xù)檢測。通過對反應體系進行有限的分割，從而使整個反應體系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加穩(wěn)定、準確、快速地對痕量的轉基因成分進行精準鑒定。2GB／T38132—2019目前數(shù)字PCR包括芯片式數(shù)字PCR和微滴式數(shù)字PCR兩種。芯片式數(shù)字PCR通過微流控芯片實現(xiàn)對原始反應體系的分割，這種分割方式具有穩(wěn)定性好、均一性好的優(yōu)點，但試驗成本相對較高；微滴式數(shù)字PCR通過產生微小油包水體系實現(xiàn)反應體系的分割，這種分割方式反應速度快，分割成本更低。為了實現(xiàn)轉基因植物品系數(shù)字PCR定量檢測，本標準通過數(shù)字PCR擴增反應直接得出轉基因植物外源基因（品系特異序列）和植物內源基因的拷貝數(shù)含量。樣品DNA中的外源基因和內源基因的拷貝數(shù)的比值（百分數(shù)）即為樣品中相應的轉基因植物品系的相對百分含量。5試劑和材料除另有說明，本方法使用的試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1植物基因組DNA提取試劑盒：推薦針對不同的樣品選取不同的基因組提取試劑盒。數(shù)字聚合酶的數(shù)字PCR專用預混試劑，推薦按照不同的數(shù)字PCR儀說明書選擇。5.3引物及探針：檢測不同植物品系的引物探針序列具體信息見表1。擴增序列的信息參見附錄A。表1轉基因植物外源基因及內源基因的引物和探針序列靶標類別名稱序列玉米MON810品系特異序列外源上游引物GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGA下游引物GGATGCACTCGTTGATGTTTG探針FAM-AGATACCAAGCGGCCATGGACAACAA-BHQ1玉米MON89034品系特異序列外源上游引物TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT下游引物CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA探針FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGB玉米MIR162品系特異序列外源上游引物CACCTTCAGCAACCCGAACTA下游引物GCTTAGCCTCCACGATCATCTT探針FAM-GTCCTCGTCGCTGCCCTTCACCT-BHQ1玉米基因內源上游引物CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC下游引物CCACTCCGAGACCCTCAGTC探針VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1大豆GTS-40-3-2品系特異序列外源上游引物TAGCATCTACATATAGCTTC下游引物GACCAGGCCATTCGCCTCA探針FAM-ACAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGA-BHQ1大豆基因內源上游引物GCCCTCTACTCCACCCCCA下游引物GCCCATCTGCAAGCCTTTTT探針VIC-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1水稻克螟稻品系特異序列外源上游引物TCCGCAATGTGTATTAAGTTGTCTAA下游引物CCGATATGCCTGCCCATCT探針FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCCG-BHQ13GB／T38132—2019靶標類別名稱序列水稻基因PLD內源上游引物TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT下游引物CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC探針VIC-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1棉花GHB119品系特異序列外源上游引物CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA下游引物GAAATTGCGTGACTCAAATTCC探針FAM-CCTGCAGGTCGACGGCCGAGTAC-BHQ1棉花基因Adhc內源上游引物CACATGACTTAGCCCATCTTTGC下游引物CCCACCCTTTTTTGGTTTAGC探針FAM-TGCAGGTTTTGGTGCCACTGTGAATG-BHQ1油菜RT73品系特異序列外源上游引物CCATATTGACCATCATACTCATTGCT下游引物GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA探針FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-BHQ1油菜基因PEP內源上游引物CCCTTGTGAAGCTCGACATC下游引物CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT探針FAM-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-BHQ16儀器與設備6.1數(shù)字PCR儀。6.3生物安全柜。6.4核酸定量儀。6.5渦旋振蕩儀。移液槍量程量程量程量程7操作步驟按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。7.3DNA模板制備按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。4GB／T38132—20197.4DNA模板濃度控制采用熒光定量試劑盒或其他具有等效結果的核酸定量儀或方法測定DNA溶液的濃度，具體操作步驟參照相關儀器或試劑盒說明書。然后根據(jù)植物基因組的相對分子質量大小計算DNA的拷貝數(shù)濃度。濃度要求符合SN/T4853的規(guī)定。7.5數(shù)字PCR擴增方法7.5.1數(shù)字PCR反應體系轉基因玉米MON810品系、MON89034品系、MIR162品系，轉基因大豆GTS-40-3-2品系，轉基因水稻克螟稻品系采用雙重數(shù)字PCR反應體系見表2。轉基因棉花GHB119品系，轉基因油菜RT73品系采用單重數(shù)字PCR反應體系見表3。數(shù)字PCR反應體系的總體積可根據(jù)不同廠家、型號的數(shù)字PCR儀做相應調整，并保持各引物探針組分終濃度不變。每個DNA模板應進行3個平行數(shù)字PCR擴增反應。表2雙重數(shù)字PCR反應體系PCR反應試劑終濃度體積內源基因探針(5數(shù)字PCR預混液1×DNA模板 —表3單重數(shù)字PCR反應體系PCR反應試劑終濃度體積數(shù)字PCR預混液1×DNA模板— 7.5.2數(shù)字PCR反應程序數(shù)字PCR反應程序如表4和表5所示。5GB／T38132—2019表4微滴數(shù)字PCR的反應程序步驟時間和溫度循環(huán)數(shù)熱激活及變性1退火延伸變性酶失活1表5芯片數(shù)字PCR反應程序步驟時間和溫度循環(huán)數(shù)熱激活及變性1退火延伸變性退火延伸1注：不同芯片平臺可根據(jù)說明書對除退火延伸外步驟中的溫度和時間做相應調整。7.5.3對照數(shù)字PCR反應的設定試驗中應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。用含品系特異序列的轉基因植物品系基因組DNA做陽性對照，含相同內源基因的非轉基因植物基因組DNA做陰性對照，以水作為空白對照。各對照PCR反應體系中，除模板外，其余組分及PCR反應條件與7.5.1和7.5.2相同。8結果分析與表述根據(jù)數(shù)字PCR結果中陰性對照的終點熒光值設定閾值限，該閾值限應將同一樣品中陰性反應微小單元和陽性反應微小單元有效區(qū)分。陰性對照有內源基因擴增且陰性對照和空白對照均無外源基因擴增。擴增平行重復測試結果（轉基因品系百分含量）的相對標準偏差應小于或等于25%。以上要求其中一條不符合，應重新進行試驗，重新進行的試驗應從制備測試樣品開始。按照式（1）計算測試樣品的轉基因品系百分含量：式中：犘—轉基因植物品系的百分含量；犃—轉基因植物品系外源基因拷貝數(shù)；犅—轉基因植物內源基因拷貝數(shù)。6GB／T38132—20198.3.1檢出物種內源基因，但未檢出品系特異序列，結果表述為“樣品未檢出×品系轉基因成分。定量方法的檢測限為0.8.3.2檢出物種內源基因，同時也檢出品系特異序列，結果表述為“樣品中×品系轉基因成分的含量GB／T38132—2019附錄A（資料性附錄）轉基因植物品系特異性擴增序列A.1轉基因玉米MON810品系特異性序列GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGACCAGTGTTACTCACATAGTCTTTGCTCATTTCATTGTA.2轉基因玉米MON89034品系特異性序列ACGGTATTATAGATACCGA.3轉基因玉米MIR162品系特異性序列CACCTTCAGCAACCCGAACTACGCCAAGGTGAAGGGCAGCGACGAGGACGCCAAGATGATCGTGGAGGCTAAGCA.4轉基因大豆GTS-40-3-2品系特異性序列AGAACTGTTTGAGGCGAATGGCCTGGTCA.5轉基因水稻克螟稻品系特異性序列