GXAS-沃柑中春雷霉素、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

Q/LB.□XXXXX-XXXX前言本文件參照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由廣西分析測試協(xié)會提出、歸口并宣貫。本文件起草單位：廣西博測檢測技術(shù)服務(wù)有限公司、廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院、廣西益譜檢測技術(shù)有限公司、廣西綠保環(huán)境監(jiān)測有限公司、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢測中心、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心、百色市檢驗檢測中心、廣西眾晟生物科技有限公司、廣西東盟食品檢驗檢測中心、廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院、南寧市武鳴區(qū)經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)服務(wù)中心、橫州市綜合檢驗檢測中心、廣西工商學(xué)校、崇左市江州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、欽州市欽北區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站、鹿寨縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心。本文件主要起草人：沃柑中春雷霉素、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法范圍本文件描述了沃柑中春雷霉素、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽殘留量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。本文件適用于沃柑中春雷霉素、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽殘留量的測定。本文件方法定量限春雷霉素為0.004mg/kg，雙胍三辛烷基苯磺酸鹽為0.004mg/kg。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB2763食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。原理試樣用甲酸水溶液提取，經(jīng)HLB凈化后，分別經(jīng)SCX固相萃取柱串聯(lián)和WCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，外標(biāo)法定量。試劑和材料除另有說明外，在分析中僅使用分析純試劑和GB/T6682中規(guī)定的一級水。試劑乙腈（CH3CN，CAS號：75-05-8）：色譜純。甲醇（CH3OH，CAS號：67-56-1）：色譜純。甲酸（HCOOH，CAS號：64-18-6）：色譜純。鹽酸（HCl，CAS號：7647-01-0，純度36%~38%）。二氯甲烷（CH2Cl2，CAS號：75-09-2）：色譜純。甲酸銨（HCO2NH4，CAS號：540-69-2）：色譜純。溶液配制甲酸溶液（0.2%）：準(zhǔn)確吸取2mL甲酸，用水稀釋至1000mL，搖勻備用。乙腈水溶液（3+1）：準(zhǔn)確吸取10mL乙腈，加入用30mL水，搖勻備用。乙腈-水酸性溶液（2+1，V/V，0.1%甲酸）：取50mL乙腈，加入100mL水和0.15mL甲酸，搖勻備用。甲酸乙腈溶液（10%）：準(zhǔn)確吸取10mL甲酸，用乙腈稀釋至100mL，搖勻備用。鹽酸溶液（30mmol/L）：取0.25mL濃鹽酸，用水稀釋并定容至100mL。甲醇-氨水溶液（95+5，V/V）：取950mL甲醇，加入50mL氨水，搖勻備用。0.4%甲酸-甲酸銨（5mmol/L）水酸性溶液：稱取0.3153g甲酸銨（5.1.6）溶于100mL水，加入4mL甲酸，用水定容至1000mL搖勻，過O.22μm微孔過濾膜（有機(jī)相），現(xiàn)用現(xiàn)配。0.4%甲酸甲醇：移取4mL甲酸，用甲醇定容至1000mL搖勻，過O.22μm微孔過濾膜（有機(jī)相），現(xiàn)用現(xiàn)配。標(biāo)準(zhǔn)品春雷霉素（C14H25N3O9，CAS號：6980-18-3）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%或春雷霉素鹽酸鹽（C14H25N3O9.HCl.H2O,CAS號：200132-83-8標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥96%）。雙胍辛胺醋酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（C24H53N7O6，CAS號：57520-17-9，標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥90%）。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1000mg/L）準(zhǔn)確稱取適量的春雷霉素（或春雷霉素鹽酸鹽）標(biāo)準(zhǔn)品(5.3.1)于10mL容量瓶中，用乙腈水溶液（5.2.2）溶解并定容至刻度，0℃～4℃貯存，有效期6個月。雙胍辛胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1000mg/L）準(zhǔn)確稱取適量的雙胍辛胺醋酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品(5.3.2)于10mL塑料容量瓶中，用甲醇（5.1.2）溶解并定容至刻度，避光-20℃及以下條件保存，有效期6個月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間溶液（100μg/mL）分別取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于10mL塑料容量瓶中，用乙腈-水酸性溶液（5.2.3）定容配制成100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用乙腈-水酸性溶液（5.2.3）逐級稀釋，分別配制10μg/mL和1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，0℃～4℃貯存，有效期1個月。材料SCX固相萃取柱：500mg，6mL或相當(dāng)者。HLB固相萃取柱：500mg，6mL或相當(dāng)者。WCX固相萃取柱：500mg，3mL或相當(dāng)者。微孔過濾膜（有機(jī)相）：O.22μm或相當(dāng)者。儀器和設(shè)備液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。分析天平：感量0.1mg和感量0.01g。組織搗碎儀。渦旋振蕩儀。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4500r/min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。試樣制備試樣制備樣品取樣部位按照GB2763的規(guī)定執(zhí)行。對于個體較小的樣品，取樣后全部處理；對于個體較大的基本均勻樣品，可在對稱軸或?qū)ΨQ面上分割或切成小塊后處理；用四分法取樣或直接放入組織搗碎機(jī)中搗碎成勻漿。勻漿放入聚乙烯容器中。試樣儲存將試樣按照測試和備用分別存放。于-18℃及以下條件儲存。分析步驟提取稱取10g試樣（精確至0.01g）于50mL聚丙烯離心管中，加入10mL甲酸溶液（5.2.1），再加入5mL二氯甲烷（5.1.5），渦旋振蕩5min后，以4500r/min離心5min，用吸管吸取上層清液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中。再加入10mL甲酸溶液（5.2.1），重復(fù)提取一次，合并上清液，用甲酸溶液（5.2.1）定容。待凈化。凈化HLB柱凈化HLB柱依次用5mL甲醇（5.1.2）、5mL甲酸溶液（5.2.1）和2mL提取液預(yù)洗，棄去淋洗液，取7mL提取液過柱，接收流出液，待SCX柱和WCX固相萃取柱凈化。春雷霉素凈化（SCX柱凈化）SCX柱依次用5mL甲醇（5.1.2）、5mL水、5mL鹽酸溶液（5.2.5）預(yù)洗，棄去淋洗液。取3.0mL8.2.1凈化液過柱，待凈化液流盡，依次用5mL水、5mL甲醇（5.1.2）淋洗SCX柱，棄去流出液。用10mL甲醇-氨水溶液（5.2.6）洗脫SCX柱，并收集至15mL聚丙烯離心管中，50℃下氮氣吹干。用1mL乙腈-水酸性溶液（5.2.3）溶解殘留物，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后備用。雙胍三辛烷基苯磺酸鹽凈化（WCX柱凈化）WCX柱依次用5mL甲醇（5.1.2）和5mL水活化平衡，取3mL8.2.1凈化液過柱，待凈化液流盡，依次加入5mL水和5mL甲醇（5.1.2）淋洗小柱；再用10mL甲酸乙腈（5.2.4）洗脫WCX固相萃取柱并收集至15mL聚丙烯離心管中；于45℃水浴氮吹至近干，用1mL乙腈-水酸性溶液（5.2.3）溶解殘留物，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾入PP進(jìn)樣瓶后備用。移取分別移取0.5mL8.2.2春雷霉素凈化（SCX柱凈化）液和0.5mL8.2.3雙胍三辛烷基苯磺酸鹽凈化（WCX柱凈化）液于PP進(jìn)樣瓶，渦旋混勻供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。如果只測春雷霉素，則8.2.3和8.2.4可省略；只測雙胍三辛烷基苯磺酸鹽，則8.2.2和8.2.4可省略。測定液相色譜條件液相色譜條件如下：色譜柱：C18AQ2.1mm×100mm粒徑1.9μm或相當(dāng)者；流動相：A相為0.4%甲酸-甲酸銨（5mmol/L）水酸性溶液（5.2.7），B相為0.4%甲酸甲醇（5.2.8），流動相及其梯度條件見表1；流速：0.3mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：3μL。流動相及其梯度條件時間流動相A(%)流動相B（%）0.009553.009553.105956.005956.0195510.00955質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：離子源類型：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；電噴霧電壓：正離子4000V；離子源溫度：300℃；霧化氣壓力：0.242MPa；輔助加熱氣壓力：0.242MPa；多反應(yīng)監(jiān)測：每種農(nóng)藥分別選擇至少2個子離子。所有需要檢測的子離子按照出峰順序，分時段分別檢測。每種農(nóng)藥的保留時間、母離子、子離子及離子對質(zhì)譜參數(shù)，參見附錄A?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線空白樣品按照8.1、8.2進(jìn)行前處理得到空白基質(zhì)溶液。精確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級用空白基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.002mg/L、0.005mg/L、0.010mg/L、0.020mg/L、0.050mg/L、0.100mg/L、0.200mg/L、0.500mg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，根據(jù)儀器性能和檢測需要選擇不少于5個濃度點，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以農(nóng)藥定量用子離子的質(zhì)量色譜圖面積為縱坐標(biāo)、相對應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。定性及定量保留時間被測試樣中目標(biāo)農(nóng)藥色譜峰的保留時間與相應(yīng)i標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時間相比較.相對誤差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。離子豐度比在相同實驗條件下進(jìn)行樣品測定時.如果檢出的色譜峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)樣相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，目標(biāo)化合物選擇的子離子均出現(xiàn)，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品目標(biāo)化合物的離子豐度比與質(zhì)量濃度相當(dāng)?shù)幕|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在目標(biāo)農(nóng)藥。本文件的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)量色譜圖參見附錄B。定性時離子豐度比的最大允許偏差單位為百分比離子豐度比＞50＞20～50＞10～20≤10允許相對偏差±20±25±30±50定量外標(biāo)法定量。試樣溶液的測定將基質(zhì)匹配目標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液依次注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，保留時間和離子豐度比定性，測得定量用子離子的質(zhì)量色譜圖峰面積，待測樣液中農(nóng)藥的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的定量測定線性范圍之內(nèi)，超過線性范圍時應(yīng)根據(jù)測定濃度進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋后再進(jìn)行分析。平行試驗按以上步驟對同一試樣進(jìn)行平行試驗測定。空白試驗除不加試樣外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。結(jié)果計算試樣中各農(nóng)藥殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計，單位為毫克每千克(mg/kg)，按公式(1)或公式(2)計算。 ω=ρ1×A×V3×V1×2A ω=ρ2×V3×式中：ω—試樣中各被測物殘留量的數(shù)值，單位為毫克每千克(mg/kg)；ρ1—基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測物的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為毫克每升(mg/L)；ρ2—從基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的試樣溶液中被測物的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為毫克每升(mg/L)；A—試樣溶液中被測物的質(zhì)量色譜圖峰面積；As—基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測物的質(zhì)量色譜圖峰面積；V1—提取液的體積，單位為毫升(mL)；V2—移取凈化液的體積，單位為毫升(mL)；V3—樣液最終定容分取體積，單位為毫升(mL)；m—試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克(g)；2—稀釋倍數(shù)，如果只測春雷霉素或雙胍三辛烷基苯磺酸鹽，可省略。

（資料性）

春雷霉素、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽農(nóng)藥及其代謝物的保留時間、母離子、子離子及離子對質(zhì)譜參數(shù)春雷霉素、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽農(nóng)藥及其代謝物的保留時間、母離子、子離子及離子對質(zhì)譜參數(shù)見表A.1。春雷霉素、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽農(nóng)藥及其代謝物的保留時間、母離子、子離子及離子對質(zhì)譜參數(shù)序號農(nóng)藥中文名農(nóng)藥英文名電離方式保留時間(min)去簇電壓（V）離子對Ⅰ碰撞能(V)離子對Ⅱ碰撞能(V)1春雷霉素Kasugamycin正0.